紫杉醇的研究进展
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6/23/2014
展 望
6/23/2014
• 随着紫杉醇生物合成途径的研究，充分应 用现代生物技术，对能够产生紫杉醇的微 生物进行遗传改造，构建优质高产的工程 菌并优化其发酵条件，是提高紫杉醇产量 最有效，也是必然的途径。实现紫杉醇的 微生物发酵生产，从而解决紫杉醇的药源 问题，改善市场上紫杉醇价格昂贵，供不 应求的现状，保护濒临灭绝的珍稀红豆杉 树种。
6/23/2014
半化学合成
• 紫杉醇半合成法是以红豆杉属植物中(以枝叶为主) 提取分离的10-乙酰基巴卡亭Ⅲ和巴卡亭Ⅲ等紫杉 烷类二萜化合物为前体 , 通过选择性保护羟基 , 然 后在C-13羟基上接上合成的侧链,再去掉保护基团 得到紫杉醇。 • 由于10-乙酰基巴卡亭Ⅲ和巴卡亭Ⅲ在红豆杉属植 物枝叶中含量高达0 · 1% 以上, 为紫杉醇含量的 10 倍以上,加之红豆杉枝叶生物量大,再生能力强,半 合成紫杉醇的原料是很丰富的。
6/23/2014
• 但是，南方红豆杉的愈伤状态分为 2 种类型：（1 ） 颜色浅，生长快，高度分散的愈伤组织系；（2） 颜色深，生长慢，呈块状愈伤组织。茎段培养的 愈伤为第1种，长势快；而叶片培养的愈伤则为第 2 种，长势很慢。但是，有研究表明，第 2 类愈伤 组织能大量产生紫杉醇，因此对叶片愈伤的研究 不因长势缓慢而忽视。
6/23/2014
• 张昕欣等（ 2012 ）考察了植物内生细菌欧文氏菌 生产紫杉醇的摇瓶发酵和 30 L罐发酵工艺条件。 结果显示，培养基中添加不同的前体对紫杉醇产 量影响显著。较高浓度的乙酸钠(>0.01 mmol/L ) 和较低浓度的苯丙氨酸(<0.05 mmol/L )有利于紫 杉醇积累。在此基础上进行了 30 L 罐发酵试验， 得优化培养基配方 ( g/L )：大豆蛋白胨 20，工 业酵母抽提物5，氯化钠0.5，氯化钾0.1，葡萄糖 4，氯化镁1，乙酸钠0.1，苯丙氨酸5×10- 4；pH 6.5 。发酵培养条件：接种量 5 ％，发酵温度 22 ℃，通气速率0.17 vvm ，转速50 r/min，发酵时 间60 h 。在此条件下，30 L 发酵罐中紫杉醇的 产量102μ g/L。
6/23/2014
细胞培养
• 红豆杉科植物细胞培养生产紫杉醇较为有产业前 景和优势的方法。 • 主要从三个方面来进行研究： 1、筛选出了诱导愈伤组织的最佳外植体 2、优化了诱导愈伤组织的培养基 3、寻找了解决褐化问题的方法
6/23/2014
• 于等（2012 ）研究了不同外植体、不同外源激素、 不同光照条件对南方红豆杉愈伤组织诱导的影响。 • 结果表明：1）茎段是诱导红豆杉愈伤组织的最佳 外植体，出愈时间快，愈伤组织黄绿色，质地疏 松；而叶片则出愈时间慢，愈伤组织黄白色，质 地密。 2 ） 2,4-D 与 NAA 的协同促进作用明显，当 2,4-D/NAA 为1/5时，诱导效果最好，而比值较大 时不利于愈伤的诱导。3）黑暗培养能够明显促进 愈伤组织发生，褐化现象减轻。
6/23/2014
