甲型肝炎病毒实时荧光定量PCR检测方法的比较
两种荧光定量PCR试剂检测HBV-DNA的比较与评价
两种荧光定量PCR试剂检测HBV-DNA的比较与评价近年来，随着分子生物学和生物技术的发展，PCR（聚合酶链反应）技术日益成为分子生物学和生物医学领域中的重要工具。
特别是在病毒感染的检测和诊断中，PCR技术被广泛应用。
HBV-DNA是乙型肝炎病毒的DNA，而HBV-DNA的检测对于乙型肝炎的诊断和治疗至关重要。
而在PCR技术中，荧光定量PCR是一种常用的方法。
在本文中，我们将比较和评价两种荧光定量PCR试剂检测HBV-DNA的效果，为临床诊断提供参考。
让我们了解一下两种荧光定量PCR试剂的原理和特点。
第一种试剂使用的是探针法，这是一种利用双探针技术测定HBV-DNA含量的方法。
它结合了两种荧光探针技术：TaqMan和MGB（minor groove binder）。
这种试剂可以通过测定DNA探针的荧光信号来定量检测HBV-DNA，具有灵敏度高、特异性好的特点。
第二种试剂则采用SYBR Green I技术，它是一种利用DNA结合荧光染料的方法。
在PCR过程中，SYBR Green I可以结合到双链DNA并发出荧光信号，从而实现对HBV-DNA的定量检测。
这种试剂具有操作简便、成本低廉的特点。
接下来，让我们比较两种试剂在检测HBV-DNA方面的性能差异。
首先是灵敏度方面，探针法的灵敏度相对更高，可以实现对低浓度HBV-DNA的检测。
而SYBR Green I技术在低浓度样本的检测中相对较弱。
其次是特异性方面，探针法由于其双探针技术的特点，对非特异性反应的抑制能力更强，特异性更好。
而SYBR Green I技术在某些情况下可能存在非特异性反应。
探针法需要设计特异性探针，成本较高，而SYBR Green I技术只需要通用引物，成本较低。
两种方法在操作难度和实验流程上也有所不同，探针法操作相对繁琐，需要精准的探针设计和合成，而SYBR Green I技术操作相对简单，适合高通量实验。
综合以上比较，我们可以得出结论：两种荧光定量PCR试剂在检测HBV-DNA方面都具有优势和劣势，应根据实际需求选择适合的试剂。
甲型肝炎的肝炎病毒核酸检测方法
甲型肝炎的肝炎病毒核酸检测方法甲型肝炎（Hepatitis A）是一种由甲型肝炎病毒（HAV）引起的急性肝炎疾病。
HAV主要通过食物或水源传播，感染者的粪便中含有病毒，当人们摄入被污染的食物或水时，病毒就会进入体内，导致感染。
甲型肝炎的临床表现多样，从无症状感染到轻度疾病，再到重度肝炎，甚至急性肝衰竭。
肝炎病毒核酸检测是甲型肝炎的确诊和病毒携带者的筛查方法之一。
核酸检测通过检测患者体液中的病毒核酸，来确定是否存在病毒感染。
以下是一些常用的甲型肝炎病毒核酸检测方法。
1. 实时荧光定量PCR（RT-qPCR）实时荧光定量PCR是一种高灵敏度和高特异性的核酸检测方法，它可以检测到非常低浓度的病毒核酸。
该方法通过特定引物和探针与病毒核酸结合，产生荧光信号来检测病毒的存在。
RT-qPCR可以快速、准确地确定感染者的病毒载量，并监测病情的变化。
2. 反转录PCR（RT-PCR）反转录PCR是一种将RNA转录成DNA，然后进行PCR扩增的方法。
在甲型肝炎的检测中，RT-PCR可以将患者体液中的HAV RNA转录成HAV DNA，并进行扩增和检测。
这种方法对病毒的检测灵敏度高，可以用于早期感染的诊断。
3. 病毒载量测定病毒载量测定是通过定量检测患者体液中的病毒核酸来评估病情和治疗效果的方法。
常用的方法包括实时荧光定量PCR和RT-PCR。
病毒载量测定可以帮助医生判断感染的程度和预测病情的发展，对指导治疗和预后评估具有重要意义。
4. 其他检测方法除了核酸检测，甲型肝炎的诊断还可以通过检测血清中的抗HAV IgM抗体来确定。
这种方法可以检测到早期感染的抗体产生，但相对于核酸检测来说，其敏感度和特异性较低。
总结起来，甲型肝炎的肝炎病毒核酸检测方法包括实时荧光定量PCR、反转录PCR和病毒载量测定。
这些方法可以快速、准确地确定感染者的病毒载量和病情，对指导治疗和预后评估非常重要。
此外，抗HAV IgM抗体检测也可以用于早期感染的诊断，但其敏感度和特异性相对较低。
细胞培养结合实时荧光RT-PCR法快速检测甲肝病毒滴度的研究
８ ｄ检测病毒滴度 为 ｌ ｇ ｌ ０ 。 Ｃ Ｃ Ｉ Ｄ 。 ／ ｍ Ｌ 。同一样本重复检测 ３次 ， 批 内样本 ０ 值 的变异 系数最大 为 ０ ． ８ ９ ％， 批 间样
本 ０ 值变异 系数最 大为 １ ． ６ ６ ％。建立 的细胞培养结合实 时荧光 Ｒ Ｔ — Ｐ Ｃ Ｒ法 （ 细胞 培养 ８ ｄ ） 与细胞 培养 Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ法 （ 细胞培养 ２ ８ ｄ ） 检测 甲肝病毒滴 度结果 差异无 统计 学意义 （ Ｐ ＞ ０ ． ０ ５ ） 。结论
该方 法具有 快速 、 灵敏、 特 异等 优
Ｄｅ ｔ ｅ ｒ ｍｉ ｎ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ ｈ ｅ ｐ ａ ｉｔ ｔ ｉ ｓ Ａ ｖ ａ ｃ ｃ ｉ ｎｅ ｂ ｙ ｃ ｅ ｌ ｌ ｃ ｕｌ ｔ ｕｒ ｅ ｃ ｏ ｍｂ ｉ ｎｅ ｄ ｗｉ ｔ ｈ
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甲型肝炎的病毒载量和临床意义
甲型肝炎的病毒载量和临床意义甲型肝炎是由甲型肝炎病毒（HAV）引起的急性肝炎，是全球最常见的肝炎类型之一。
病毒载量是指在患者体内的病毒数量，对于甲型肝炎的临床意义具有重要的影响。
本文将探讨甲型肝炎的病毒载量与临床意义之间的关系。
一、病毒载量的测定方法甲型肝炎病毒的病毒载量可以通过实时荧光定量PCR等分子生物学技术来测定。
这些方法可以准确地测量患者体内的病毒数量，并提供一个可靠的指标来评估感染的严重程度和预后。
二、病毒载量与临床表现的关系甲型肝炎病毒的病毒载量与患者的临床表现密切相关。
一般来说，病毒载量较高的患者往往表现出更严重的症状和疾病进展，包括肝功能异常、黄疸、肝脏炎症等。
相反，病毒载量较低的患者通常症状较轻或无症状，甚至可能自愈。
三、病毒载量与传播风险的关系高病毒载量的患者通常在体液（如血液、唾液、粪便等）中含有更多的病毒，因此更容易传播给其他人。
这也是甲型肝炎在一些密集人群中传播迅速的原因之一。
因此，对于高病毒载量的患者，特别是在食品、饮水等环境中，应采取相应的预防措施，以减少病毒的传播风险。
四、病毒载量与预后的关系病毒载量对甲型肝炎的预后也具有重要的意义。
一般来说，病毒载量较高的患者更容易出现并发症，如急性肝衰竭、肝硬化等。
此外，高病毒载量还与甲型肝炎的复发率和慢性化的风险增加相关。
因此，对于高病毒载量的患者，应密切监测其肝功能和病毒载量，及时采取相应的治疗措施，以降低并发症的发生和疾病的进展。
综上所述，甲型肝炎的病毒载量对该疾病的临床意义不可忽视。
病毒载量的测定可以帮助医生评估患者的感染程度和预后，指导治疗决策，并采取相应的预防措施以减少传播风险。
因此，在甲型肝炎的诊断和治疗中，病毒载量的监测应得到重视，以提高患者的治疗效果和预后。
甲型肝炎的检测方法和诊断准确性
甲型肝炎的检测方法和诊断准确性甲型肝炎是一种由甲型肝炎病毒（HAV）引起的急性肝炎，主要通过食物和水源传播。
它是全球范围内最常见的肝炎类型之一，尤其在发展中国家流行。
甲型肝炎通常具有较高的自限性，但在某些情况下可能会导致严重的并发症，甚至死亡。
因此，及早发现和准确诊断甲型肝炎对于预防疾病传播和提供适时治疗至关重要。
一、甲型肝炎的检测方法甲型肝炎的检测方法主要包括血清学检测和分子生物学检测。
1. 血清学检测血清学检测是最常用的甲型肝炎检测方法之一，其基于检测血清中特定的抗体和抗原。
抗体检测主要包括抗-HAV IgM和抗-HAV IgG。
抗-HAV IgM是甲型肝炎的早期标志物，其阳性结果表明当前感染或最近的感染。
抗-HAV IgG是甲型肝炎的持久性标志物，其阳性结果表明曾经感染过HAV或接种过甲型肝炎疫苗。
2. 分子生物学检测分子生物学检测是一种高度敏感和特异的甲型肝炎检测方法，其基于检测HAV的核酸序列。
常用的分子生物学检测方法包括聚合酶链反应（PCR）和实时荧光定量PCR（qPCR）。
这些方法可以直接检测HAV的RNA或DNA，对于早期感染和低病毒载量的检测具有较高的准确性。
二、甲型肝炎的诊断准确性甲型肝炎的诊断准确性取决于所采用的检测方法和时机。
1. 抗体检测的准确性抗体检测通常在症状出现后的数天至数周内进行，其准确性较高。
抗-HAV IgM的检测结果可以作为甲型肝炎早期感染的指标，其敏感性和特异性较高，但也存在一定的假阳性和假阴性结果。
因此，在初步阳性结果出现后，建议进行复检以确认结果。
2. 分子生物学检测的准确性分子生物学检测通常在感染后的早期进行，其准确性较高。
PCR和qPCR方法可以检测到低至几个病毒颗粒的存在，因此对于早期感染和低病毒载量的检测具有较高的敏感性和特异性。
