Ssp DnaB蛋白介导的精氨酸激酶N末端和C末端结构域的表达与纯化
Smad蛋白调控角膜新生血管发生发展的研究进展
欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁氉氉氉氉引文格式:曾澳,闫语,王淑荣,张妍,何宇茜.Smad蛋白调控角膜新生血管发生发展的研究进展[J].眼科新进展,2022,42(1):75 78.doi:10.13389/j.cnki.rao.2022.0017【文献综述】Smad蛋白调控角膜新生血管发生发展的研究进展△曾 澳 闫 语 王淑荣 张 妍 何宇茜欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁氉氉氉氉作者简介:曾澳(ORCID:0000 00016268 6958),男,1999年11月出生,湖南娄底人。
主要研究方向:角膜病。
E mail:1018775029@qq.com通信作者:何宇茜(ORCID:0000 0001 5802 8063),女,1989年7月出生,吉林松原人,博士。
主要研究方向:角膜病。
E mail:heyuxihot@163.com收稿日期:2021 01 22修回日期:2021 09 30本文编辑:盛丽娜△基金项目:吉林省科技厅国际科技合作项目(编号:20200801016GH);吉林省科技厅自然科学基金(编号:20180101146JC)作者单位:130041 吉林省长春市,吉林大学第二医院眼科中心(曾澳,闫语,王淑荣,张妍,何宇茜);130021 吉林省长春市,吉林大学白求恩医学部(曾澳,闫语)【摘要】 角膜新生血管(CNV)是一种严重的致盲性病理改变,与多种眼表疾病的发生发展密切相关。
在CNV发生发展过程中,多种蛋白参与调控。
研究表明,Smad蛋白可通过多种信号通路影响CNV的发生发展。
本文就近年来Smad蛋白调控CNV发生发展的研究进展作一综述。
【关键词】 Smad蛋白;角膜新生血管;转化生长因子 β;骨形态发生蛋白;茎细胞;尖细胞【中图分类号】 R772.2角膜受到不利因素的刺激时,可通过产生角膜新生血管(CNV)来加强角膜的免疫防御功能,并且促进角膜的愈合。
细胞周期调控的研究进展(精)
细胞周期调控的研究进展高燕,林莉萍,丁健 *(中国科学院上海生命科学研究院药物研究所,国家新药研究重点实验室,中国科学院研究生院,上海 201203摘要 :细胞周期是一种非常复杂和精细的调节过程,有大量调节蛋白参与其中。
此过程的核心是细胞周期依赖性蛋白激酶 (CDKs。
CDKs 的激活又依赖于另一类呈细胞周期特异性或时相性表达的细胞周期蛋白 (cyclins,而 CDKs 调节的关键步骤是细胞周期检查点。
PLKs 是多种细胞周期检查点的主要调节因子, Aurora 蛋白激酶主要在细胞有丝分裂期起作用。
本文就上述因素在细胞周期进程中的作用作一综述。
关键词 :细胞周期;调控;细胞周期检查点中图分类号:Q253文献标识码:AA review: cell cycle regulationGAO Yan, LIN Li-Ping, DING Jian*(State Key Laboratory of Drug Research, Shanghai Institute of Materia Medica, Shanghai Instituesfor Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences, Graduate School of the ChineseAcademy of Sciences, Shanghai 201203, ChinaAbstract: The cell cycle is a complex and elaborate process involving numerous regulatory proteins as directors.Central to this process are the cyclin-dependent kinases (CDKs, which are activated in a cyclin-dependentmanner at special points of the cell cycle. Cyclin protein levels rise and fall during the cell cycle and in the waythey periodically activate CDKs. Furthermore, the cell cycle checkpoint is also discussed as a key process inthe regulation of CDKs. PLKs are important mediators for various cell cycle checkpoints, while Aurora kinaseshave emerged as essential regulators of cell division. Here, we reviewed the effects of above factors on cellcycle regulation.Key words: cell cycle; regulation; cell cycle checkpoint收稿日期 :2005-01-22; 修回日期 :2005-03-09作者简介 :高燕 (1974— ,女,博士研究生;林莉萍 (1962— ,女,博士,副研究员;丁健 (1953— ,男, 研究员,博士生导师, *通讯作者。