• 凡丽（ 2012 ）研究以南方红豆杉优良植株为材料， 首先筛选诱导愈伤组织的外植体，然后优化诱导 愈伤组织的培养基，接着寻求解决褐化问题的方 法，最后优化产紫杉醇的条件。 • 结果：1、不带叶茎段外植体诱导愈伤组织效果最 好的外植体。 2 、 以不带叶莲段和成熟胚为外植体，用 得到的较佳组合作为培养基，通过单因素试验研 究结果表明向培养基中添加水解酪蛋白是缓解褐 化的较好方法。
6/23/wk.baidu.com014
• 代文亮等（2008）研究了一株内生真菌Ｆusarium mairei UH23发酵产紫杉醇的工艺条件。实验结果 表明最佳培养条件为：温度 26 ℃，发酵起始pH 值 7.0,接种量5％，装液量250ml三角瓶装液60 ml， 发酵周期 12 ｄ。筛选出最佳碳源为葡萄糖，最佳 氮源为硝酸铵。在上述条件下发酵，紫杉醇产量 达（286.4±20.3）μ ｇ/L，较优化前提高10.2％。
6/23/2014
• 靳瑞等（2011）从分离到的420株内生真菌中筛选 到一株产紫杉醇的内生真菌XC1-07 实验材料进行 发酵条件的初步优化。结果表明：最适碳源、氮 源分别是麦芽糖和 NH 4 NO 3 ；在含 10g/l NH 4 NO 3 、 90g/ 麦芽糖、 1.0 g/l MgSO ４ 、 pH 6 的优化培养 基中培养3ｄ,紫杉醇的产量为1124.34 μ g/l。为 目前报道的植物内生真菌发酵生产紫杉醇最高的 产量。
6/23/2014
•
3、南方红豆杉细胞悬浮培养体系中最适合细 胞生长的初始糖浓度为30%。整个悬浮培养过程， 细胞的生长曲线呈“ S ”型；细胞的生长周期为 30d; 在稳定期测得细胞中和悬浮培养液中累积的 紫杉醇总含量13.0μ g/mL;在显微镜下观察到南方 红豆杉的细胞多数呈圆形或椭圆形。 • 4、不带叶茎段在B5培养基上生长较好，且诱 导愈伤组织的较好培养基组合为：B5+NAA 1.0mg/L+6-BA 0.5mg/L;而成熟胚在1/2WPMSH培养 基上生长较好，它诱导愈伤组织的较佳培养基组 合是：1/2WPMSH +2,4-D1.5mg/L+6-BA O.5mg/L。
6/23/2014
化学结构
5β，20-环氧-1,2α，4,7β，10β，13α-六羟基紫杉烷-11-烯-9-酮-4,10-二乙 酸酯-2-苯甲酸酯-13[(2'R,3'S)-N-苯甲酰-3-苯基异丝氨酸酯]
6/23/2014
抗癌原理
• 紫杉醇具有独特的微管活性,具有多种抗肿 瘤作用 , 它能与微管蛋白质结合 , 形成稳定 的稳管束 , 并使其被解聚 , 微管是真核细胞 的一种纤维蛋白 ,与细胞的有丝分裂紧密相 关 , 对于迅速分裂的肿瘤细胞 , 将癌细胞停 止在G2晚期或M期,抑制细胞复制,阻止癌细 胞Z增殖，从而起到抗癌的作用。
6/23/2014
化学合成
• 紫杉醇本身具有及其复杂的化学结构，化学合成 方法获得具有很大的难度，但是由于其有效的抗 癌功能和提取所需原料的短缺，因此历来也为众 多化学研究人员所热衷。但是迄今为止，紫杉醇 的全合成尚未成功，其中较大障碍是环氧丙烷环 的合成。 • 这种方法因为成本高，反应过程比较复杂且效率 比较低，目前没有应用于工业中。
6/23/2014
紫杉醇药源的研究进展
6/23/2014
使用的方法分类
• • • • • 植物提取 化学合成 半化学合成 细胞培养 微生物发酵生成
6/23/2014
