感受态细胞的制备的实验步骤

一、CaCl2感受态细胞的制备的实验步骤

1．前夜接种受体菌(DH5α或DH10B)，挑取单菌落于LB培养基中37℃摇床培养过夜(约16小时)；

2．取1ml过夜培养物转接于100ml LB培养基中，在37℃摇床上剧烈振荡培养约2.5-3小时(250-300rpm)；

3．将0.1M CaCl2溶液置于冰上预冷；

以下步骤需在超净工作台和冰上操作

4．吸取1.5ml培养好的菌液至1.5ml离心管中，在冰上冷却10分钟；

5．4℃下3000rpm冷冻离心5分钟；

6．弃去上清，加入100μl预冷0.1M CaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮，在冰上放置20分钟；

7．4℃下3000rpm冷冻离心5分钟；

8．弃去上清，加入100μl预冷0.1M CaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮；

9．细胞悬浮液可立即用于转化实验或添加冷冻保护剂(15% - 20%甘油)后超低温冷冻贮存备用(－70℃)。

二、电转化法制备大肠杆菌感受态细胞的实验步骤

1．前夜接种受体菌(DH5α或DH10B)，挑取单菌落于LB培养基中37℃摇床培养过夜；

2．取2ml过夜培养物转接于200ml LB培养基中，在37℃摇床上剧烈振荡培养至OD600 =0.6(约2.5-3小时)；

3．将菌液迅速置于冰上。

以下步骤务必在超净工作台和冰上操作

4．吸取1.5ml培养好的菌液至1.5ml离心管中，在冰上冷却10分钟；

5．4℃下3000rpm冷冻离心5分钟；

6．弃去上清，加入1500μl冰冷的10%甘油，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮；

7．4℃下3000rpm冷冻离心5分钟

8．弃去上清，加入750μl冰冷的10%甘油，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮；

9．4℃下3000rpm冷冻离心5分钟

10．加入20μl冰冷10%的甘油，用移液器轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮；

11．立即使用或迅速置于-70℃超低温保存。

三、影响感受态细胞转化效率的因素及实际操作过程中应注意的事项：

1．细菌的生长状态：实验中应密切注视细菌的生长状态和密度，尽量使用对数生长期的细胞(一般通过检测OD600来控制。DH5α菌株OD600为0.5 时细胞密度是5 × 107 /ml)；

2．所有操作均应在无菌条件和冰上进行；

3．经CaCl2处理的细胞，在低温条件下，一定的时间内转化率随时间的推移而增加，24小时达到最高，之后转化率再下降(这是由于总的活菌数随时间延长而减少造成的)；

4．化合物及无机离子的影响：在Ca2+的基础上联合其他二价金属离子(如Mn2+或Co2+ )、DMSO 或还原剂等物质处理细菌，可使转化效率大大提高(100-1000 倍)；

5．所使用的器皿必须干净。迹量的去污剂或其它化学物质的存在可能大大降低细菌的转化效率；

6．质粒的大小及构型的影响：用于转化的应主要是超螺旋的DNA ；

7．一定范围内，转化效率与外源DNA 的浓度呈正比。