.蛋白质的结构与功能
三、蛋白质的三级结构(tertiary structure)
(二)氨基酸的分类
1.按R基的化学结构分为脂肪族、芳香族、杂环、杂环亚氨基酸四类 。
2.按R基的极性和在中性溶液的解离状态分为非极性氨基酸、极性不 带电荷、极性带负电荷或带正电荷的四类。 带有非极性R(烃基、甲硫基、吲哚环等,共9种):甘(Gly)、丙 (Ala)、缬(Val)、亮(Leu)、异亮(Ile)、苯丙(Phe)、甲硫 (Met)、脯(Pro)、色(Trp) 带有不可解离的极性R(羟基、巯基、酰胺基等,共6种):丝(Ser) 、苏(Thr)、天胺(Asn)、谷胺(Gln)、酪(Tyr)、半(Cys) 带有可解离的极性R基(共5种):天(Asp)、谷(Glu)、赖(Lys )、精(Arg)、组(His),前两个为酸性氨基酸,后三个是碱性氨 基酸。
(一)氨基酸的结构通式
组成蛋白质的20种氨基酸有共同的结构特点 :
1.氨基连接在α- C上,属于α-氨基酸(脯氨 酸为α-亚氨基酸)。
2.R是側链,除甘氨酸外都含手性C,有D型和L-型两种立体异构体。天然蛋白质中的 氨基酸都是L-型。
注意:构型是指分子中各原子的特定空间排布,其变化要 求共价键的断裂和重新形成。旋光性是异构体的光学活性 ,是使偏振光平面向左或向右旋转的性质,(-)表示左 旋,(+)表示右旋。构型与旋光性没有直接对应关系。
20世纪30年代末,L.Panling 和R.B.Corey应用X射线衍射分 析测定了一些氨基酸和寡肽的晶体结构,获得了一组标准 键长和键角,提出了肽单元(peptide unit)的概念, 还提出 了两种主链原子的局部空间排列的分子模型(α-螺旋)和 (β-折叠)。
人C-Src蛋白酪氨酸激酶真核表达、纯化及活性检测
人C-Src蛋白酪氨酸激酶真核表达、纯化及活性检测徐岚;肖斌;陈慧芹;李晓荣;郝文波【摘要】The objective of this work is to construct a eukaryotic expression vector for the C-Src tyrosine kinase(Csk)gene from human. Total RNA was extracted from HeLa cells. The full-length cDNA sequence of Csk gene was isolated and amplified via RT-PCR,and cloned into a eukaryotic expression vector pENTER,the recombinant pENTER-Csk-his plasmid was constructed. The recombinant plasmid was transfected into 293T cells,after 48 hours,the expression levels of Csk protein were determined by SDS-PAGE and Western blot. The localization of Csk protein was detected via indirect immunofluorescence,and the protein Csk was purified by nickel chelate beads;in addition,the activity of the protein was measured via his-pulldown and CO-IP. Results showed that:Double digestion and sequencing reveled that recombinant plasmid pENTER-Csk-his was constructed properly without mutation. Both SDS-PAGE and Western blot detected a 51 kD protein,indicating that Csk protein was expressed successfully in the 239T cells. The indirect immunofluorescence confirmed the expression of Csk protein in cytoplasm. Finally,the