植物提取
• 紫杉醇的提取的传统方法为乙醇、甲醇或甲醇和 二氯甲烷混合溶剂提取。 • 最新的方法有超临界液相色谱法提取，提取溶剂 为 CO 2 或 CO 2 /EtOH ，温度 45 ℃ , 压力 18.0 ～ 25.8 Mpa,效果较传统方法稍优。 • 因为是红豆杉的皮中提取的，红豆杉是国家一级 保护植物，目前解决紫杉醇原料短缺的主要途径 是规模化、集约化营造红豆杉人工原料林。
6/23/2014
• 张芳芳等(2010)人选用了 3 种类型的南方红豆杉 外植体： 1. 去除了外种皮的成熟种子，在无菌滤 纸上将胚剥离；2.茎段，切成 0.5～1.5 cm 长的 小段；3. 侧芽，先剥去少数外鳞，再用剪刀稍稍 减碎。他们将上述外植体接种到添加了 2,4-D 的 MS 培养基上，结果发现，种胚的诱导率较高且愈 伤组织的污染率较低。
• 紫杉醇被称为 21 世纪最有开发价值的植物 来源的抗癌药，是继阿霉素、顺铂之后疗 效最好、副作用最小的药物。紫杉醇也因 此成为新一代抗癌药物的代表，被誉为植 物黄金”，红豆杉也因此成为“轰动世界 的药用植物”。 • 它是现阶段唯一可以控制癌细胞生长的植 物药物。
6/23/2014
• 紫杉醇是从红豆杉科红豆杉属植物短叶中 红豆杉 中分离出的一种具有独特结构的二 萜类成分，它的骨架三环萜，被命名为紫 杉烷。 • 紫杉醇主要用于治疗卵巢癌和乳腺癌、对 肺癌、大肠癌、黑色素瘤、头颈部癌、淋 巴瘤、脑瘤也都有一定疗效。
6/23/2014
微生物发酵法
• 自1993年第一株产紫杉醇的真菌呗发现并报道后， 微生物发酵法生产紫杉醇逐渐被认为是一种环境 友好、成本低廉的解决紫杉醇生产原料来源危机 的方法。
• 目前主要通过以下两个途径来解决菌种的问题： 一是从自然界中继续寻找更适合发酵的原始菌株； 二是对现有的菌株进行遗传改造，提高其发酵紫 杉醇产率。
6/23/2014
• 化学半合成产物紫杉醇烯对卵巢癌有更好的治疗 作用。 • 半合成不仅可缓解紫杉醇的供应危机，而且可以 通过半合成的研究获得有关构效关系的信息，对 紫杉醇结构进行修饰改造以期寻找活性更大、毒 副作用更小的紫杉醇类似物。半合成紫杉醇被认 为是除人工种植外,扩大紫杉醇来源的有效途径。
6/23/2014
谢谢！！！
6/23/2014
紫杉醇的研究进展
6/23/2014
目
录
• 紫杉醇的相关介绍 • 紫杉醇药源的研究进展
• 展望
6/23/2014
紫杉醇的相关介绍
6/23/2014
研究背景
• 近年来，恶性肿瘤、心脑血管疾病等严重危害人 类健康的重大疾病正呈现不断增加的趋势，给个 人、家庭和社会带来了巨大的经济负担。之前的 抗肿瘤药多以化学合成药（化疗药）为主，然而 由于这些化学合成药对人体具有极大的毒副用， 因此从天然植物中寻求具有抗癌活性的高效低毒 药物已成为国内外药学界的研究热点，紫杉醇就 是销售额一直是第一的抗肿瘤药。
6/23/2014
• 美国FDA于1992年12月29日正式批准紫杉醇 作为治疗晚期卵巢癌、肺癌、子宫癌等的 治疗药物市，现在是全球销量最大的抗癌 药物。 • 1995年,我国北京协和药厂与海口制药厂分 获二类新药批准文号,成为世界上第2个生 产紫杉醇及其注射液的国家。
6/23/2014
简单介绍
展 望