然而，分子生物学检测的成本较高，需要较为专业的实验室设备和技术支持，因此在一般临床实践中使用较少。
总体而言，甲型肝炎的检测方法多样，选择合适的检测方法取决于不同的临床情况和实验室条件。
三种荧光定量PCR检测方式比较精选全文完整版
可编辑修改精选全文完整版三种荧光定量PCR检测方式比较：以参照物为标准，对PCR终产物进行分析或对PCR进程进行监测，从而达到评估样本中靶基因的拷贝数，称为定量PCR。
定量PCR的可行性定量一样是在PCR扩增的指数期进行的。
常见检测方式可分为以下几类：(1) SYBR Green I 检测模式SYBR Green I 是一种能与双链DNA 结合发光的荧光染料。
其与双链DNA 结合后，荧光大大增强。
因此，SYBR Green I 的荧光信号强度与双链DNA 的数量相关，能够依照荧光信号检测出PCR 体系存在的双链DNA 数量。
SYBR Green I 的最大吸收波长约为497nm，发射波长最大约为520nm。
PCR 扩增程序一样为94℃～55℃～72℃三步法，40 个循环。
SYBR Green I 的缺点：由于SYBR Green I 没有特异性，不能识别特定的双链，只若是双链就会结合发光，对PCR 反映中的非特异性扩增或也会产生荧光，通常本底较高，因此在临床上利用可能会有假阳性发生。
SYBR Green I 的优势：SYBR Green I 的优势是因为其缺点产生，由于它能所有的双链相结合，因此对不同模板不需专门定制不同的特异性探针，通用性较好，而且价钱相对较低。
这对科研是很有利的，因此国内外在科研中利用比较普遍。
(2) 水解探针模式(man探针)TaqMan 探针是一种探针，荧光基团连接在探针的5’结尾，而淬灭剂那么在3’结尾。
当探针与靶序列配对时，荧光基团发射的荧光因与3’端的淬灭剂接近而被淬灭。
在进行延伸反映时，聚合酶的5’外切酶活性将探针切断，使得荧光基团与淬灭剂分离，发射荧光。
一分子的产物生成绩伴随着一分子的荧光信号的产生。
随着扩增循环数的增加，释放出来的荧光基团不断积存。
因此Taqman 探针检测的是积存荧光。
PCR 扩增程序一般是：94℃～60 ℃40 个循环。
经常使用的荧光基团是FAM，TET，VIC，HEX。
两种荧光定量PCR试剂检测HBV-DNA的比较与评价
两种荧光定量PCR试剂检测HBV-DNA的比较与评价HBV-DNA是指乙型肝炎病毒的DNA，乙型肝炎是一种常见的传染病，严重者可发展为肝硬化和肝癌。
对HBV-DNA进行准确快速的检测对于乙型肝炎的预防和治疗非常重要。
目前，常用的HBV-DNA检测方法之一就是荧光定量PCR法。
本文将对比两种常用的荧光定量PCR试剂对HBV-DNA的检测效果进行评价，以期为临床实验提供参考依据。
一、试剂介绍1. 荧光定量PCR试剂A荧光定量PCR试剂A是一种常用的商业试剂，根据厂家说明书得知，该试剂的检出限为10 IU/ml，检测范围为10-10^8 IU/ml，重现性良好，适用于临床检测。
二、检测原理荧光定量PCR是一种利用PCR技术和荧光探针技术相结合的方法，可以对DNA进行高灵敏度的定量检测。
在HBV-DNA检测中，荧光定量PCR试剂会通过特定的引物和探针对乙型肝炎病毒的DNA进行扩增，并利用荧光信号来定量检测目标DNA的含量。
三、检测结果比较与评价1. 灵敏度比较通过对同一份样本分别使用试剂A和试剂B进行检测，发现试剂A的检出限明显低于试剂B。
在实际应用中，对于低水平的HBV-DNA，试剂A的性能表现更为优越，可以更精准地检测出病毒载量较低的患者。
2. 稳定性比较在长期使用过程中，试剂A和试剂B的稳定性表现出一定的差异。
试剂A在不同存储条件下的试剂稳定性较好，能够保持较长时间的高灵敏度和准确性；而试剂B在长期使用后，可能会出现一定程度的灵敏度下降，需要更频繁地更换试剂批次以保证结果的准确性。
在进行多次重复检测实验后，发现试剂A和试剂B的重现性表现相当，均具有较好的重现性。
这表明无论是试剂A还是试剂B，都可以在不同实验条件下保持较高的结果稳定性，可以满足临床实验的需求。
四、总结与展望通过对试剂A和试剂B的检测结果比较与评价，我们可以得出结论：试剂A相对于试剂B在HBV-DNA定量检测中具有更高的灵敏度和更好的稳定性，能够更准确、更快速地检测出乙型肝炎病毒的DNA含量。
甲型肝炎病毒和戊型肝炎病毒双重荧光定量PCR检测方法-病毒学论文-生物学论文
甲型肝炎病毒和戊型肝炎病毒双重荧光定量PCR检测方法-病毒学论文-生物学论文——文章均为WORD文档，下载后可直接编辑使用亦可打印——甲型肝炎病毒（Hepatitis A Virus,HAV）和戊型肝炎病毒（Hepatitis E Virus,HEV）均是能够引起急性肝炎暴发的致病因子，历史上都曾多次造成疾病流行，带来过很严峻的公共卫生问题[1].虽然在分类学上这两个病毒相去甚远，但从流行病学的角度来看，HAV和HEV的分布均具有明显的区域性特征，在发展中国家流行较广，尤其是卫生条件较差的区域，这在很大程度上应该归因于两种病毒具有相似的传播途径，都是通过粪口途径传播，事实证明：直接接触感染者的排泄物或排泄物污染过的水、土壤甚至接触感染者存在的环境都有可能造成HAV和HEV感染，因此对于排泄物中以及环境中和蔬菜食品中的病毒检测便显得尤其重要，然而，这两种病毒都很难进行细胞培养，或可以培养但不出现明显的细胞病理效应，因此对HAV和HEV 的检测便主要依赖于核酸的检测，目前实时荧光定量PCR技术以其灵敏度高，检测速度快，特异性强等优点，已在很多种病原体的核酸定量检测中得到了广泛的应用，实时荧光定量PCR技术又主要分为SYBR Green染料技术和TaqMan探针技术两种，两种方法相比，TaqMan探针技术具有更好的特异性，且花费更低、易于设计，所以本研究探索建立了基于TaqMan技术的HAV和HEV双重荧光定量PCR检测方法。
1材料与方法1.1血清样品和对照病毒株来源用于制备HAV和HEV定量标准品的质粒模板由中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所馈赠。
检验反应体系特异性时用到的麻疹病毒核酸（RNA）、脊髓灰质炎病毒核酸（RNA）、风疹病毒核酸（RNA）、呼吸道合胞病毒核酸（RNA）、流感病毒核酸（RNA）、轮状病毒核酸（RNA）、诺如病毒核酸（RNA）、星状病毒核酸（RNA）以及肠道腺病毒核酸（DNA）来自于中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所，所有RNA储存于-70℃超低温冰箱。
实时荧光定量PCR在肝炎检测中的应用
实时荧光定量PCR在肝炎检测中的应用摘要：目的：探讨实时荧光定量PCR在肝炎尤其是乙型肝炎（乙肝）检测中的应用。
方法：对450例急、慢性乙肝患者，采用经酶联免疫吸附试验检测血清，并按血清学标志分为三组，并对所用患者血清实时荧光定量PCR检测。
结果：不同血清学标志模式的实时荧光定量PCR检测阳性率分别为95.95%、31.47%、52.20%，三组之间差异均有统计学意义（P＜0.01）。
结论：实时荧光栋梁PCR检测可以为乙肝病毒感染诊断、治疗及预后判断提供客观依据。
但对于病毒非复制感染不能有效检测，不可在肝炎检测中完全替代血清标志物检测。
关键词：实时荧光定量；PCR；乙型肝炎肝炎是全球人类健康的最大威胁，全球感染乙型肝炎（乙肝）约有4亿人，而我国的感染率更高约为9.09%，感染者超过1亿[1]。
病毒通过对机体免疫系统及感染肝细胞的攻击，引发肝炎和肝细胞坏死，若控制不及时、有效就会引发肝硬化、肝癌。
因此，对肝炎进行及时有效的检测，准确掌握病毒复制情况及肝炎治疗进展，具有非常重要的意义。
传统检测肝炎的酶联免疫吸附试验虽能够检测病毒的感染和传染性，却无法反应乙肝病毒（HBV）的复制水平，而实时荧光定量PCR可以根据基因水平（DNA）来判断乙肝病毒的复制状况，帮助临床诊断乙肝感染水平和疗效。
广东省深圳市药品检验所通过对血清学标志不同的乙肝患者的血清进行检测，以了解不同血清模式的患者中乙肝病毒复制水平。
1 资料与方法1.1 一般资料：2008年10月～2010年4月我院共接诊急、慢性乙肝患者450例，其中男230例，女220例，年龄15～58岁，平均（40.9±21.1）岁，入院诊断符合《病毒性肝炎防治方案》（2000年）[2]。
经酶联免疫吸附试验对乙肝患者的血清进行检测，并按血清学标志分为三组：A组中HBsAg、HBeAg及抗HBc呈现阳性；B组中HBsAg及抗HBc、抗HBe呈现阳性；C组中HBsAg及抗HBc呈现阳性。
甲型肝炎的病毒检测技术的发展与应用
甲型肝炎的病毒检测技术的发展与应用甲型肝炎是一种由甲型肝炎病毒（HAV）引起的急性传染病。
自20世纪70年代发现该病毒以来，甲型肝炎的病毒检测技术得到了长足的发展和应用。
本文将介绍甲型肝炎病毒检测技术的发展历程以及目前的应用情况。
1. 病毒检测技术的发展历程甲型肝炎病毒最早是通过电子显微镜观察到的，但这种方法仅适用于病毒颗粒的直接观察，无法进行定量和准确的检测。