purified protein Csk by nickel chelate beads interacted with the IGF1R and SHC1 by his-pulldown and CO-IP. Conclusively,this study successfully acquired the full-length sequence of Csk,the eukaryotic expression vector pENTER-Csk-his was constructed,and the gene was expressed efficiently in 293T cells,moreover,the expressed protein presented bioactivity.%旨在构建人C-Src蛋白酪氨酸激酶(Csk)基因真核表达系统。
氨基酸残基的侧链修饰
生化课件整理之——氨基酸残基的侧链修饰(~~by luckyboy)一.精氨酸Arginine甲基化Methylation精氨酸的三个甲基化衍生物(Nω-methyl- Nω, N ω-dimethyl-, and Nω, Nω`,-dimethyl-)常出现于一些蛋白质当中,主要是核苷酸结合蛋白,例如:组蛋白,核仁蛋白,髓磷脂碱性蛋白,甲基化的功能还没有完全研究清楚磷酸化PhosphorylationN?-磷酸精氨酸也常出现在髓磷脂碱蛋白中,一种鼠肝DNA结合的精氨酸特异性蛋白激酶,它磷酸化它自身和一个11-kDa的染色体结合蛋白ADP-核糖基化ADP-ribosylation(有一种催化ADP 核糖基化的酶)1. Nω-ADP-核糖基化精氨酸(? and ?异头物) 常出现在细菌肠毒素、霍乱毒素和大肠杆菌不耐热肠毒素等蛋白质的修饰中2. 脊椎动物的精氨酸特异核糖基转移酶是常见的ADP-核糖基化水解酶3. 第三类精氨酸特异的核糖基转移酶是由噬菌体编码的瓜氨酸Citrulline由精氨酸残基衍生化而成,多见于头发和皮肤蛋白中。
鸟氨酸Ornithine可能也是有精氨酸衍生而来,被发现于一种洋芋中的不常见的富羟脯氨酸糖蛋白凝集素中戊糖素PentosidinePentosidine是由精氨酸残基的侧链和被氧化的糖基化的赖氨酸衍生物结合形成的二.天冬酰胺Asparagine一、糖基化Glycosylation(一)结构:其中一种最常见的细胞膜胞外区域、分泌体和溶酶体蛋白的翻译后修饰是天门冬酰胺侧链糖基化(N-连接糖基化),?-N-乙酰葡糖胺作为连接单元连接到N原子上绝大多数聚糖的结构都已经被确定,它们大多数都存在于三种结构类型:高甘露糖型、复杂型和杂合型。
在糖蛋白中发现的常见单糖部分在下图中列出:1、真核生物中A.a.移多萜酰连接的前体糖基的转移:Glc3-Man9-GlcNAc2-到序列-Asn-Xaa-(Ser或Thr)-的天冬酰胺侧链上,其中Xaa可以是除脯氨酸外的其它任何一种氨基酸b.聚糖链的依次添加成熟的过程包括去除葡萄糖单元和在大多数情况下除去甘露糖残基,紧接着添加岩藻糖、半乳糖,N-乙酰葡萄糖胺和铝硅脂酸,有时也加入其它糖类化合物、磷酸盐和硫酸盐B.,具体怎样产生特异性的精确聚糖链结构还不是很清楚:a.不是所有的胞外的Asn-Xaa-(Ser or Thr)的天门冬酰胺残基都被糖基化b.在许多糖蛋白中是不均一性的,由于一些分子携带了比其它分子更多的糖基侧链;糖基结构上一般也有微不专一性,但是一个特异性位点主要携带单一种类糖基侧链。
极光激酶A在肿瘤形成中的机制研究进展
极光激酶A在肿瘤形成中的机制研究进展翁泽安【摘要】Aurora-A(极光激酶A)是一种高度进化保守蛋白激酶,在肿瘤细胞形成过程中发挥重要的调控作用.人体多种实体肿瘤均发现Aurora-A的过表达,高表达的Aurora-A通过多种分子机制参与肿瘤的生存、增殖,而且Auro-ra-A的表达水平与肿瘤患者的药物抵抗和不良预后呈正相关.本文介绍了Aurora-A的结构和亚细胞定位、活化和降解的具体途径,本文着重阐述Aurora-A促进肿瘤形成的分子机制,从而为肿瘤的药物治疗提供新的治疗靶点.【期刊名称】《湖北民族学院学报(医学版)》【年(卷),期】2017(034)004【总页数】5页(P65-68,71)【关键词】Aurora-A;蛋白激酶;肿瘤形成【作者】翁泽安【作者单位】三峡大学人民医院宜昌市第一人民医院湖北宜昌443000【正文语种】中文【中图分类】R737.33极光激酶A(Aurora-A)是高度进化保守的丝/ 苏氨酸蛋白激酶家族中的一员,在细胞有丝分裂和肿瘤形成过程中发挥重要的调控作用。
Aurora激酶是在研究果蝇过程中首次被发现[1],目前研究证实,在哺乳动物的细胞中,至少存在Aurora-A、Aurora-B、Aurora-C三种Aurora激酶[2]。
前期研究证实,Aurora-A在细胞有丝分裂过程中发挥关键的作用。
Aurora-A主要调控中心体和微管的功能,主要涉及中心体的复制和分离,纺锤体的组装,染色质的凝聚,G2-M期的转换以及细胞质的分裂[3]。