6/23/2014
• 随着紫杉醇生物合成途径的研究，充分应 用现代生物技术，对能够产生紫杉醇的微 生物进行遗传改造，构建优质高产的工程 菌并优化其发酵条件，是提高紫杉醇产量 最有效，也是必然的途径。实现紫杉醇的 微生物发酵生产，从而解决紫杉醇的药源 问题，改善市场上紫杉醇价格昂贵，供不 应求的现状，保护濒临灭绝的珍稀红豆杉 树种。
6/23/2014
半化学合成
• 紫杉醇半合成法是以红豆杉属植物中(以枝叶为主) 提取分离的10-乙酰基巴卡亭Ⅲ和巴卡亭Ⅲ等紫杉 烷类二萜化合物为前体 , 通过选择性保护羟基 , 然 后在C-13羟基上接上合成的侧链,再去掉保护基团 得到紫杉醇。 • 由于10-乙酰基巴卡亭Ⅲ和巴卡亭Ⅲ在红豆杉属植 物枝叶中含量高达0 · 1% 以上, 为紫杉醇含量的 10 倍以上,加之红豆杉枝叶生物量大,再生能力强,半 合成紫杉醇的原料是很丰富的。
6/23/2014
• 但是，南方红豆杉的愈伤状态分为 2 种类型：（1 ） 颜色浅，生长快，高度分散的愈伤组织系；（2） 颜色深，生长慢，呈块状愈伤组织。茎段培养的 愈伤为第1种，长势快；而叶片培养的愈伤则为第 2 种，长势很慢。但是，有研究表明，第 2 类愈伤 组织能大量产生紫杉醇，因此对叶片愈伤的研究 不因长势缓慢而忽视。
6/23/2014
• 张昕欣等（ 2012 ）考察了植物内生细菌欧文氏菌 生产紫杉醇的摇瓶发酵和 30 L罐发酵工艺条件。 结果显示，培养基中添加不同的前体对紫杉醇产 量影响显著。较高浓度的乙酸钠(>0.01 mmol/L ) 和较低浓度的苯丙氨酸(<0.05 mmol/L )有利于紫 杉醇积累。在此基础上进行了 30 L 罐发酵试验， 得优化培养基配方 ( g/L )：大豆蛋白胨 20，工 业酵母抽提物5，氯化钠0.5，氯化钾0.1，葡萄糖 4，氯化镁1，乙酸钠0.1，苯丙氨酸5×10- 4；pH 6.5 。发酵培养条件：接种量 5 ％，发酵温度 22 ℃，通气速率0.17 vvm ，转速50 r/min，发酵时 间60 h 。在此条件下，30 L 发酵罐中紫杉醇的 产量102μ g/L。
6/23/2014
细胞培养
• 红豆杉科植物细胞培养生产紫杉醇较为有产业前 景和优势的方法。 • 主要从三个方面来进行研究： 1、筛选出了诱导愈伤组织的最佳外植体 2、优化了诱导愈伤组织的培养基 3、寻找了解决褐化问题的方法
6/23/2014
• 于等（2012 ）研究了不同外植体、不同外源激素、 不同光照条件对南方红豆杉愈伤组织诱导的影响。 • 结果表明：1）茎段是诱导红豆杉愈伤组织的最佳 外植体，出愈时间快，愈伤组织黄绿色，质地疏 松；而叶片则出愈时间慢，愈伤组织黄白色，质 地密。 2 ） 2,4-D 与 NAA 的协同促进作用明显，当 2,4-D/NAA 为1/5时，诱导效果最好，而比值较大 时不利于愈伤的诱导。3）黑暗培养能够明显促进 愈伤组织发生，褐化现象减轻。
6/23/2014
• 凡丽（ 2012 ）研究以南方红豆杉优良植株为材料， 首先筛选诱导愈伤组织的外植体，然后优化诱导 愈伤组织的培养基，接着寻求解决褐化问题的方 法，最后优化产紫杉醇的条件。 • 结果：1、不带叶茎段外植体诱导愈伤组织效果最 好的外植体。 2 、 以不带叶莲段和成熟胚为外植体，用 得到的较佳组合作为培养基，通过单因素试验研 究结果表明向培养基中添加水解酪蛋白是缓解褐 化的较好方法。
