实验电子显微镜技术

细胞器的分离

河北大学细胞生物学实验室

细胞器的分离

细胞由细胞膜、细胞核和细胞质组成，细胞质中含有若干细胞器和细胞骨架等，这些也称作亚细胞组分。对于细胞的结构和功能的研究，是细胞生物学的基本课题，其重要的研究手段之一是分离纯的亚细胞组分，观察它们的结构或进行生化分析。分离亚细胞组分的方法主要有差速离心和密度梯度离心。

差速离心

(differential centrifugation)

■在密度均一的介质中由低速到高速逐级离心, 用于分离不同大小的细胞和细胞器。

速度逐渐提高，样品按大小先后沉淀

差速离心

■在差速离心中细胞器沉降的顺序依次为：核、线粒体、溶酶体与过氧化物酶体、内质网与高基体、最后为核蛋白体。

■由于各种细胞器在大小和密度上相互重叠，而且某些慢沉降颗粒常常被快沉降颗粒裹到沉淀块中, 一般重复2〜3次效果会好一些。

■差速离心只用于分离密度和大小悬殊的细胞，更多用于分离细胞器。对于精细的分离，则是密度梯度离心效果更好。

(density gradient centrifugation )

■用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度 鵬

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■这类分离又可分为速度沉降和等密度沉降平衡两种。

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■速度沉降(velocity sedimentation)主要用于分离密度相近而大小不等的细胞或细胞器。这种沉降方法所采用的介质密度较低，介质的最大密度应小于被分离生物颗粒的最小密度。生物颗粒(细胞或细胞器)在十分平缓的密度梯度介质中按各自的沉降系数以不同的速度沉降而达到分离。■等密度沉降(isopycnic sedimentation)适用于分离密度不等的颗粒。细胞或细胞器在连续梯度的介质中经足够大离心力和足够长时间则沉降或漂浮到与自身密度相等的介质处，并停留在那里达到平衡，从而将不同密度的细胞或细胞器分离。介质的最高密度应大于被分离组分的最大密度，而且介质的梯度要求较高的陡度，不能太平缓。这种方法适于分离细胞器，而不太适于分离和纯化细胞。

叶绿体的分离

实验方法

1•选取新鲜的嫩菠菜叶片，洗净擦干后去除叶梗和粗脉，撕成小碎块，称3g放于玻璃匀浆器中，加入

10ml 0.35M NaCl 溶液，匀浆3〜5min。

2.匀浆液用4层纱布过滤于50ml烧杯中。

3.将滤液平分到2个离心管中，天平配平，1 000r/min

下离心2min。弃去沉淀。

4.将上清液在3 000r/min下离心5min。弃去上清，沉

淀即为叶绿体。

5.将沉淀用0.35M NaCl溶液悬浮，取一滴叶绿体悬

液滴于载片上，加盖片观察：

①在普通光镜下观察；②在荧光显微镜下观察。