下调Aurora-A的表达可导致纺锤体组装和染色体分离的障碍,最终导致基因的不稳定和肿瘤形成[4]。
在机体多种肿瘤中均发现Aurora-A的过表达,如乳腺癌,胃癌,卵巢癌,食管癌,结肠直肠癌等,这暗示Aurora-A可能在肿瘤形成中发挥重要作用。
Aurora-A的过表达可能和肿瘤患者的不良预后有关,因此有可能成为新的治疗靶点[5]。
本文从Aurora-A的结构和亚细胞定位,Aurora-A活化和降解的调节等方面就Aurora-A在肿瘤细胞的表达和促进肿瘤形成的途径进行综述。
备课素材:组蛋白修饰-高一下学期生物人教版必修2
组蛋白修饰2019版高中生物学必修二说,DNA组蛋白修饰也会影响基因的表达:那么,什么是组蛋白修饰?如何影响基因的表达?天然的DNA分子很长,尤其是在真核生物中,例如人类的DNA长度为2m(Bloom et al., 2010)。
将如此庞大的遗传信息放入7μm 左右的细胞核中,就需要将长DNA分子包装成更紧凑、更致密的高度压缩结构。
这个结构叫做染色体,染色体是染色质高度螺旋后的形态。
染色质的基本组成结构单位是核小体,因此参与核小体装配的组蛋白是决定染色质包装程度的重要因素之一。
图1 核小体结构。
简单来说,核小体由H2B、H2A、H3、H4四种组蛋白(Histone)亚基各两个拷贝形成的八聚体和缠绕在外约146bp的DNA组成(图1)。
其中组蛋白N端(尾部)的氨基酸残基易受到翻译后修饰(PTM),包括乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化等组蛋白修饰(图2)(Kouzarides et al., 2007)。
近年来随着检测技术的进一步成熟,发现组蛋白的中间肽段位置以及C端也会被特异性修饰。
这些修饰以不同的方式影响染色质的紧密度和可及性,从而影响基因的表达,最终影响生物各方面的生理和发育过程,是真核生物调节基因表达最重要的表观遗传调控方式之一(Lawrence et al., 2016)。
由于组蛋白修饰的类型众多,回顾一下组蛋白修饰的描述规则:组蛋白结构+氨基酸名称+氨基酸位置+修饰类型。
例如:H3K4ac代表H3组蛋白的第4位赖氨酸的乙酰化;H2AK119ub1代表H2A组蛋白的第199位赖氨酸的单泛素化。
图2 显示组蛋白尾部翻译后修饰的示意图(Lawrence et al., 2016)。
数字显示每个修饰的位置,字母表示每个修饰位点的氨基酸(K=赖氨酸,R=精氨酸,S=丝氨酸,T=苏氨酸)。
颜色展示了每个氨基酸残基具体的修饰类型(绿色=甲基化,粉色=乙酰化,绿松石=磷酸化,米色=泛素化)。
组蛋白修饰是目前生命科学研究的热点。
焦亡在肿瘤治疗中作用的研究进展
在乳腺 癌 (breastcancer,BC)中,GSDME表 达 水 平 与 雌 激素受体(estrogenreceptor,ER)状态密切相关,ER阳性的乳 腺癌细胞往往表现为 GSDME基因的高甲基化并且与 BC淋 巴结转移正相关[18-19]。但最近有研究报道,ER阳性的MCF-7 乳腺癌细胞中仍具有较高水平的 GSDME表达,敲减 GSDME 可以显著抑 制 MCF-7细 胞 焦 亡 并 降 低 其 对 PTX的 敏 感 性[20]。二十二碳六烯酸(docosahexaenoicacid,DHA)是一种
超过 90%的宫颈癌(cervicalcancer,CC)与人类乳头瘤 病毒(humanpapillomavirus,HPV)感染有关。在感染 HPV的 CC细胞中,AIM2通 过 促 进 焦 亡 来 发 挥 抑 癌 作 用[24]。 丹 参 酮ⅡA是激活 HeLa细胞焦亡的重要因子。经丹参酮ⅡA处 理后,HeLa细胞中 GSDMD、miR-145、IL-18及 IL-1β的 表达均增加,敲减 miR-145后,丹参酮ⅡA诱导的 HeLa细 胞焦亡减少,表明在 HeLa细胞中,丹参酮ⅡA可通过调节 miR-145/GSDMD信号通路促进细胞焦亡 。 [25] 3.4 焦亡与消化系统肿瘤
此外,其他一些 Caspases也可以诱导焦亡。在鼠巨噬细 胞中,致病性耶尔森氏菌通过 YopJ途径抑制有丝分裂原激 活的蛋白 激 酶 (mitogen-activatedproteinkinases,MAPK)和 转化生长因子激酶 1(TGF-activatedkinase1,TAK1),活化 的 Caspase-8可切割 GSDMD和 GSDME,从而诱导焦亡。人 外周血单核细胞来源的巨噬细胞中,5z7可抑制 TAK1的表 达,阻断 LPS诱导的 IL-1β活化,使得 Caspase-8活化并切 割 GSDME诱导 细 胞 死 亡,这 个 过 程 没 有 GSDMD的 参 与。 表明人巨噬细胞中的生存因子能绕过 TAK1抑制,诱导的细 胞死亡比鼠巨噬细胞中少[4]。 3 焦亡在肿瘤治疗中的意义
名词解释
DNA甲基化的主要形式5-甲基胞嘧啶,N6-甲基腺嘌呤和7-甲基鸟嘌呤.在真核生物中,5-甲基胞嘧啶主要出现在CpG和CpXpG中,原核生物中CCA/TGG和GATC也常被甲基化.真核生物细胞内存在两种甲基化酶活性:一种被称为日常型(mainte-nance)甲基转移酶,另一种是从头合成(denovo synthesis)甲基转移酶.前者主要在甲基化母链(模板链)指导下使处于半甲基化的DNA双链分子上与甲基胞嘧啶相对应的胞嘧啶甲基化.日常型甲基转移酶常常与DNA内切酶活性相耦联,有3种类型.II类酶活性包括内切酶和甲基化酶两种成分,而I类和III 类都是双功能酶,既能将半甲基化DNA甲基化,又能降解外源无甲基化DNA.由于甲基化胞嘧啶极易在进化中丢失,所以,高等真核生物中CG序列远远低于其理论值.哺乳类基因组中约存在4万个CG islands,大多位于转录单元的5'区.没有甲基化的胞嘧啶发生脱氨基作用,就可能被氧化成为U,被DNA修复系统所识别和切除,恢复成C.已经甲基化的胞嘧啶发生脱氨基作用, 它就变为T, 无法被区分.因此, CpG序列极易丢失.结构基因含有很多CPG 结构, 2CPG 和2GPC中两个胞嘧啶的5 位碳原子通常被甲基化, 且两个甲基集团在DNA 双链大沟中呈特定三维结构。
基因组中60%~90% 的CPG 都被甲基化, 未甲基化的CPG 成簇地组成CPG 岛, 位于结构基因启动子的核心序列和转录起始点。
有实验证明超甲基化阻遏转录的进行。
DNA 甲基化可引起基因组中相应区域染色质结构变化, 使DNA 失去核酶ö限制性内切酶的切割位点, 以及DNA 酶的敏感位点, 使染色质高度螺旋化, 凝缩成团, 失去转录活性。
5 位C 甲基化的胞嘧啶脱氨基生成胸腺嘧啶, 由此可能导致基因置换突变, 发生碱基错配: T2G, 如果在细胞分裂过程中不被纠正,就会诱发遗传病或癌症, 而且, 生物体甲基化的方式是稳定的, 可遗传的。
PKA和PKC的分子结构和作用机制
PKA和PKC的分子结构和作用机制王建沅宁波大学摘要:蛋白激酶PKA和PKC是G蛋白耦联受体所介导的细胞信号通路中的重要的信号转导因子,参与多种细胞功能活动的调节,在细胞通讯中发挥着不可替代的作用。
本文主要论述了PKA和PKC的分子结构特征以及在信号转导过程中的作用机制。
关键词:细胞通讯;PKA;PKC;分子结构;作用机制The Molecular Structure and Mechanism of PKA and PKCAbstract: protein kinase PKA and PKC are important signal transduction factors participating in cell signaling pathways mediated by G protein, involve a variety of cellular functional activities and play an irreplaceable role in cell communication。
This paper mainly discussed the molecular structure characteristics and the mechanism of PKA and PKC in signal transduction .Key words:Cell communication; PKA; PKC; Molecular structure; Mechanism of action1 引言蛋白激酶可以通过使其他蛋白发生磷酸化作用而改变它们的活性,生物信号在细胞内传递的基本和主要方式就是蛋白激酶和蛋白磷酸酶催化的蛋白质磷酸化和去磷酸化(即“可逆蛋白质磷酸化作用”)[1]。
简单地说,蛋白激酶在细胞中起到了“开关”的作用,通过磷酸化控制某些蛋白质的活性,调控细胞信号的传导和功能活性的发挥。
nac转录因子综述[整理版]
NAC转录因子概述摘要:基因表达的转录调控在植物适应环境和抵御逆境胁迫中起重要作用。
转录因子是一类调节基因表达水平上的重要调控基因, 通过与靶标基因启动子中特定的DNA序列结合, 激活或抑制靶标基因的转录表达。
NAC转录因子是近些年来发现的陆生植物特有的转录调控因子,其数目众多,构成了一个庞大的转录因子家族。
NAC家族的命名源于矮牵牛的NAM,拟南芥的ATAF1、ATAF2及CUC2[1]。
通过多种植物的全基因组辅助调查,目前已经确认了拟南芥中有117种NAC基因、水稻151种、葡萄79种、杨树163种、大豆和烟草中各152种。
其N端含有高度保守的约150个氨基酸的NAC结构域,在植物的生长发育、器官建成、逆境胁迫以及作物的品质改良中具有重要作用。
本文主要就其基本结构特征、功能(尤其是在非生物胁迫中的功能)、表达调控及最近的研究进展进行了综述。
关键词:NAC转录因子、结构、非生物胁迫、功能、表达调控1.NAC转录因子的结构特点及分类NAC转录因子最显著的结构特点是其编码蛋白的N末端具有一个高度保守的约150个氨基酸的NAC结构域[2]。
它是NAC转录因子的DNA结合结构域,典型的NAC 域可被分为5个子域(A,B,C,D,E)。