6/23/wk.baidu.com014
• 代文亮等（2008）研究了一株内生真菌Ｆusarium mairei UH23发酵产紫杉醇的工艺条件。实验结果 表明最佳培养条件为：温度 26 ℃，发酵起始pH 值 7.0,接种量5％，装液量250ml三角瓶装液60 ml， 发酵周期 12 ｄ。筛选出最佳碳源为葡萄糖，最佳 氮源为硝酸铵。在上述条件下发酵，紫杉醇产量 达（286.4±20.3）μ ｇ/L，较优化前提高10.2％。
6/23/2014
• 靳瑞等（2011）从分离到的420株内生真菌中筛选 到一株产紫杉醇的内生真菌XC1-07 实验材料进行 发酵条件的初步优化。结果表明：最适碳源、氮 源分别是麦芽糖和 NH 4 NO 3 ；在含 10g/l NH 4 NO 3 、 90g/ 麦芽糖、 1.0 g/l MgSO ４ 、 pH 6 的优化培养 基中培养3ｄ,紫杉醇的产量为1124.34 μ g/l。为 目前报道的植物内生真菌发酵生产紫杉醇最高的 产量。
6/23/2014
•
3、南方红豆杉细胞悬浮培养体系中最适合细 胞生长的初始糖浓度为30%。整个悬浮培养过程， 细胞的生长曲线呈“ S ”型；细胞的生长周期为 30d; 在稳定期测得细胞中和悬浮培养液中累积的 紫杉醇总含量13.0μ g/mL;在显微镜下观察到南方 红豆杉的细胞多数呈圆形或椭圆形。 • 4、不带叶茎段在B5培养基上生长较好，且诱 导愈伤组织的较好培养基组合为：B5+NAA 1.0mg/L+6-BA 0.5mg/L;而成熟胚在1/2WPMSH培养 基上生长较好，它诱导愈伤组织的较佳培养基组 合是：1/2WPMSH +2,4-D1.5mg/L+6-BA O.5mg/L。
6/23/2014
化学结构
5β，20-环氧-1,2α，4,7β，10β，13α-六羟基紫杉烷-11-烯-9-酮-4,10-二乙 酸酯-2-苯甲酸酯-13[(2'R,3'S)-N-苯甲酰-3-苯基异丝氨酸酯]
6/23/2014
抗癌原理
• 紫杉醇具有独特的微管活性,具有多种抗肿 瘤作用 , 它能与微管蛋白质结合 , 形成稳定 的稳管束 , 并使其被解聚 , 微管是真核细胞 的一种纤维蛋白 ,与细胞的有丝分裂紧密相 关 , 对于迅速分裂的肿瘤细胞 , 将癌细胞停 止在G2晚期或M期,抑制细胞复制,阻止癌细 胞Z增殖，从而起到抗癌的作用。
6/23/2014
化学合成
• 紫杉醇本身具有及其复杂的化学结构，化学合成 方法获得具有很大的难度，但是由于其有效的抗 癌功能和提取所需原料的短缺，因此历来也为众 多化学研究人员所热衷。但是迄今为止，紫杉醇 的全合成尚未成功，其中较大障碍是环氧丙烷环 的合成。 • 这种方法因为成本高，反应过程比较复杂且效率 比较低，目前没有应用于工业中。
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紫杉醇药源的研究进展
6/23/2014
使用的方法分类
• • • • • 植物提取 化学合成 半化学合成 细胞培养 微生物发酵生成
6/23/2014
植物提取
• 紫杉醇的提取的传统方法为乙醇、甲醇或甲醇和 二氯甲烷混合溶剂提取。 • 最新的方法有超临界液相色谱法提取，提取溶剂 为 CO 2 或 CO 2 /EtOH ，温度 45 ℃ , 压力 18.0 ～ 25.8 Mpa,效果较传统方法稍优。 • 因为是红豆杉的皮中提取的，红豆杉是国家一级 保护植物，目前解决紫杉醇原料短缺的主要途径 是规模化、集约化营造红豆杉人工原料林。
6/23/2014
• 张芳芳等(2010)人选用了 3 种类型的南方红豆杉 外植体： 1. 去除了外种皮的成熟种子，在无菌滤 纸上将胚剥离；2.茎段，切成 0.5～1.5 cm 长的 小段；3. 侧芽，先剥去少数外鳞，再用剪刀稍稍 减碎。他们将上述外植体接种到添加了 2,4-D 的 MS 培养基上，结果发现，种胚的诱导率较高且愈 伤组织的污染率较低。
• 紫杉醇被称为 21 世纪最有开发价值的植物 来源的抗癌药，是继阿霉素、顺铂之后疗 效最好、副作用最小的药物。紫杉醇也因 此成为新一代抗癌药物的代表，被誉为植 物黄金”，红豆杉也因此成为“轰动世界 的药用植物”。 • 它是现阶段唯一可以控制癌细胞生长的植 物药物。
6/23/2014
• 紫杉醇是从红豆杉科红豆杉属植物短叶中 红豆杉 中分离出的一种具有独特结构的二 萜类成分，它的骨架三环萜，被命名为紫 杉烷。 • 紫杉醇主要用于治疗卵巢癌和乳腺癌、对 肺癌、大肠癌、黑色素瘤、头颈部癌、淋 巴瘤、脑瘤也都有一定疗效。
6/23/2014
微生物发酵法
• 自1993年第一株产紫杉醇的真菌呗发现并报道后， 微生物发酵法生产紫杉醇逐渐被认为是一种环境 友好、成本低廉的解决紫杉醇生产原料来源危机 的方法。
• 目前主要通过以下两个途径来解决菌种的问题： 一是从自然界中继续寻找更适合发酵的原始菌株； 二是对现有的菌株进行遗传改造，提高其发酵紫 杉醇产率。
6/23/2014
• 化学半合成产物紫杉醇烯对卵巢癌有更好的治疗 作用。 • 半合成不仅可缓解紫杉醇的供应危机，而且可以 通过半合成的研究获得有关构效关系的信息，对 紫杉醇结构进行修饰改造以期寻找活性更大、毒 副作用更小的紫杉醇类似物。半合成紫杉醇被认 为是除人工种植外,扩大紫杉醇来源的有效途径。
6/23/2014
谢谢！！！
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紫杉醇的研究进展
6/23/2014
目
录
• 紫杉醇的相关介绍 • 紫杉醇药源的研究进展
• 展望
6/23/2014
紫杉醇的相关介绍
6/23/2014
研究背景
• 近年来，恶性肿瘤、心脑血管疾病等严重危害人 类健康的重大疾病正呈现不断增加的趋势，给个 人、家庭和社会带来了巨大的经济负担。之前的 抗肿瘤药多以化学合成药（化疗药）为主，然而 由于这些化学合成药对人体具有极大的毒副用， 因此从天然植物中寻求具有抗癌活性的高效低毒 药物已成为国内外药学界的研究热点，紫杉醇就 是销售额一直是第一的抗肿瘤药。
6/23/2014
• 美国FDA于1992年12月29日正式批准紫杉醇 作为治疗晚期卵巢癌、肺癌、子宫癌等的 治疗药物市，现在是全球销量最大的抗癌 药物。 • 1995年,我国北京协和药厂与海口制药厂分 获二类新药批准文号,成为世界上第2个生 产紫杉醇及其注射液的国家。
6/23/2014
简单介绍