随着分子生物学的发展，一系列基于核酸检测的方法被开发出来，如聚合酶链反应（PCR）和核酸杂交技术。
这些方法可以检测病毒的核酸片段，具有高度敏感性和特异性。
2. PCR技术在甲型肝炎病毒检测中的应用PCR技术是一种能够扩增特定DNA片段的方法，它在甲型肝炎病毒检测中得到了广泛应用。
通过选择合适的引物和探针，可以扩增和检测甲型肝炎病毒的核酸片段。
PCR技术具有高度敏感性和特异性，可以在早期感染和低病毒载量的情况下进行检测。
此外，PCR技术还可以进行基因型鉴定和病毒变异分析，有助于了解甲型肝炎病毒的流行病学特征和变异规律。
3. 免疫学检测技术在甲型肝炎病毒检测中的应用除了核酸检测技术，免疫学检测技术也被广泛应用于甲型肝炎病毒的检测。
免疫学检测技术包括酶联免疫吸附试验（ELISA）、放射免疫测定法（RIA）和免疫荧光法等。
这些方法通过检测血清中的甲型肝炎病毒抗原或抗体来判断感染情况。
免疫学检测技术具有操作简便、成本低廉和高通量的优点，适用于大规模的甲型肝炎病毒筛查和流行病学调查。
4. 新技术在甲型肝炎病毒检测中的应用随着科技的不断进步，新的检测技术也在甲型肝炎病毒检测中得到应用。
例如，基于微流控芯片的技术可以实现高通量和快速的甲型肝炎病毒检测，有助于提高检测效率和准确性。
此外，基于质谱技术的方法也被用于甲型肝炎病毒的检测和定量，具有高灵敏度和高通量的特点。
总结：甲型肝炎病毒检测技术的发展经历了从电子显微镜到分子生物学和免疫学的转变。
目前，PCR技术和免疫学检测技术是甲型肝炎病毒检测的主要方法，它们具有高度敏感性和特异性，适用于不同场景的检测需求。
两种荧光定量PCR试剂检测HBV-DNA的比较与评价
两种荧光定量PCR试剂检测HBV-DNA的比较与评价1. 两种荧光定量PCR试剂的原理与特点（1）试剂A：A试剂采用了独特的放大酶技术，使其具有较高的灵敏度和稳定性，在PCR反应中不易出现非特异产品。
（2）试剂B：B试剂是一种经典的荧光定量PCR试剂，基于与靶DNA序列特异性结合的探针技术进行定量。
2. 两种试剂在HBV-DNA检测中的应用（1）A试剂：经过临床应用的数据显示，A试剂在HBV-DNA检测中表现出较好的稳定性和准确性，能够快速且准确地检测出HBV感染。
（2）B试剂：B试剂在HBV-DNA检测中也得到了广泛的应用，其特异性和敏感度均得到了临床实践的证明。
3. 两种试剂的比较与评价（1）灵敏度比较：通过对同一批样本进行A试剂和B试剂的检测，发现A试剂的灵敏度略高于B试剂，能够检测出更低浓度的HBV-DNA。
（2）特异性比较：A试剂和B试剂均表现出良好的特异性，能够准确地识别HBV-DNA 序列。
（3）稳定性比较：在不同的PCR反应条件下，A试剂和B试剂的稳定性表现出一定的差异，A试剂在反应条件变化时仍能保持稳定，而B试剂则相对较敏感。
综合比较来看，A试剂在HBV-DNA的检测中具有较好的特性，包括较高的灵敏度、良好的特异性和稳定性。
而B试剂在HBV-DNA检测中的表现也较为出色，特别适用于一些特定的临床应用场景。
4. 结语两种荧光定量PCR试剂在HBV-DNA检测中均具有良好的表现，并且各自具有一些特点优势。
在实际临床应用中，可根据具体情况选择合适的试剂进行HBV-DNA检测，以提供更准确、更快速的诊断结果，并为临床治疗提供更有力的支持。
希望今后能够有更多的研究和实践，为HBV-DNA检测提供更多更好的方法和工具。
甲型肝炎的病毒学检测与临床应用
甲型肝炎的病毒学检测与临床应用甲型肝炎（Hepatitis A，简称HAV）是由甲型肝炎病毒引起的急性传染病，主要通过食物、水源和经口接触传播。
甲型肝炎在全球范围内广泛存在，尤其是发展中国家和卫生条件较差地区，是一种重要的公共卫生问题。
甲型肝炎的病毒学检测是诊断和监测该病的关键手段之一。
病毒学检测主要包括血清学检测和分子生物学检测两个方面。
血清学检测是通过检测患者血清中的甲型肝炎病毒抗体来确定感染情况。
目前常用的血清学检测方法包括酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫荧光法（IFA）和放射免疫测定法（RIA）。
这些方法可以检测到患者体内的甲型肝炎病毒特异性IgM抗体和IgG抗体。
IgM抗体的出现表明患者处于急性感染期，而IgG抗体的产生则表示患者已经获得免疫力或曾经感染过甲型肝炎。
分子生物学检测是通过检测患者体内的甲型肝炎病毒核酸来确定感染情况。
目前常用的分子生物学检测方法包括聚合酶链反应（PCR）和实时荧光定量PCR。
这些方法具有高度的敏感性和特异性，可以检测到甲型肝炎病毒的RNA或DNA。
分子生物学检测在早期感染、病毒携带者和疫苗有效性评估等方面具有重要的临床应用价值。
临床上，甲型肝炎的病毒学检测主要用于以下几个方面：1. 诊断：病毒学检测可以帮助医生确定患者是否感染了甲型肝炎病毒。
通过检测患者血清中的特异性抗体和核酸，可以准确判断感染的类型和阶段，以指导后续的治疗和管理措施。
2. 疫情监测：病毒学检测可以用于监测甲型肝炎的流行病学特征和传播情况。
通过对人群中的抗体阳性率和病毒核酸阳性率进行监测，可以及时掌握疫情动态，为公共卫生部门制定干预措施提供科学依据。
3. 疫苗评估：病毒学检测可以用于评估甲型肝炎疫苗的有效性和免疫效果。
通过检测接种者的抗体水平和病毒核酸状态，可以评估疫苗的保护效果，并为疫苗接种策略的制定提供参考。
4. 治疗监测：病毒学检测可以用于监测患者在治疗过程中的病毒清除情况。
通过定期检测患者血清中的病毒抗体和核酸，可以评估治疗效果，并调整治疗方案。
用于检测甲型肝炎病毒核酸的实时荧光定量RT-PCR方法[发明专利]
![用于检测甲型肝炎病毒核酸的实时荧光定量RT-PCR方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/06306a83783e0912a3162a05.png)
专利名称：用于检测甲型肝炎病毒核酸的实时荧光定量RT-PCR方法
专利类型：发明专利
发明人：饶子和,庞正,常瑞恒,赵润泽,王祥喜
申请号：CN201811183056.X
申请日：20181011
公开号：CN109207638A
公开日：
20190115
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明涉及一种检测甲型肝炎病毒(Hepatitis A virus，HAV)的实时荧光定量RT‑PCR方法，该方法包括引物和探针的获得及HAV核酸的检测。
本发明方法特异性好、灵敏度高、重复性好，可良好应用于定量检测样本中HAV的核酸拷贝数。
申请人：天津国际生物医药联合研究院
地址：300457 天津市滨海新区经济技术开发区洞庭路220号
国籍：CN
代理机构：北京德恒律治知识产权代理有限公司
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化学发光微粒子免疫检测法和实时荧光RT-PCR法检测甲型肝炎病毒的比较分析
㊀㊀辽宁大学学报㊀㊀㊀自然科学版第４５卷㊀第１期㊀２０１８年ＪＯＵＲＮＡＬＯＦＬＩＡＯＮＩＮＧＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹＮａｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓＥｄｉｔｉｏｎＶｏｌ.４５㊀Ｎｏ.１㊀２０１８化学发光微粒子免疫检测法和实时荧光ＲＴ－ＰＣＲ法检测甲型肝炎病毒的比较分析麻丽丹１ꎬ何㊀平２ꎬ王㊀青３ꎬ李㊀莉４ꎬ郭雨时１ꎬ高世光１ꎬ卢福荣３ꎬ于㊀洋１(１.丹东出入境检验检疫局ꎬ辽宁丹东ꎬ１１８０００ꎻ２.中国合格评定国家认可中心ꎬ北京１０００６２ꎻ３.东港出入境检验检疫局ꎬ辽宁丹东ꎬ１１８３００ꎻ４.辽宁出入境检验检疫局ꎬ辽宁大连ꎬ１１６０００)摘㊀要:目的:比较化学发光微粒子免疫检测法(ＣＭＩＡ)和实时荧光ＲＴ－ＰＣＲ法对２１８份人血清中甲型肝炎病毒的检测结果.方法:选取２０１６年８月~２０１６年１１月辽宁省丹东市传染病医院住院患者的血清样本２１８份ꎬ采用ＣＭＩＡ法和实时荧光ＲＴ－ＰＣＲ法检测甲型肝炎病毒ꎬ同时对采用实时荧光ＲＴ－ＰＣＲ法的ＩＳＯ/ＴＳ１５２１６－２㊁ＦＤＡ－ＢＡＭ㊁ＧＢ/Ｔ２２２８７－２００８三个标准检测甲型肝炎病毒的引物和探针组合进行了比较分析.结果:化学发光微粒子免疫检测法的阳性检出例数为３例ꎬ其Ｓ/ＣＯ值分别为２ ２２㊁４ １５㊁１ ３１.ＩＳＯ/ＴＳ１５２１６－２㊁ＦＤＡ－ＢＡＭ㊁ＧＢ/Ｔ２２２８７－２００８三种实时荧光ＲＴ－ＰＣＲ法的阳性检出例数分别为７例㊁５例和４例.而ＣＭＩＡ法和实时荧光ＲＴ－ＰＣＲ法有２个阳性样本的检测结果一致ꎬ测序的ＢＬＡＳＴ比对结果表明ＣＭＩＡ法１个阳性样本为假阳性结果ꎬ５个ＣＭＩＡ法阴性样本为假阴性结果.结论:ＩＳＯ方法的实时荧光ＲＴ－ＰＣＲ法用于人血清中甲型肝炎病毒的检测ꎬ准确度及灵敏度最佳.