子域A、C和D高度保守,其中C和D带有正电荷,包含有核定位信号,与DNA结合有关,可能还参与NAC转录因子与特定的启动子元件的识别过程;A可能参与了一个功能二聚体的形成;子域B和E比较多变,可能是NAC基因功能多样性的原因之一[3]。
ANAC019的NAC域结构已经通过X-射线晶体学确定了,其NAC域缺乏一个典型的螺旋—转—螺旋结构,取而代之的是一种新的转录因子折叠结构, 即由几个螺旋环绕一个反向平行的β-折叠。
NAC结构域不含有任何已知的结合DNA基序, 但可通过一些作用如盐桥形成有功能的NAC蛋白同源或异源二聚体, 此种二聚体可能与DNA的结合有关。
NAC转录因子的C末端具有高度多样性,是它的转录激活功能区。
sPD-L1蛋白原核表达、纯化及鉴定
第34卷 第11期Vol.34 No.11重庆理工大学学报(自然科学)JournalofChongqingUniversityofTechnology(NaturalScience)2020年11月Nov.2020 收稿日期:2019-10-20基金项目:重庆市教委科学技术研究项目(KJZD K201901101);重庆理工大学研究生创新项目(ycx20192068)作者简介:鲁友铭,男,博士,教授,主要从事疫苗与诊断试剂研究,E mail:741120178@qq.com;通讯作者吴胜昔,男,博士,教授,主要从事疫苗与诊断试剂研究,E mail:259212331@qq.com。
doi:10.3969/j.issn.1674-8425(z).2020.11.027本文引用格式:鲁友铭,吴胜昔,侯力嘉,等.sPD L1蛋白原核表达、纯化及鉴定[J].重庆理工大学学报(自然科学),2020,34(11):199-206.Citationformat:LUYouming,WUShengxi,HOULijia,etal.ProkaryoticExpression,PurificationandIdentificationofsPD L1Protein[J].JournalofChongqingUniversityofTechnology(NaturalScience),2020,34(11):199-206.sPD L1蛋白原核表达、纯化及鉴定鲁友铭,吴胜昔,侯力嘉,王桂玲,马培杰,卢琬薪(重庆理工大学药学与生物工程学院,重庆 400054)摘 要:为实现人可溶性程序性死亡因子配体1(solubleprogrammeddeathligand 1,sPD L1)在原核表达系统的高效表达,根据GenBank发表的sPD L1(GenBank登录号:AY254342.1)基因序列,在不改变sPD L蛋白氨基酸序列的情况下,根据大肠杆菌密码子偏好性优化基因序列,化学合成PD L1胞外域基因全长序列,克隆至质粒载体pET28a(+),转化至大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)进行诱导表达,利用镍柱对目的蛋白进行纯化。
罗米地辛类抗癌药物的生物合成
罗米地辛类抗癌药物的生物合成童甜甜;云轩;程义强;邓子新;朱冬青【摘要】罗米地辛(又称FK228)是紫色色杆菌中非核糖体肽合酶(NRPS)和I 型聚酮合酶(PKS)催化合成的一种缩酚酸肽类天然产物,具有组蛋白脱乙酰基酶抑制剂活性,现被用于皮肤T细胞淋巴瘤和外周T细胞淋巴瘤的临床治疗。
我们对已发现的罗米地辛类天然产物的化学结构,生物合成基因簇和生物合成途径的研究现状进行了总结,在此基础上初步探讨了通过基因组挖掘和组合生物合成等生物学手段获取新的罗米地辛类天然产物的可能性。
【期刊名称】《药学研究》【年(卷),期】2017(036)012【总页数】7页(P683-688)【关键词】罗米地辛组蛋白脱乙酰基酶抑制剂生物合成基因簇基因组挖掘组合生物合成【作者】童甜甜;云轩;程义强;邓子新;朱冬青【作者单位】[1]武汉大学药学院,组合生物合成与新药发现教育部重点实验室,湖北武汉430071;;[1]武汉大学药学院,组合生物合成与新药发现教育部重点实验室,湖北武汉430071;;[1]武汉大学药学院,组合生物合成与新药发现教育部重点实验室,湖北武汉430071;[2]北德克萨斯大学健康科学中心大学药学UNT系统学院,美国德克萨斯76107;;[1]武汉大学药学院,组合生物合成与新药发现教育部重点实验室,湖北武汉430071;;[1]武汉大学药学院,组合生物合成与新药发现教育部重点实验室,湖北武汉430071【正文语种】中文【中图分类】R979.1表观遗传失调在癌症发生中起到至关重要的作用。
组蛋白乙酰化修饰属于表观遗传的一种,由组蛋白乙酰基转移酶(HAT)和组蛋白脱乙酰基酶(HDAC)所控制[1]。
组蛋白一些亚基的尾巴上含有带有正电荷的赖氨酸残基,结合在带有负电荷的DNA 骨架上以及其他核小体上,形成紧密的结构,基因处于沉默状态。
HAT将赖氨酸乙酰化,正电荷丧失而失去结合能力,染色体结构变松散,导致相应基因开始有机会转录表达。
融合蛋白标签
在蛋白质功能及结构研究过程中,研究的首要任务就是利用多种方法获得纯化的具有完整结构及生物学功能并能够正确折叠的高度纯化蛋白质。