关键词:甲型肝炎病毒ꎻ人血清ꎻ实时荧光ＲＴ－ＰＣＲ法ꎻ化学发光微粒子免疫检测法中图分类号:Ｒ１８５㊀㊀㊀文献标志码:Ａ㊀㊀㊀文章编号:１０００￣５８４６(２０１８)０１￣００６４￣０７ＣｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆＴｗｏＭｅｔｈｏｄｓｆｏｒＤｅｔｅｃｔｉｎｇＨｅｐａｔｉｔｉｓＡＶｉｒｕｓｉｎＨｕｍａｎＳｅｒａ￣ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅＩｍｍｕｎｏａｓｓａｙａｎｄＲｅａｌ￣ｔｉｍｅＲＴ￣ＰＣＲＡｓｓａｙＭＡＬｉ￣ｄａｎ１ꎬＨＥＰｉｎｇ２ꎬＷＡＮＧＱｉｎｇ３ꎬＬＩＬｉ４ꎬＧＵＯＹｕ￣ｓｈｉ１ꎬＧＡＯＳｈｉ￣ｇｕａｎｇ１ꎬＬＵＦｕ￣ｒｏｎｇ３ꎬＹＵＹａｎｇ１(１.ＤａｎｄｏｎｇＥｎｔｒｙ￣ＥｘｉｔＩｎｓｐｅｃｔｉｏｎ＆ＱｕａｒａｎｔｉｎｅＢｕｒｅａｕꎬＤａｎｄｏｎｇ１１８０００ꎬＣｈｉｎａꎻ２.ＣｈｉｎａＮａｔｉｏｎａｌＡｃｃｒｅｄｉｔａｔｉｏｎＣｅｎｔｅｒｆｏｒＣｏｎｆｏｒｍｉｔｙＡｓｓｅｓｓｍｅｎｔꎬＢｅｉｊｉｎｇ１０００６２ꎬＣｈｉｎａꎻ３.ＤｏｎｇｇａｎｇＥｎｔｒｙ￣ＥｘｉｔＩｎｓｐｅｃｔｉｏｎ＆ＱｕａｒａｎｔｉｎｅＢｕｒｅａｕꎬＤａｎｄｏｎｇ１１８３００ꎬＣｈｉｎａꎻ４.ＬｉａｏｎｉｎｇＥｎｔｒｙ￣ＥｘｉｔＩｎｓｐｅｃｔｉｏｎ＆ＱｕａｒａｎｔｉｎｅＢｕｒｅａｕꎬＤａｌｉａｎ１１６０００ꎬＣｈｉｎａ)Ａｂｓｔｒａｃｔ:Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ㊀ＴｏｃｏｍｐａｒｅｔｈｅｒｅｓｕｌｔｏｆＡＲＣＨＩＴＥＣＴＨＡＶＡｂ￣ＩｇＭａｓｓａｙａｎｄｒｅａｌ￣ｔｉｍｅＰＣＲｍｅｔｈｏｄｆｏｒｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆ２１８ｈｅｐａｔｉｔｉｓＡｖｉｒｕｓ(ＨＡＶ)ｉｎｈｕｍａｎｓｅｒａ.Ｍｅｔｈｏｄｓ㊀Ｔｗｏｍｅｔｈｏｄｓꎬｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ(ＣＩＡ)ａｎｄｒｅａｌ￣ｔｉｍｅＲＴ￣ＰＣＲａｓｓａｙｆｏｒｄｅｔｅｃｔｉｎｇｈｅｐａｔｉｔｉｓＡｖｉｒｕｓ(ＨＡＶ)ｉｎｈｕｍａｎｓｅｒａｗｅｒｅｃｏｍｐａｒｅｄꎬａｎｄｐｒｉｍｅｒａｎｄｐｒｏｂｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓｏｆＩＳＯ/ＴＳ１５２１６￣２ꎬＦＤＡ￣ＢＡＭꎬＧＢ/Ｔ２２２８７￣２００８ｗｅｒｅｃｏｍｐａｒｅｄｔｏｏ.２１８ｓｅｒａｓａｍｐｌｅｓｃｏｌｌｅｃｔｅｄｉｎｈｏｓｐｉｔａｌｆｒｏｍＡｕｇｕｓｔｔｏＮｏｖｅｍｂｅｒ２０１４ｗｅｒｅａｎａｌｙｚｅｄ.Ｒｅｓｕｌｔｓ㊀ＡｎａｕｔｏｍａｔｅｄＣＭＩＡｋｉｔｆｏｒａｎｔｉ￣ＨＡＶＩｇＭ￣Ａｒｃｈｉｔｅｃｔｗａｓｕｓｅｄꎬａｎｄ３ｓａｍｐｌｅｓｗｅｒｅｃｏｎｓｉｄｅｒｅｄｒｅａｃｔｉｖｅꎬｗｉｔｈｔｈｅｓｉｇｎａｌ/ｃｕｔ￣ｏｆｆ(Ｓ/ＣＯ)２ ２２ꎬ４ １５ꎬａｎｄ１ ３１ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ.Ｔｈｅｒｅａｌ￣ｔｉｍｅＲＴ￣ＰＣＲｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｒｅｗａｓｓｏｍｅａｇｒｅｅｍｅｎｔａｍｏｎｇｔｈｅｔｈｒｅｅＰＣＲｇｒｏｕｐｓꎬａｎｄ７ꎬ５ａｎｄ４ｐｏｓｉｔｉｖｅｓｅｒａｗｅｒｅｏｂｓｅｒｖｅｄｉｎｔｈｅＩＳＯꎬＦＤＡａｎｄＧＢｇｒｏｕｐꎬｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ.Ｃｏｍｐａｒｅｄｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅｌｙꎬｔｈｅｒｅｗｅｒｅ２ａｃｃｏｒｄａｎｔｓａｍｐｌｅｓｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅＣＭＩＡａｎｄＰＣＲａｓｓａｙꎬａｎｄ１ｓａｍｐｌｅｗａｓｆａｌｓｅｐｏｓｉｔｉｖｉｔｙｗｉｔｈｔｈｅＣＩＡｔｅｓｔꎬａｎｄ５ｓａｍｐｌｅｓｗｅｒｅｆａｌｓｅｎｅｇａｔｉｖｅｗｉｔｈｔｈｅＣＭＩＡｔｅｓｔ.Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ㊀ＩＳＯ￣ｂａｓｅｄｍｅｔｈｏｄｆｏｒｒｅａｌ￣ｔｉｍｅＲＴ￣ＰＣＲｍｅｔｈｏｄｆｏｒｔｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｈｕｍａｎｓｅｒｕｍａｃｃｕｒａｃｙａｎｄｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｏｆｔｈｅｈｅｐａｔｉｔｉｓＡｖｉｒｕｓｉｓｔｈｅｂｅｓｔ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ:㊀ｈｅｐａｔｉｔｉｓａｖｉｒｕｓꎻｈｕｍａｎｓｅｒａꎻｒｅａｌ￣ｔｉｍｅＲＴ￣ＰＣＲꎻｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ０㊀引言甲型肝炎是由甲型肝炎病毒(ＨｅｐａｔｉｔｉｓＡＶｉｒｕｓꎬＨＡＶ)引起的导致肝脏出现损害的急性消化道传染病ꎬ主要通过粪－口途径传播.临床上主要表现为急性起病㊁乏力㊁食欲减退㊁肝功能异常等症状ꎬ部分病例出现黄疸.我国在１９８８年曾发生过一次大规模甲肝流行ꎬ随着甲肝疫苗的使用ꎬ甲型肝炎在我国的流行已得到有效的控制.但是自２０１６年初以来ꎬ辽宁丹东地区甲肝病例数出现了一个明显的上升趋势ꎬ据统计ꎬ２０１６年１月~５月ꎬ丹东市传染病医院共收治甲肝病例数４１８例ꎬ是２０１５年的５ ３倍(２０１５年仅７９例)ꎻ而且患者的年龄趋向于大龄化ꎬ近７０％的病例为大于３５岁的成年人ꎬ这与以往不同ꎬ以往是小于２５岁人群的甲肝发病率居首ꎬ而４０岁以上人群的发病率最低ꎻ且本次发病病情重ꎬ转氨酶可达１０００以上ꎬ高黄疸ꎬ以直接胆红素为主ꎬ黄疸持续时间长ꎬ药物治疗周期明显延长ꎬ有的患者甚至进行人工肝治疗才缓慢好转ꎬ而以往都是自限性疾病ꎬ无需过多治疗.通过检测患者血清和血浆中甲型肝炎病毒(ＨＡＶ)的ＩｇＭ抗体是急性甲型肝炎的诊断的常用方法.在过去十年中ꎬ化学发光微粒子免疫检测法(ＣＭＩＡ)以其高特异性和操作方便性ꎬ已广泛应用于医院临床检测[１].研究表明在甲型肝炎发病前期或黄疽早期ꎬ血清中可检出甲型肝炎病毒的ＲＮＡꎬ可作为早期确诊甲型肝炎的重要指标[２－３].基于ＨＡＶＲＮＡ检测的实时荧光ＲＴ－ＰＣＲ法以其灵敏度高㊁特异性强㊁检测快速等优点ꎬ已成为成分复杂的食品基质中甲型肝炎病毒的标准检测方法ꎬ包括ＩＳＯ/ＴＳ１５２１６－２[４]㊁ＦｏｏｄａｎｄＤｒｕｇＡｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ.ＢＡＭ２６Ｂ[５]和我国的国家标准ＧＢ/Ｔ２２２８７－２００８[６]ꎬ其中ＩＳＯ/ＴＳ１５２１６－２方法中对于甲型肝炎病毒的检测限为每个反应１０个ｄｓＲＮＡ.因此ꎬ５６㊀第１期㊀㊀麻丽丹ꎬ等:化学发光微粒子免疫检测法和实时荧光ＲＴ－ＰＣＲ法检测甲型肝炎病毒的比较分析６６㊀㊀㊀辽宁大学学报㊀㊀自然科学版２０１８年㊀㊀子的手段来鉴别不同来源的ＨＡＶ野毒株.随着分子克隆和测序的方法的应用ꎬ越来越多ＨＡＶ野毒株的部分或全长核苷酸序列得到阐明ꎬ对基因组核苷酸序列进行比较分析成为鉴定病毒不同分离株遗传相关性的有效方法.本研究通过比较人血清中ＨＡＶ的两种检测方法:基于ＨＡＶＩｇＭ抗体的化学发光微粒子免疫检测(ＣＭＩＡ)法和基于核酸扩增的实时荧光ＲＴ－ＰＣＲ法ꎬ为准确快速检测临床样本甲肝病毒提供思路.１㊀材料与方法１ １㊀病料和试剂样本:来源于２０１６年８月~２０１６年１１月辽宁省丹东市传染病医院住院患者的血液样本２１８份ꎬ编号为１号~２１８号ꎬ血清分离后置于－８０ħ保存待检.ＣＭＩＡ法检测试剂盒:ＡＲＣＨＩＴＥＣＴＨＡＶＡｂ－ＩｇＭＲｅａｇｅｎｔＫｉｔ(甲型肝炎病毒抗体ＩｇＭ抗体测定试剂盒)ꎬ生产厂家为ＡｂｂｏｔｔＧｍｂＨ＆Ｃｏ ＫＧ(雅培德国制药有限公司).病毒ＲＮＡ提取纯化试剂盒:ＭａｇＭＡＸＴＭ－９６ＶｉｒａｌＲＮＡＩｓｏｌａｔｉｏｎＫｉｔ(ＡＭ１８３６)ꎬ美国ＡＢＩ公司生产ꎻ一步法ＲＴ－ＰＣＲ试剂盒:ＡｇＰａｔｈ－ＩＤＴＭＯｎｅ－ＳｔｅｐＲＴ－ＰＣＲＲｅａｇｅｎｔｓ(ＡＭ１００５)ꎬ美国ＡＢＩ公司生产ꎻ测序用阴极缓冲液:ＣａｔｈｏｄｅＢｕｆｆｅｒＣｏｎｔａｉｎｅｒ(ＣＢＣ)３５００Ｓｅｒｉｅｓ(４４０８２５６)ꎬ美国ＡＢＩ公司生产ꎻ测序用阳极缓冲液:ＡｎｏｄｅＢｕｆｆｅｒＣｏｎｔａｉｎｅｒ(ＡＢＣ)３５００Ｓｅｒｉｅｓ(４３９３９２７)ꎬ美国ＡＢＩ公司生产ꎻ测序用ＰＯＰ－７胶:ＰＯＰ－７ＴＭＰｏｌｙｍｅｒｆｏｒ３５００/３５００ｘＬＧｅｎｅｔｉｃＡｎａｌｙｚｅｒｓ(４３９３７０８)ꎬ美国ＡＢＩ公司生产ꎻ循环测序试剂盒:ＢｉｇＤｙｅ®Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒｖ３ １ＣｙｃｌｅＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＫｉｔ(４３３７４５４)ꎬ美国ＡＢＩ公司生产ꎻ测序用调节剂:ＣｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇＲｅａｇｅｎｔꎬ３５００Ｓｅｒｉｅｓ(４３９３７１８)ꎬ美国ＡＢＩ公司生产ꎻ反转录酶ＳｕｐｅｒｓｃｒａｐｔШ和Ｔａｑ酶购自Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司(美国英骏公司).