除了蛋白质的研究,具有特定生物活性的高价值蛋白质的生产也需要对蛋白质产品进行纯化。
因此,科研人员和工业生产往往大量采用多种多样的表达系统来获得高表达的蛋白质,对其纯化后进行研究或加工,这些表达系统包括原核表达系统、酵母菌表达系统、昆虫动物细胞表达系统、真核细胞表达系统等。
如何将系统中表达的目标蛋白质与其他蛋白分离,一直是表达纯化中的一个重点。
为了克服从复杂样品中纯化单一蛋白质这种困难,科学家利用生物物质,特别是酶和抗体等蛋白质,具有识别某种特定物质并与该物质分子特异性结合的能力,利用生物分子间的这种特异性结合能力而形成的亲和纯化技术。
亲和标签纯化技术已广泛应用于蛋白质,特别是重组蛋白的分离纯化中。
在重组蛋白的亲和纯化中,利用基因工程技术,将经过改造优化的亲和标签与目标蛋白融合表达,通过一步简单快速的亲和层析,直接获得纯度较高的重组融合蛋白,已成为重组蛋白纯化的一个通用方法,具有结合特异性高、纯化步骤简便、纯化条件温和、适用性广泛等优点,为蛋白质的有效纯化提供了一条解决的途径,广泛应用于蛋白质结构与功能的研究及重组蛋白纯化工艺的开发中。
自从20世纪70年代中期融合标签技术出现以来,亲和标签已成为一种重组蛋白纯化十分有效的工具,具有结合特异性高、纯化条件温和、纯化步骤简便、适用性广泛等显著优势。
通常,亲和标签定义为对特定的生物或化学配基具有高度亲和力的一段氨基酸序列。
到目前为止,已经出现了种类众多、功能各异、用途多样的亲和标签,极大地促进了对重组蛋白的有效纯化。
根据自身分子量大小的不同,亲和标签可以分为两大类:一类是结合固定化配基的短肽标签,如His-tag、FLAG-tag、Strep-tagⅡ等;另一类是识别小分子配基的蛋白标签,如GST、MBP等。
短肽标签:His-tag:His标签是目前高通量蛋白纯化最普遍使用的亲和标签,广泛用于多种重组蛋白在各种表达系统的表达与纯化中。
蛋白质的结构与功能
天冬酰胺 asparagine Asn N
谷氨酰胺 glutamine Gln Q
苏氨酸 threonine Thr T
(三)酸性氨基酸
结构式
HOOCCH2—︱CHCOO+NH3
中文名
英文名
缩写
天冬氨酸 aspartic acid Asp D
HOOCCH2CH2—︱CHCOO+NH3
谷氨酸
2) 肽键与肽链 1) 一级结构概念 2. 蛋白质的结构 2) 二级结构—螺旋 3) 三级和四级结构概念
1) 蛋白质一级结构与功能的关系 3. 蛋白质结构与功能的关系
2) 蛋白质高级结构与功能的关系 4. 蛋白质的理化性质蛋白质变性
什么是蛋白质?
蛋白质 (protein) 是由许多氨基酸 (amino acids) 通过肽键 (peptide bond) 相连形成的高分子含氮 化合物。
‖ H—C—R + NH3 + CO2 +
O ‖
H
‖ O OH
O ‖
‖O
氨基酸 茚三酮
O
‖
H ‖ O OH
+
NH3 +
O ‖ OH
‖ O OH
还原型茚三酮
O ‖
—N=
‖O
+ 3H2O
蓝紫色化合物
氨基酸与茚三酮水合物共热,可生成蓝紫色化合物,于570nm处有吸收峰。 由于此吸收峰值与氨基酸的含量存在正比关系,因此可作为氨基酸定量分析 方法。
3. 氧化供能
第一节 蛋白质的分子组成 第二节 蛋白质的分子结构 第三节 蛋白质结构与功能的关系 第四节 蛋白质的理化性质 第五节 蛋白质的分离、纯化与结构分析
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性,平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益,请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间:9:00-18:30)。
图8 融合蛋白经 PH6.0-7.5,25℃ 处理后的聚丙烯酰胺凝胶电泳图
结果分析 实验结果表明: 1. 通过图1至图5可知,精氨酸激酶N末端 和C末端结构域基因已经位于pET-28a 载体质粒上,等待测序结果,载体的 构建工作已经基本完成。 2. 通过图6测序结果可知,精氨酸激酶N 端结构域载体已确定构建完成。 3. 通过图7至图8可知,虽然获得了N端结 构域,但是浓度较低,需要进一步摸 索条件,以获得浓度较高的N端结构域。 C端结构域载体构建工作还未完成。
1.3 研究意义
蛋白质折叠问题的研究具有重要的生物学意义: 一是可以大大加快对蛋白质空间结构的认识;二是能对恢 复无活性蛋白质的活性起到很好的指导作用;三是能指导 新药物、新蛋白的研制;四是能帮助认识相关疾病的治病 机理,并为寻找有效的治病方法提供理论指导。 精氨酸激酶的折叠机制还尚未完全阐明,本课题通过对精 氨酸激酶两个结构域的折叠机制进行研究,进一步阐明精 氨酸激酶的整个折叠过程,有利于更深刻地掌握精氨酸激 酶结构、性质以及功能之间的相互关系,对了解一般蛋白 质折叠机制具有重要的借鉴意义。
From Genfa Zhou