１ ２㊀方法１ ２ １㊀化学发光微粒子免疫检测法采用ＨＡＶＩｇＭ抗体测定试剂盒测量样本产生的化学发光信号ꎬ通过比较该化学发光信号与ＡＲＣＨＩＴＥＣＴＨＡＶＩｇＭ抗体项目校准生产的Ｃｕｔｏｆｆꎬ确定样本中是否存在ＨＡＶＩｇＭ抗体.样本信号与Ｃｕｔｏｆｆ的比值(Ｓ/ＣＯ)值>１ ２０时ꎬ将该样品视为ＨＡＶＩｇＭ抗体反应性ꎬ样本Ｓ/ＣＯ值为０ ８~１ ２之间时ꎬ将该样本视为灰区反应性ꎬ当样本Ｓ/ＣＯ值<０ ８０时ꎬ将其视为非反应性.１ ２ ２㊀病毒ＲＮＡ的提取用ＭａｇＭＡＸＴＭ－９６病毒ＲＮＡ提取试剂盒提取病毒ＲＮＡꎬ具体操作为:取４００μＬ血液加入含ｃａｒｒｉｅｒＲＮＡ的８０２μＬ裂解/结合液中ꎬ加入２０μＬ悬浮磁珠液后混匀４ｍｉｎ后在磁场中静置至少３ｍｉｎꎬ用洗液１㊁洗液２洗涤ꎬ最后用洗脱液洗脱病毒ＲＮＡꎬ－２０ħ保存备用.１ ２ ３㊀实时荧光ＲＴ－ＰＣＲ法检测实时荧光ＲＴ－ＰＣＲ方法是在ＩＳＯ/ＴＳ１５２１６－２方法上稍作修改ꎬ即从血清样品中提取ＲＮＡ后ꎬ在ＡＢＩ７３００仪上采用一步法实时荧光ＲＴ－ＰＣＲ进行检测.采用的三种不同的引物探针组合见表１.㊀㊀反应体系:总体积２５μＬꎬ包括模板ＲＮＡ溶液５μＬꎬ２５ˑＲＴ－ＰＣＲ酶预混液１μＬꎬ２ˑＲＴ－每次循环的退火时收集荧光ꎬ检测结束后ꎬ根据扩增曲线和Ｃｔ值判定结果.表１㊀实时荧光ＲＴ－ＰＣＲ法引物和探针引物/探针方法序列(５ᶄ－３ᶄ)ＨＡＶ６８ＩＳＯＴＣＡＣＣＧＣＣＧＴＴＴＧＣＣＴＡＧＨＡＶ２４０ＩＳＯＧＧＡＧＡＧＣＣＣＴＧＧＡＡＧＡＡＡＧＨＡＶ１５０ＰＩＳＯＦＡＭ－ＣＣＴＧＡＡＣＣＴＧＣＡＧＧＡＡＴＴＡＡ－ＭＧＢＮＦＱＨＡＶ１ＧＢＴＴＴＣＣＧＧＡＧＣＣＣＣＴＣＴＴＧＨＡＶ３ＧＢＡＡＡＧＧＧＡＡＡＡＴＴＴＡＧＣＣＴＡＴＡＧＣＣＨＡＶＰＧＢＦＡＭ－ＡＣＴＴＧＡＴＡＣＣＴＣＡＣＣＧＣＣＧＴＴＴＧＣＣＴ－ＴＡＭＲＡＧＡＲ２ＦＦＤＡＡＴＡＧＧＧＴＡＡＣＡＧＣＧＧＣＧＧＡＴＡＴＧＡＲ１ＲＦＤＡＣＴＣＡＡＴＧＣＡＴＣＣＡＣＴＧＧＡＴＧＡＧＡＲＰＦＤＡＣｙ５－ＡＧＡＣＡＡＡＡＡＣＣＡＴＴＣＡＡＣＧＣＣＧＧＡＧＧ－ＩＢＲＱ１ ２ ４㊀２Ｂ/２Ｃ区段的ＲＴ－ＰＣＲ[８]２Ｂ/２Ｃ区段的ＲＴ－ＰＣＲ取２μＬ病毒ＲＮＡꎬ以ＳｕｐｅｒｓｃｒａｐｔШ和引物１(序列:５ᶄ－ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＧＧＴＡＣＣＡＴＴＴＡＣＴＧＡ)进行反转录扩增２Ｂ/２Ｃ区段的１３２６个核苷酸(上游引物:５ᶄ－ＧＧＴＧＴＴＧＧＡＴＴＡＡＴＡＧＣＡＧꎬ下游引物:５ᶄ－ＣＴＧＡＧＡＣＣＡＣＡＡＣＴＣＣＡＴＡ)ꎬ扩增条件为９４ħꎬ２ｍｉｎꎻ９４ħꎬ３０ｓꎻ５０ħꎬ３０ｓꎻ７２ħꎬ２ｍｉｎꎻ扩增４０个循环.扩增产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定大小后进行序列测定.１ ２ ５㊀引物合成及序列分析引物㊁探针由Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司合成ꎬ测序结果用ＤＮＡＳＴＡＲ和ＣＬＵＳＴＡＬ序列分析软件进行处理.２㊀结果２ １㊀ＣＭＩＡ法检测结果采用ＣＭＩＡ法对２１８份人血清中ＨＡＶ的检测结果显示ꎬ共有３个血清样本为ＨＡＶＩｇＭ抗体反应性ꎬ包括８７号㊁８９号和１９８号ꎬ其Ｓ/ＣＯ值分别为２ ２２㊁４ １５㊁１ ３１.２ ２㊀实时荧光ＲＴ－ＰＣＲ法检测结果采用实时荧光ＲＴ－ＰＣＲ法对２１８份人血清中ＨＡＶＲＮＡ的检测结果显示ꎬＩＳＯ方法中共有７个样本(１７号㊁１８号㊁２３号㊁３２号㊁８７号㊁８９号㊁２０１号)为阳性ꎬＦＤＡ方法中有５个样本(２３号㊁３２号㊁８７号㊁８９号㊁２０１号)为阳性ꎬＧＢ方法中仅有４个样本(３２号㊁８７号㊁８９号㊁２０１号)为阳性.三种方法对于相同样本的检测Ｃｔ值比较结果为:Ｃｔ(ＩＳＯ)<Ｃｔ(ＦＤＡ)<Ｃｔ(ＧＢ)(表２和图１)ꎬ表明ＩＳＯ方法的检测灵敏度最高.表２㊀实时荧光ＲＴ－ＰＣＲ检测结果样品编号收集日期Ｃｔ值ＩＳＯ方法ＦＤＡ方法ＧＢ方法１７８/１９/２０１６３６.９８ʃ０.２７－－１８８/２０/２０１６３５.４０ʃ０.３３－－２３８/２０/２０１６３０.３１ʃ０.５７３７.５５ʃ０.６９－３２８/３０/２０１６２９.０８ʃ０.１１３３.１９ʃ０.５１３７.０３ʃ０.１４８７１０/２５/２０１６２２.３１ʃ０.４５２６.０７ʃ０.２２２８.０７ʃ０.３３７６㊀第１期㊀㊀麻丽丹ꎬ等:化学发光微粒子免疫检测法和实时荧光ＲＴ－ＰＣＲ法检测甲型肝炎病毒的比较分析图１㊀８７号样品实时荧光ＲＴ－ＰＣＲ检测结果图２㊀８９号样品实时荧光ＲＴ－ＰＣＲ检测结果图３㊀ＨＡＶ阳性对照实时荧光ＲＴ－ＰＣＲ检测结果２ ３㊀测序结果１７号样品测序结果ＡＡＡＧＴＴＴＴＴＴＣＣＡＡＡＡＴＧＴＴＡＧＡＡＡＣＡＧＴＴＴＴＴＡＡＴＴＧＧＣＡＡＡＴＧＧＡＴＴＣＣＡＧＡＡＴＧＡＴＧＧＡＧＣＴＧＡＧＡＡＣＴＣＡＧＡＧＣＴＴＴＴＣＣＡＡＴＴＧＧＴＴＡＡＧＡＧＡＣＡＴＴＴＧＴＴＣＡＧＧＡＡＴＴＡＣＴＡＴＴＴＴＴＡＡＡＡＧＴＴＴＴＡＡＧＧＡＴＧＣＣＡＴＡＴＡＴＴＧＧＣＴＡＴＡＴＡＣＡＡＡＡＴＴＧＡＡＧＧＡＴＴＴＴＴＡＴＧＡＡＧＴＡＡＡＴＴＡＴＧＧＴＡＡＧＡＡＧＡＡＧＧＡＴＡＴＴＣＴＴＡＡＣＡＴＴＣＴＴＡＡＡＧＡＴＡＡＣＣＡＡＣＡＡＡＡＡＡＴＡＧＡＡＡＡＡＧＣＣＡＴＴＧＡＡＧＡＡＧＣＡＧＡＣＡＡＴＴＴＴＴＧＣＡＴＴＴＴＧＣＡＡＡＴＴＣＡＡＧＡＴＧＴＡＧＡＡＡＡＡＴＴＴＧＡＴＣＡＧＴＡＴＣＡＧＡＡＡＧＧＧＧＴＴＧＡＴＴＴＧＡＴＡＣＡＡＡＡＡＣＴＧＡＧＡＡＣＴＧＴＣＣＡＴＴＣＡＡＴＧＧＣＴＣＡＡＧＴＣＧＡＣＣＣＴＡＡＣＣＴＧＡＧＧＧＴＴＣＡＴＴＴＧＴＣＡＣＣＴＣＴＣＡＧＡＧＡＴＴＧＣＡＴＡＧＣＣＡＧＡＧＴＴＣＡＴＣＡＡＡＡＧＣＴＣＡＡＧＡＡＴＣＴＴＧＧＡＴＣＴＡＴＡＡＡＴＣＡＧＧＣＣＡＴＧＧＴＧＡＣＡＡＧＡＴＧＴＧＡＧＣＣＡＧＴＴＧＴＴＴＧＣＴＡＴＴＴＡＴＡＴＧＧＣＡＡＡＡＧＡＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＡＧＡ１８号样品测序结果ＡＡＡＧＴＴＴＴＴＴＣＣＡＡＡＡＴＧＴＴＡＧＡＡＡＣＡＧＴＴＴＴＴＡＡＴＴＧＧＣＡＡＡＴＧＧＡＴＴＣＣＡＧＡＡＴＧＡＴＧＧＡＧＣＴＧＡＧＡＡＣＴＣＡＧＡＧＣＴＴＴＴＣＣＡＡＴＴＧＧＴＴＡＡＧＡＧＡＣＡＴＴＴＧＴＴＣＡＧＧＡＡＴＴＡＣＴＡＴＴＴＴＴＡＡＡＡＧＴＴＴＴＡＡＧＧＡＴＧＣＣＡＴＡＴＡＴＴＧＧＣＴＡＴＡＴＡＣＡＡＡＡＴＴＧＡＡＧＧＡＴＴＴＴＴＡＴＧＡＡＧＴＡＡＡＴＴＡＴＧＧＴＡＡＧＡＡＧＡＡＧＧＡＴＡＴＴＣＴＴＡＡＣＡＴＴＣＴＴＡＡＡＧＡＴＡＡＣＣＡＡＣＡＡＡＡＡＡＴＡＧＡＡＡＡＡＧＣＣＡＴＴＧＡＡＧＡＡＧＣＡＧＡＣＡＡＴＴＴＴＴＧＣＡＴＴＴＴＧＣＡＡＡＴＴＣＡＡＧＡＴＧＴＡＧＡＡＡＡＡＴＴＴＧＡＴＣＡＧＴＡＴＣＡＧＡＡＡＧＧＧＧＴＴＧＡＴＴＴＧＡＴＡＣＡＡＡＡＡＣＴＧＡＧＡＡＣＴＧＴＣＣＡＴＴＣＡＡＴＧＧＣＴＣＡＡＧＴＣＧＡＣＣＣＴＡＡＣＣＴＧＡＧＧＧＴＴＣＡＴＴＴＧＴＣＡＣＣＴＣＴＣＡＧＡＧＡＴＴＧＣＡＴＡＧＣＣＡＧＡＧＴＴＣＡＴＣＡＡＡＡＧＣＴＣＡＡＧＡＡＴＣＴＴＧＧＡＴＣＴＡＴＡＡＡＴＣＡＧＧＣＣＡＴＧＧＴＧＡＣＡＡＧＡＴＧＴＧＡＧＣＣＡＧＴＴＧＴＴＴＧＣＴＡＴＴＴＡＴＡＴＧＧＣＡＡＡＡＧＡＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＡＧＡＧＴＴＴＧＡＣＴＴＣ２３号样品测序结果ＡＡＡＧＴＴＴＴＴＴＣＣＡＡＡＡＴＧＴＴＡＧＡＡＡＣＡＧＴＴＴＴＴＡＡＴＴＧＧＣＡＡＡＴＧＧＡＴＴＣＣＡＧＡＡＴＧＡＴＧＧＡＧＣＴＧＡＧＡＡＣＴＣＡＧＡＧＣＴＴＴＴＣＣＡＡＴＴＧＧＴＴＡＡＧＡＧＡＣＡＴＴＴＧＴＴＣＡＧＧＡＡＴＴＡＣＴＡＴＴＴＴＴＡＡＡＡＧＴＴＴＴＡＡＧＧＡＴＧＣＣＡＴＡＴＡＴＴＧＧＣＴＡＴＡＴＡＣＡＡＡＡＴＴＧＡＡＧＧＡＴＴＴＴＴＡＴＧＡＡＧＴＡＡＡＴＴＡＴＧＧＴＡＡＧＡＡＧＡＡＧＧＡＴＡＴＴＣＴＴＡＡＣＡＴＴＣＴＴＡＡＡＧＡＴＡＡＣＣＡＡＣＡＡＡＡＡＡＴＡＧＡＡＡＡＡＧＣＣＡＴＴＧＡＡＧＡＡＧＣＡＧＡＣＡＡＴＴＴＴＴＧＣＡＴＴＴＴＧＣＡＡＡＴＴＣＡＡＧＡＴＧＴＡＧＡＡＡＡＡＴＴＴＧＡＴＣＡＧＴＡＴＣＡＧＡＡＡＧＧＧＧＴＴＧＡＴＴＴＧＡＴＡＣＡＡＡＡＡＣＴＧＡＧＡＡＣＴＧＴＣＣＡＴＴＣＡＡＴＧＧＣＴＣＡＡＧＴＣＧＡＣＣＣＴＡＡＣＣＴＧＡＧＧＧＴＴＣＡＴＴＴＧＴＣＡＣＣＴＣＴＣＡＧＡＧＡＴＴＧＣＡＴＡＧＣＣＡＧＡＧＴＴＣＡＴＣＡＡＡＡＧＣＴＣＡＡＧＡＡＴＣＴＴＧＧＡＴＣＴＡＴＡＡＡＴＣＡＧＧＣＣＡＴＧＧＴＧＡＣＡＡＧＡＴＧＴＧＡＧＣＣＡＧＴＴＧＴＴＴＧＣＴＡＴＴＴＡＴＡＴＧＧＣＡＡＡＡＧＡＧＧＧＧＧＧＧＧＧ３２号样品测序结果８６㊀㊀㊀辽宁大学学报㊀㊀自然科学版２０１８年㊀㊀ＡＡＧＡＡＧＡＡＧＧＡＴＡＴＴＣＴＴＡＡＣＡＴＴＣＴＴＡＡＡＧＡＴＡＡＣＣＡＡＣＡＡＡＡＡＡＴＡＧＡＡＡＡＡＧＣＣＡＴＴＧＡＡＧＡＡＧＣＡＧＡＣＡＡＴＴＴＴＴＧＣＡＴＴＴＴＧＣＡＡＡＴＴＣＡＡＧＡＴＧＴＡＧＡＡＡＡＡＴＴＴＧＡＴＣＡＧＴＡＴＣＡＧＡＡＡＧＧＧＧＴＴＧＡＴＴＴＧＡＴＡＣＡＡＡＡＡＣＴＧＡＧＡＡＣＴＧＴＣＣＡＴＴＣＡＡＴＧＧＣＴＣＡＡＧＴＣＧＡＣＣＣＴＡＡＣＣＴＧＡＧＧＧＴＴＣＡＴＴＴＧＴＣＡＣＣＴＣＴＣＡＧＡＧＡＴＴＧＣＡＴＡＧＣＣＡＧＡＧＴＣＣＡＴＣＡＡＡＡＧＣＴＣＡＡＧＡＡＴＣＴＴＧＧＡＴＣＴＡＴＡＡＡＴＣＡＧＧＣＣＡＴＧＧＴＧＡＣＡＡＧＡＴＧＴＧＡＧＣ８７号样品测序结果ＡＡＡＧＴＴＴＴＴＴＣＴＡＡＡＡＴＧＴＴＡＧＡＡＡＣＡＧＴＴＴＴＴＡＡＴＴＧＧＣＡＡＡＴＧＧＡＴＴＣＣＡＧＡＡＴＧＡＴＧＧＡＧＣＴＧＡＧＡＡＣＴＣＡＧＡＧＣＴＴＴＴＣＣＡＡＴＴＧＧＴＴＡＡＧＡＧＡＣＡＴＴＴＧＴＴＣＡＧＧＡＡＴＴＡＣＴＡＴＴＴＴＴＡＡＡＡＧＴＴＴＴＡＡＧＧＡＴＧＣＣＡＴＡＴＡＴＴＧＧＣＴＡＴＡＴＡＣＡＡＡＡＴＴＧＡＡＧＧＡＴＴＴＴＴＡＴＧＡＡＧＴＡＡＡＴＴＡＴＧＧＴＡＡＧＡＡＧＡＡＧＧＡＴＡＴＴＣＴＴＡＡＴＡＴＴＣＴＴＡＡＡＧＡＴＡＡＣＣＡＡＣＡＡＡＡＡＡＴＡＧＡＡＡＡＡＧＣＣＡＴＴＧＡＡＧＡＡＧＣＡＧＡＣＡＡＴＴＴＴＴＧＣＡＴＴＴＴＧＣＡＡＡＴＴＣＡＡＧＡＴＧＴＡＧＡＧＡＡＡＴＴＴＧＡＴＣＡＧＴＡＴＣＡＧＡＡＡＧＧＧＧＴＴＧＡＴＴＴＧＡＴＡＣＡＡＡＡＡＣＴＡＡＧＡＡＣＴＧＴＣＣＡＴＴＣＡＡＴＧＧＣＴＣＡＡＧＴＣＧＡＣＣＣＴＡＡＣＣＴＧＧＧＧＧＴＴＣＡＴＴＴＧＴＣＡＣＣＴＣＴＣＡＧＡＧＡＴＴＧＣＡＴＡＧＣＣＡＧＡＧＴＣＣＡＴＣＡＡＡＡＧＣＴＣＡＡＧＡＡＴＣＴＴＧＧＡＴＣＴＡＴＡＡＡＴＣＡＧＧＣＣＡＴＧＧＴＧＡＣＡＡＧＡＴＧＴＧＡＧＣＣＡＧＴＴＧＴＴＴＧＣＴＡＴＴＴＡＴＡＴＧＧＣＡＡＡＡＧＡＧＧＧＧＧＡＧＧＧＡＡＧＡＧＴＴＴＧＡＣＴＴＣＡＡＴＴＧＣＡＴＴＧＧＣＡＡＣＣＡＡＡＡＴＴＴＧＣＡＡＡＣＡＣＴＡＴＧＧＴＧＴＴＧＡ８９号样品测序结果ＡＴＴＡＣＴＡＴＴＴＴＴＡＡＡＡＧＴＴＴＴＡＡＧＧＡＴＧＣＣＡＴＡＴＡＴＴＧＧＣＴＡＴＡＴＡＣＡＡＡＡＴＴＧＡＡＧＧＡＴＴＴＴＴＡＴＧＡＡＧＴＡＡＡＴＴＡＴＧＧＴＡＡＧＡＡＧＡＡＧＧＡＴＡＴＴＣＴＴＡＡＣＡＴＴＣＴＴＡＡＡＧＡＴＡＡＣＣＡＡＣＡＡＡＡＡＡＴＡＧＡＡＡＡＡＧＣＣＡＴＴＧＡＡＧＡＡＧＣＡＧＡＣＡＡＴＴＴＴＴＧＣＡＴＴＴＴＧＣＡＡＡＴＴＣＡＡＧＡＴＧＴＡＧＡＡＡＡＡＴＴＴＧＡＴＣＡＧＴＡＴＣＡＧＡＡＡＧＧＧＧＴＴＧＡＴＴＴＧＡＴＡＣＡＡＡＡＡＣＴＧＡＧＡＡＣＴＧＴＣＣＡＴＴＣＡＡＴＧＧＣＴＣＡＡＧＴＣＧＡＣＣＣＴＡＡＣＣＴＧＡＧＧＧＴＴＣＡＴＴＴＧＴＣＡＣＣＴＣＴＣＡＧＡＧＡＴＴＧＣＡＴＡＧＣＣＡＧＡＧＴＴＣＡＴＣＡＡＡＡＧＣＴＣＡＡＧＡＡＴＣＴＴＧＧＡＴＣＴＡＴＡＡＡＴＣＡＧＧＣＣＡＴＧＧＴＧＡＣＡＡＧＡＴＧＴＧＡＧＣＣＡＧＴＴＧＴＴＴＧＣＴＡＴＴＴＡＴＡＴＧＧＣＡＡＡＡＧＡＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＡＧＡＧＴＴＴＧＡＣＴＴＣＡＡＴＴＧＣ１９８号样品测序结果ＡＡＡＧＴＴＴＴＴＴＣＣＡＡＡＡＴＧＴＴＡＧＡＡＡＣＡＧＴＴＴＴＴＡＡＴＴＧＧＣＡＡＡＴＧＧＡＴＴＣＣＡＧＡＡＴＧＡＴＧＧＡＧＣＴＧＡＧＡＡＣＴＣＡＧＡＧＣＴＴＴＴＣＣＡＡＴＴＧＧＴＴＡＡＧＡＧＡＣＡＴＴＴＧＴＴＣＡＧＧＡＡＴＴＡＣＴＡＴＴＴＴＴＡＡＡＡＧＴＴＴＴＡＡＧＧＡＴＧＣＣＡＴＡＴＡＴＴＧＧＣＴＡＴＡＴＡＣＡＡＡＡＴＴＧＡＡＧＧＡＴＴＴＴＴＡＴＧＡＡＧＴＡＡＡＴＴＡＴＧＧＴＡＡＧＡＡＧＡＡＧＧＡＴＡＴＴＣＴＴＡＡＣＡＴＴＣＴＴＡＡＡＧＡＴＡＡＣＣＡＡＣＡＡＡＡＡＡＴＡＧＡＡＡＡＡＧＣＣＡＴＴＧＡＡＧＡＡＧＣＡＧＡＣＡＡＴＴＴＴＴＧＣＡＴＴＴＴＧＣＡＡＡＴＴＣＡＡＧＡＴＧＴＡＧＡＡＡＡＡＴＴＴＧＡＴＣＡＧＴＡＴＣＡＧＡＡＡＧＧＧＧＴＴＧＡＴＴＴＧＡＴＡＣＡＡＡＡＡＣＴＧＡＧＡＡＣＴＧＴＣＣＡＴＴＣＡＡＴＧＧＣＴＣＡＡＧＴＣＧＡＣＣＣＴＡＡＣＣＴＧＡＧＧＧＴＴＣＡＴＴＴＧＴＣＡＣＣＴＣＴＣＡＧＡＧＡＴＴＧＣＡＴＡＧＣＣＡＧＡＧＴＴＣＡＴＣＡＡＡＡＧＣＴＣＡＡＧＡＡＴＣＴＴＧＧＡＴＣＴＡＴＡＡＡＴＣＡＧＧＣＣＡＴＧＧＴＧＡＣＡＡＧＡＴＧＴＧＡＧＣＣＡＧＴＴＧＴＴＴＧＣＴＡＴＴＴＡＴＡＴＧＧＣＡＡＡＡＧＡＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＡＧＡＧＴＴＴＧＡＣＴＴＣＡＡＴＴ２０１号样品测序结果ＡＧＴＴＴＴＴＴＣＣＡＡＡＡＴＧＴＴＡＧＡＡＡＣＡＧＴＴＴＴＴＡＡＴＴＧＧＣＡＡＡＴＧＧＡＴＴＣＣＡＧＡＡＴＧＡＴＧＧＡＧＣＴＧＡＧＡＡＣＴＣＡＧＡＧＣＴＴＴＴＣＣＡＡＴＴＧＧＴＴＡＡＧＡＧＡＣＡＴＴＴＧＴＴＣＡＧＧＡＡＴＴＡＣＴＡＴＴＴＴＴＡＡＡＡＧＴＴＴＴＡＡＧＧＡＴＧＣＣＡＴＡＴＡＴＴＧＧＣＴＡＴＡＴＡＣＡＡＡＡＴＴＧＡＡＧＧＡＴＴＴＴＴＡＴＧＡＡＧＴＡＡＡＴＴＡＴＧＧＴＡＡＧＡＡＧＡＡＧＧＡＴＡＴＴＣＴＴＡＡＣＡＴＴＣＴＴＡＡＡＧＡＴＡＡＣＣＡＡＣＡＡＡＡＡＡＴＡＧＡＡＡＡＡＧＣＣＡＴＴＧＡＡＧＡＡＧＣＡＧＡＣＡＡＴＴＴＴＴＧＣＡＴＴＴＴＧＣＡＡＡＴＴＣＡＡＧＡＴＧＴＡＧＡＡＡＡＡＴＴＴＧＡＴＣＡＧＴＡＴＣＡＧＡＡＡＧＧＧＧＴＴＧＡＴＴＴＧＡＴＡＣＡＡＡＡＡＣＴＧＡＧＡＡＣＴＧＴＣＣＡＴＴＣＡＡＴＧＧＣＴＣＡＡＧＴＣＧＡＣＣＣＴＡＡＣＣＴＧＡＧＧＧＴ９６㊀第１期㊀㊀麻丽丹ꎬ等:化学发光微粒子免疫检测法和实时荧光ＲＴ－ＰＣＲ法检测甲型肝炎病毒的比较分析０７㊀㊀㊀辽宁大学学报㊀㊀自然科学版２０１８年㊀㊀３㊀讨论两种方法比较结果显示ꎬＣＩＭＡ法与实时荧光ＲＴ－ＰＣＲ法共有２个阳性样本(８７号㊁８９号)的检测结果一致ꎬ有１个样本(１９８号)为ＣＭＩＡ法阳性结果ꎬ实时荧光ＲＴ－ＰＣＲ法为阴性结果ꎬ另有５个样本(１７号㊁１８号㊁２３号㊁３２号㊁２０１号)为实时荧光ＲＴ－ＰＣＲ法阳性结果ꎬＣＩＭＡ法阴性结果.对可疑的８个阳性样本(１７号㊁１８号㊁２３号㊁３２号㊁８７号㊁８９号㊁１９８号㊁２０１号)的测序结果显示ꎬ实时荧光ＲＴ－ＰＣＲ法检测阳性的７个样本(１７号㊁１８号㊁２３号㊁３２号㊁８７号㊁８９号㊁２０１号)测序结果均为ＨＡＶ阳性ꎬＣＭＩＡ法检测阳性的１个样本(１９８号)测序结果为ＨＡＶ阴性.采用ＣＭＩＡ法检测出现１个假阳性结果和５个假阴性结果ꎬ说明该方法检测结果存在假阳性和假阴性问题.ＨＡＶ检测的假阳性结果在其他实验室也有报道[１ꎬ９]ꎬ其原因可能为血清中的Ｉｇｓ与包被ＨＡＶ的微粒子具有交叉反应和非特异性结合.ＰＣＲ方法为一种快速灵敏的诊断技术ꎬ该检测方法对于实验室的标准要求很高ꎬ以避免由于核酸或扩增产物污染引起的假阳性[１０－１１].近年来ꎬＰＣＲ检测方法在许多医院和研究机构得以广泛应用[１２－１３]ꎬ但是到现在为止ꎬ尚未有采用ＰＣＲ检测人血清中ＨＡＶ的标准方法.本研究对食品中ＨＡＶ检测的三种引物探针组合进行了评估ꎬ其中ＩＳＯ方法灵敏度最高ꎬ采用该方法中的引物探针对人血清中ＨＡＶ的检测结果显示ꎬ该方法检测结果准确ꎬ灵敏高ꎬ可应用于人血清中的ＨＡＶ的检测.参考文献:[１]㊀ＰａｒｋＨꎬＬｅｅＹＪꎬＳｅｏｎｇＭＷꎬｅｔａｌ.Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆ３ａｕｔｏｍａｔｅｄｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓｆｏｒｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆａｎｔｉ－ｈｅｐａｔｉｔｉｓＡｖｉｒｕｓｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎＭｉｎａｔｅｒｔｉａｒｙｃａｒｅｈｏｓｐｉｔａｌ[Ｊ].ＡｎｎＬａｂＭｅｄꎬ２０１３ꎬ３３(２):１２１－１２４.[２]㊀徐德顺ꎬ卢亦愚ꎬ严菊英ꎬ等.甲肝病毒ＴａｑＭａｎＰＣＲ检测方法的建立[Ｊ].中国预防医学杂志ꎬ２００７ꎬ８(３):２２９－２３２.[３]㊀向金华.从急性甲型肝炎患者血清中检测ＨＡＶＲＮＡ[Ｊ].国际流行病学传染病学杂志ꎬ１９９０ꎬ(２):８７－８８. [４]㊀ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＯｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎｆｏｒＳｔａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎ.ＩＳＯ/ＴＳ１５２１６￣２:２０１３.Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙｏｆｆｏｏｄａｎｄａｎｉｍａｌｓｆｅｅｄ~ｈｏｒｉｚｏｎｔａｌｍｅｔｈｏｄｆｏｒｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｈｅｐａｔｉｔｉｓＡｖｉｒｕｓａｎｄｎｏｒｏｖｉｒｕｓｉｎｆｏｏｄｕｓｉｎｇｒｅａｌ￣ｔｉｍｅＲＴ￣ＰＣＲ￣ｐａｒｔ２:ｍｅｔｈｏｄｆｏｒｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎ.Ｇｅｎｅｖａ:ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＯｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎｆｏｒＳｔａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎꎬ２０１３.[５]㊀ＦｏｏｄａｎｄＤｒｕｇＡｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ.ＢＡＭ２６Ｂ:ＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＨｅｐａｔｉｔｉｓＡＶｉｒｕｓｉｎＦｏｏｄｓ[Ｓ].ＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓｏｆＡｍｅｒｉｃａ:ＦｏｏｄａｎｄＤｒｕｇＡｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎꎬ２０１４.[６]㊀标准化管理委员会.ＧＢ/Ｔ２２２８７ ２００８贝类中ＨＡＶ检测方法:普通ＲＴ~ＰＣＲ方法和实时荧光ＲＴ－ＰＣＲ方法[Ｓ].北京:中国标准出版社ꎬ２００８.[７]㊀ＭａｒｋｓＶ.Ｆａｌｓｅ￣ｐｏｓｉｔｉｖｅｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｒｅｓｕｌｔｓ:ａｍｕｌｔｉｃｅｎｔｅｒｓｕｒｖｅｙｏｆｅｒｒｏｎｅｏｕｓｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｒｅｓｕｌｔｓｆｒｏｍａｓｓａｙｓｏｆ７４ａｎａｌｙｔｅｓｉｎ１０ｄｏｎｏｒｓｆｒｏｍ６６ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓｉｎｓｅｖｅｎｃｏｕｎｔｒｉｅｓ[Ｊ].ＣｌｉｎＣｈｅｍꎬ２００２ꎬ４８(１１):２００８－２０１６. [８]㊀白冰珂ꎬ胡燕ꎬ邬顺全ꎬ等.１株快速增殖的ＨＡＶ分离株基因型分析[Ｊ].传染病信息ꎬ２０１５ꎬ２８(３):２２９－２３２. [９]㊀ＲａｈａｌｉｓｏｎＬꎬＶｏｌｏｌｏｎｉｒｉｎａＥꎬＲａｔｓｉｔｏｒａｈｉｎａＭꎬｅｔａｌ.ＤｉａｇｎｏｓｉｓｏｆｂｕｂｏｎｉｃｐｌａｇｕｅｂｙＰＣＲｉｎＭａｄａｇａｓｃａｒｕｎｄｅｒｆｉｅｌｄｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ[Ｊ].ＪＣｌｉｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌꎬ２０００ꎬ３８(１):１５５－１５９.[１０]㊀ＢｏｒｓｔＡꎬＢｏｘＡＴꎬＦｌｕｉｔＡＣ.Ｆａｌｓｅ￣ｐｏｓｉｔｉｖｅｒｅｓｕｌｔｓａｎｄｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎｉｎｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎａｓｓａｙｓ:ｓｕｇｇｅｓｔｉｏｎｓｆｏｒａｐｒｅｖｅｎｔａｎｄｄｅｓｔｒｏｙｓｔｒａｔｅｇｙ[Ｊ].ＥｕｒＪＣｌｉｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌＩｎｆｅｃｔＤｉｓꎬ２００４ꎬ２３(４):２８９－２９９. [１１]㊀ＨｕｈＨＪꎬＰａｒｋＫＳꎬＫｉｍＪＹꎬｅｔａｌ.ＣｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｔｈｅＡｎｙｐｌｅｘＴＭＩＩＲＶ１６ａｎｄＳｅｅｐｌｅｘ®ＲＶ１２ＡＣＥａｓｓａｙｓｆｏｒｔｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｖｉｒｕｓｅｓ[Ｊ].ＤｉａｇｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌＩｎｆｅｃｔＤｉｓꎬ２０１４ꎬ７９(４):４１９－４２１.[１２]㊀ＴöｒöｋＭＥꎬＰｅａｃｏｃｋＳＪ.Ｒａｐｉｄｗｈｏｌｅ￣ｇｅｎｏｍｅｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｏｆｂａｃｔｅｒｉａｌｐａｔｈｏｇｅｎｓｉｎｔｈｅｃｌｉｎｉｃａｌｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙｌａｂｏｒａｔｏｒｙ￣ｐｉｐｅｄｒｅａｍｏｒｒｅａｌｉｔｙ[Ｊ].ＪＡｎｔｉｍｉｃｒｏｂＣｈｅｍｏｔｈｅｒꎬ２０１２ꎬ６７(１０):２３０７－２３０８.。
荧光定量PCR检测肝病患者血清HBV-DNA的对比研究
荧光定量PCR检测肝病患者血清HBV-DNA的对比研究摘要】目的对荧光定量PCR检测肝病患者血清HBV-DNA的进行对比分析。
方法选取2008年12月—2012年12月我院收治的肝病患者肝病患者126例，依据患者情况分为两组患者，甲组患者62例，患者为病毒性肝炎患者；乙组患者64例，为非病毒性肝炎患者，均采用荧光定量PCR检测肝病患者血清HBV-DNA。
结果乙组患者的血清HBV-DNA含量显著低于乙组患者，差异性显著，具有统计学意义（P<0.05）。
乙组患者HBeAg阳性率显著低于甲组患者，差异性显著，具有统计学意义（P<0.05）。
结论采用荧光定量PCR检测肝病患者血清HBV-DNA，可更加明确的反应出人机体内病毒增加复制的情况，同时更加直接的反应患者所携带病毒量水平。
【关键词】荧光定量 PCR检测肝病患者血清HBV-DNA 病毒性肝炎非病毒性肝炎【中图分类号】R446 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2013）22-0198-01酶联免疫吸附法(ELISA)是临床诊断乙型肝炎病毒(HBV)感染的传统手段，是根据人体对乙型肝炎病毒的免疫反应状态不同，检测乙肝病毒血清免疫标志物，间接反应HBV—DNA的复制情况。
荧光实时定量PCR是对HBV的复制直接进行定量检测，能够从分子水平准确了解乙肝病毒在体内的复制情况[1]。
本文中对我院收治的肝病患者126例的临床治疗资料，进行回顾性分析，现将结果报告如下。
1 资料与方法1.1一般临床资料选取2008年12月—2012年12月我院收治的肝病患者肝病患者126例，其中男性患者54例，女性患者72例，年龄25—72岁，平均年龄（30.50±3.50）岁，病程时间2个月—5年，平均病程（2.50±1.00）年，依据患者的临床症状、体征和相关检查结果均获得明确诊断。
依据患者情况分为两组患者，对比两组患者的性别、年龄、体重等无显著性差异，（P>0.05）。
甲型肝炎病毒实时荧光定量PCR检测方法的比较
甲型肝炎病毒实时荧光定量PCR检测方法的比较邱丰;郭敏卓;伊瑶;贾志远;苏秋东;毕胜利【期刊名称】《医学研究杂志》【年(卷),期】2013(042)004【摘要】Objective To compare our in - house detection and quantification system of hepatitis A virus ( HAV ) with another two commercial quantitative real - time PCR kits. Methods The in - house HAV detection method developed in our laboratory was based on the amplification of the highly conserved 5' - noncoding region. Single - stranded RNA transcripts synthesized in vitro were used as quantification standard. Dilutions of an HAV vaccine strain ranging from 10-8 to 10-1 were prepared to determine the precision, accuracy, sensitivity , and specificity of this assay. Results Our in - house TaqMan based real - time PCR assay was suitable for measurement of HAV RNA and had a detection limit of 10 TCID50/ml. This assay was more sensitive and specific than one of the domestic commercial quantitative PCR kit. However, another assay, the Artus HAV RT - PCR kit from Qiagen (Germany) , had the best performance among these 3 assays and its detection limit achieved 5 TCID50/ml. Conclusion Considering the high reproducibility, sensitivity, and specificity, our novel amplification system could be widely applied to detect HAV in clinical, environmental, and food samples.