AK的N端结构域与C端结构域在折叠的过程中的相互 关系到目前还没有明确的论述,两个结构域在各自折 叠时折叠的先后顺序,有无相互作用,以及作用的机 制,是本文的研究目标。
1.2 蛋白质内含子简介 1.2 Ssp DnaB 蛋白质内含子简介
蛋白质内含子(intein)是一类具有自我剪切功能的 多肽,它能将自身从前体蛋白中切出并催化其两 侧的肽链之间形成肽键。 Ssp DnaB是一种小型蛋白质内含子。近年来越来 越多地被应用于多肽融合标签技术以获取小肽药 物(如 人脑纳素、抗病毒多肽、抗肿瘤多肽)。 该方法成本低、效率高,无需采用蛋白水解酶或 化学水解试剂就可得到传统方法难以获得的小型 蛋白质或多肽。
4.后续实验展望
1.优化纯化条件,获取较纯的N-domain和C-domain。 2.研究两个结构域可能的折叠机制,利用内源荧光、 ANS荧光以及紫外差谱等的检测,观察精氨酸激酶N 末端结构域和C末端结构域单独在脲溶液处理下的变 性与复性过程,以及同时变性与复性的过程。 3.提出可能的相互作用的折叠机制。
M 1 2 3
1:质粒pTWIN1 2:质粒pTWIN1经 SapI/PstI 双酶切 3:质粒pTWIN1经 SapI/BamHI 双酶切
1 2 3
图 2 载体质粒pTWIN1经双酶切后的的琼脂糖凝胶电泳
AK-N UP :GGTGCTCTTCCAACATGGCTGACGCTGCTGTTA SapI AK-N Down:GGTCTGCAGTTAGGTCTGCTTGAAGCCAACATG PstI AK-C UP :GGTGCTCTTCCAACGACAAGCACCCCAACAA SapI AK-C Down:CGCGGATCCTTACATCTCCTTCTCAATCTTGATG BamHI
Ssp DnaB蛋白介导的精氨酸激酶N末端 和C末端结构域的表达与纯化
主要内容
1. 背景介绍
2. 实验设计思路 3. 实验结果与分析
4. 后续实验展望
1.1 精氨酸激酶简介
From Genfa Zhou
精氨酸激酶(AK)是无脊椎动物能量代谢中的一种重要磷酸激 酶,它能够催化ATP的产生,是由一个小的α-螺旋组成的N端结构 域和一个大的C端结构域组成。C端结构域为8股反平行β-折叠被7 个α-螺旋包绕着。精氨酸激酶的结合部位主要位于C端结构域, 活性催化部位则全部位于C端结构域。
1000bp
500bp
1:载体质粒pET-28a 2:质粒pTWIN1/N-terminus 3:质粒pTWIN1/C-terminus 图4 质粒pET-28a、pTWIN1/N-terminus和 pTWIN1/C-terminus经过NdeI/BamHI双酶切后 的琼脂糖凝胶电泳
M
1
2
3
500bp 300bp
3. 实验结果与分析
AK-N UP :GGTGCTCTTCCAACATGGCTGACGCTGCTGTTA SapI AK-N Down:GGTCTGCAGTTAGGTCTGCTTGAAGCCAACATG PstI AK-C UP :GGTGCTCTTCCAACGACAAGCACCCCAACAA SapI AK-C Down:CGCGGATCCTTACATCTCCTTCTCAATCTTGATG BamHI
N端PCR条件: C端PCR条件: 变性:94℃ 变性:94 ℃ 退火:57℃ 退火:60 ℃ 延伸:72℃ 延伸:72 ℃ 循环次数:35 循环次数: 35
900bp 700bp 500bp 300bp
1:以AK基因为模板经PCR扩增得到的N端产物 2:以AK基因为模板经PCR扩增得到的C端产物 3:水对照 图 1 以AK基因为模板形成的PCR产物的琼脂糖凝胶电泳
LOGO
衷心感谢潘继承老师、汪劲 松老师对本小组的精心指导! 衷心感谢石玉林师兄对本小 组的大力支持!
2.实验设计思路
由于AK的两个结构域尤其是N端多肽难以用常规的 诱导表达方法得到,并且疏水性较强,因此本课题 采用融合蛋白表达的方法获得目的蛋白,利用蛋白 质内含子自我剪切的特性,可以不借助任何内切酶 而得到AK的N端和C端,进而分别研究N端和C端的 独立折叠以及相互作用的机制。
整 体 思 路 图 解
M
1
2
图5 以质粒pET-28a/N-terminus为模板形成的PCR产物的琼脂糖凝胶电泳
图6 测序结果
116.0KD
66.2KD
45.0KD 35.0KD
25.0KD
18.4KD 14.4KD
图7 经过Ni亲和层析柱纯化得到的融合蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳图
43KD 31KD
Hale Waihona Puke 10KD900bp 700bp 500bp 300bp
1:以 pTWIN1/N-terminus为模板 2:以 pTWIN1/C-terminus为模板 3:水对照
M
1
2
3
图3 以质粒pTWIN1/N-terminus和质粒pTWIN1/C-terminus 为模板形成的PCR产物的琼脂糖凝胶电泳
8000bp 6000bp 5000bp 3000bp