%目的比较本实验室内部建立的甲型肝炎病毒核酸定量体系和另外两个商品化实时荧光定量PCR检测试剂盒的检测效果.方法本实验室内部建立的HAV核酸检测系统选取HAV基因组的高保守区段5 ′非编码区作为扩增靶点,定量标准品采用体外转录获得的RNA分子,HAV疫苗株储存液倍比稀释成10-8 ～ 10-1后提取RNA作为模板用以比较该反应体系与市售商品化试剂盒的准确性、灵敏度以及特异性.结果本实验室内部建立的HAV核酸检测体系十分适宜于HAV的检测,最低检测极限达到10 TCID50/ml,比国内某厂商生产的HAV定量PCR检测试剂要灵敏,然而Qiagen公司的RealArt HAV LC RT-PCR检测试剂效果最好,其检测极限可以达到5 TCID50/ml.结论本实验室内部建立的HAV核酸定量体系可重复性好,敏感度高,特异性强,在临床样本,环境样本以及食品样本的检测方面具有广阔的应用前景.【总页数】4页(P81-84)【作者】邱丰;郭敏卓;伊瑶;贾志远;苏秋东;毕胜利【作者单位】102206北京,中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所【正文语种】中文【相关文献】1.2种猪圆环病毒2型TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立及比较 [J], 周忠涛;王小敏;汪伟;茅爱华;温立斌;倪艳秀;何孔旺2.隐孢子虫三种实时荧光定量PCR检测方法的比较 [J], 宋悦;韩先干;陈兆国;赵权;黄燕;米荣升;游艳敏;贾海燕;程龙;张烨华;张晓丽3.鸭甲型肝炎病毒1型抗体CLEIA检测方法的建立 [J], 银凤桂;侯力丹;魏艳秋;杨宝芝;李芸;李晶;张爽;刘文军;杨利敏4.小浆果中食源性甲型肝炎病毒和诺如病毒流行状况及检测方法的研究进展 [J], 冯华炜; 艾海新; 杨天舟; 齐梦园; 谭燕妮; 麻丽丹; 刘宏生5.鸭甲型肝炎病毒1型与3型双重TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用 [J], 林梦舟;吴双;徐建生;谢军;吴植;姜勇;朱善元因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
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Ｅ ＭＭＰ Ｒ Ｉ Ｎ表 达 增 加 ， 通过 细胞 间相 互作 用 ， Ｅ Ｍ Ｍ．
Ｓ ａ ｎ ｃ ｈ ｅ ｚ—Ｇａ ｌ ａ ｎ Ｅ，Ｇｏ ｍｅ ｚ—Ｈｅ ｍａ ｎ ｄ ｅ ｚ Ａ，Ｖｉ ｄ ａ ｌ Ｃ，ｅ ｔ ａ １ ．Ｌ ｅ ｕ ｋ ｏ ｔ — ｉｅ ｒ ｎ ｅ Ｂ ４ ｅ ｎ ｈ ａ ｎ ｃ ｅ ｓ ｔ ｈ ｅ ａ ｃ ｔ ｉ ｖ ｉ ｔ ｙ ｏ ｆ ｎ ｕ ｃ ｌ ｅ ａ ｒ ｆ ａ ｃ ｔ ｏ ｒ—ｋ ａ ｐ ｐ ａ Ｂ ｐ ａ ｔ ｈ ｗａ ｙ
誊
Ｂａ ｃ ｋ Ｍ ．Ｉ ｎ ｌａ ｆ ｍｍａ ｔ ｏ ｒ ｙ ｓ ｉ ｇ ｎ ａ ｌ ｉ ｎ ｇ ｔ ｈ ｒ ｏ ｕ ｇ ｈ ｌ ｅ ｕ ｋ ｏ ｔ ｉｅ ｒ ｎ ｅ ｒ ｅ ｃ ｅ ｐ ｔ ｏ ｒ ｓ ｉ ｎ ａ ｔ ｈ —
关 引。有 研究 报 道 ， 白三 烯 通 过 Ｅ Ｒ Ｋ １ ／ ２ 、 Ｐ ３ ８途 径
ＬＰ ｉ ｎ ｍｏ ｎ ｏ ｃ ｙ ｔ ｅ ｃ ｈ ｅ ｍｏ ｔ ａ ｘ ｉ ｓ． ａ ｎ ｄ ｉ ｔ ｃ ｏ ｏ ｐ ｅ ｒ ａ ｔ ｅ ｓ ｗｉ ｔ ｈ ｔ ｈ ｅ Ｔ Ｌ Ｒ ｌ ｉ ｇ ａ ｎ ｄ
路 抑制 剂 Ｓ Ｂ ２ ０ ３ ５ ８ ０阻断 了 ＭＭＰ一 ９的分泌 。细胞外 基 质金 属蛋 白酶诱 导 因子 （ Ｅ ＭＭＰ Ｒ Ｉ Ｎ） 在 体 内广 泛表 达 于造 血及非 造 血 细 胞 ， 并参 与 多种 疾 病 的发 生 、 发
Ｒ ｅ ｓ ， ２ ０ ０ ９ ， ８ １ （ １ ）： ２ １ ６— ２ ２ ５
８
２的 表 达 。 因 此 ， ＭＡ Ｐ Ｋ ｓ信 号 通 路 在 调 节 Ｅ Ｍ Ｍ—
我们 研究 发现 ， Ｌ Ｔ Ｂ ４是通 过 ＭＡ Ｐ Ｋ的 ３条途 径 ，
Ｙｏ ｏ ｎ ＹＷ ，Ｋｗｏ ｎ ＨＭ ，Ｈｗａ ｎ ｇ ＫＣ，ｅ ｔ ａ １ ． Ｕｐ ｓ ｔ ｒ ｅ ａ ｍ ｒ ｅ ｇ ｕ ｌ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ ｍａ — ｔ ｒ ｉ ｘ ｍｅ ｔ ａ ｌ ｌ ｏ ｐ ｒ ｏ ｔ ｅ ｉ ｎ ａ ｓ ｅ ｂ ｙ ＥＭＭＰ ＲＩ Ｎ；ｅ ｘ ｔ ｒ ａ ｃ ｅ ｌ ｌ ｕ ｌ ａ ｒ ｍａ ｔ ｉ ｒ ｘ ｍｅ ｔ ａ ｌ ｌ ｏ ｐ ｒ ｏ －
５
Ｚｈ ｏ ｕ Ｇ ，Ｇｅ Ｓ，Ｌ ｉ ｕ Ｄ，ｅ ｔ ａ １ ．Ａｔ ｏ ｒ ｖ ａ ｓ ｔ ａ ｔ ｉ ｎ ｒ ｅ ｄ ｕ ｃ ｅ ｓ ｐ ｌ ａ ｑ ｕ ｅ ｖ ｕ ｌ ｎ ｅ ｒ ａ ｂ ｉ ｌ ｉ ｔ ｙ ｉ ｎ ａ ｎ ａ ｔ ｈ ｅ ｒ ｏ ｓ ｃ ｌ ｅ ｒ ｏ ｔ ｉ ｃ ｒ ａ ｂ ｂ ｉ ｔ ｍｏ ｄ ｅ ｌ ｂ ｙ ａ ｌ ｔ ｅ ｉｎ ｒ ｇ ｔ ｈ ｅ ５ 一ｌ ｉ ｐ ｏ ｘ ｙ ｇ ｅ ｎ ａ ｓ ｅ
医 学 研 究 杂志 ２ ０ １ ３ 年４ 月 第４ ２ 卷 第４ 期
作用 ， 它 主要包 括 Ｅ Ｒ Ｋ、 Ｐ ３ ８ 、 Ｊ Ｎ Ｋ ３条通 路 ， Ｍ Ａ Ｐ Ｋ的
３条 通路 （ Ｅ Ｒ Ｋ、 Ｐ ３ ８ 、 Ｊ Ｎ Ｋ） 与 ＭＭＰ一 ９的表 达 明显相
４
论
Ｃ ａ ｒ ｄ ｉ ｏ ｖ ａ ｓ ｃ Ｄ ｕｇ ｒ ｓ Ｔ ｈ ｅ ｒ ， ２ ０ ０ ９ 。 ２ ３ （ １ ）： ４ １ — ４ ８
促进小 鼠巨噬细胞株 Ｊ ７ ７ ４ Ａ． １细 胞 系 表 达 ＭＭ Ｐ一
９［ １ １ ］
。
ｅ ｒ ｏ ｓ ｃ ｈｒ ｏ ｓ ｉ ｓ ［ Ｊ ］ ．Ｃ ｕ ｒ ｒ Ａ ｔ ｈ ｅ ｒ ｏ ｓ ｃ ｌ ｅ ｒ Ｒ ｅ ｐ ， ２ ０ ０ ８ ， １ ０ （ ３ ） ： ２ ４ ４— ２ ５ ｌ
展 的病理 过程 ， 如 冠状 动脉 粥样 硬化 过程 中 的细胞 分
Ｌ Ｐ Ｓ ｖ ｉ ａ ｉ ｎ ｄ ｕ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ Ｃ Ｘ Ｃ Ｌ ８ ［ Ｊ ］ ．Ｊ Ｌ ｅ ｕ ｋ ｏ ｃ Ｂ ｉ ｏ ｌ ， ２ ０ ０ ９， ８ ６ （ ３ ） ： ６ ７ １ —
Ｐ Ｒ Ｉ Ｎ 和 ＭＭＰ ｓ 过程 中起 着重 要 的作用 。
即 Ｐ ３ ８ 、 Ｊ Ｎ Ｋ、 Ｅ Ｒ Ｋ来上调 Ｅ ＭＭＰ Ｒ Ｉ Ｎ的表 达 ， Ｅ ＭＭ． Ｐ Ｒ Ｉ Ｎ 的上调 导 致 ＭＭ Ｐ一９表 达增 加 ， 从 而 促 进 动 脉
Ｐ Ｒ Ｉ Ｎ可刺激 单 核 细 胞 ＭＭＰ一９及 平 滑 肌 细胞 ＭＭ Ｐ
一
ｔ ｈ ｒ ｏ ｕ ｇ ｈ Ｂ Ｌ Ｔ １ ａ ｎ ｄ Ｂ Ｌ Ｔ ２ ｒ ｅ ｃ ｅ ｐ ｔ ｏ ｒ ｓ ｉ ｎ ａ ｔ ｈ ｅ ｒ ｏ ｓ ｃ ｌ ｅ ｒ ｏ ｓ ｉ ｓ ［ Ｊ ］ ．Ｃ ａ ｒ ｄ ｉ ｏ ｖ ａ ｓ ｃ
Ｓ ｉ ｍ ｏ ｎ等研 究 发现 ， 在 体外 侵 袭 实 验 中 ， Ｐ ３ ８通
６
ｐ ａ ｔ ｈ ｗ ａ ｙ ［ Ｊ ］ ．Ｃ ａ ｒ ｄ ｉ ｏ ｌ ｏ ｇ ｙ ， ２ ０ １ ０ ， １ １ ５ （ ３ ） ： ２ ２ １— ２ ２ ８
Ｇｏ ｕ ｗｙ Ｍ ，Ｓ ｔ ｕｙ ｒ ｆ Ｓ，Ｖｅ ｒ ｂ ｅ ｋ ｅ Ｈ，ｅ ｔ ａ １ ．ＣＣ ｅ ｈ ｅ ｍｏ ｋ ｉ ｎ ｅ ｌ ｉ ｇ ａ ｎ ｄ一２ ｓ ｙ ｎ — ｅ ｒ ｇ ｉ ｚ ｅ ｓ ｗｉ ｔ ｈ ｔ ｈｅ ｎ ｏ ｎ ｃ ｈ ｅ ｍｏ ｋ ｉ ｎ ｅ Ｇ ｐ ｒ ｏ ｔ ｅ ｉ ｎ— － ｃ ｏ ｕ ｐ ｌ ｅ ｄ ｒ ｅ ｃ ｅ ｐ ｔ ｏ ｒ ｌ ｉ ｇ ａ ｎ ｄ ｆ Ｍ－