微量淋巴细胞毒试验操作规程

微量淋巴细胞毒试验操作规程 SXYJ-GZ-0214

1目的规范微量淋巴细胞毒试验操作，正确进行HLA抗体鉴定。

2适用范围适用于HLA抗体鉴定。

3职责检测者负责依据此程序进行微量淋巴细胞毒试验操作。

4材料与设备肝素抗凝剂、淋巴细胞分离液、凝血酶、补体、伊红染液、12%甲醛、甘油；

空白72孔微量反应板、微量加样枪（1µl、2µl、5µl）、倒置相差显微镜、水平式离心机、血细胞计数池、KUBOTA KA5100型离心机等。

5操作方法

5.1待检标本准备及要求移植前交叉淋巴细胞毒患者不抗凝标本3ml,供者肝素抗凝静脉

血5ml；习惯性流产女方不不抗凝标本3ml，男方肝素抗凝静脉血5ml。不抗凝标本充分退缩，分离出血清备用；肝素抗凝静脉血充分混匀，室温放置备用。

5.2淋巴细胞制备

5.2.1肝素抗凝静脉血，室温放置20分钟，2000转/分离心10分钟，吸取白膜层于装有2ml

盐水的试管中，混匀；

5.2.2缓慢加在装有3ml Ficoll液面上，2000转/分离心30分钟，取淋巴细胞层，于另一

小试管中，加盐水至3ml,3400转/分离心1分钟（SERO 3键）；

5.2.3弃掉上清，加1ml盐水，将细胞轻轻吹起，3400转/分离心15秒钟（SERO 2键），去

除血小板的干扰；

5.2.4弃掉上清，加入3ml的生理盐水，并将细胞轻轻吹起，3400转/分离心1分钟（SERO 3

键），弃掉上清，用1640保养淋巴细胞；

5.2.5淋巴细胞浓度调节混匀淋巴细胞后冲入血细胞计数池，倒置相差显微镜下观察细胞浓

度为2500-3000个/µl（中方格内的每个小格约20-30个细胞）。

5.3加样

5.3.1在空白72孔微量反应板中加液体石蜡，8ul/孔；

5.3.2每孔加相应血清1ul(阴性对照孔加血小板配型试剂中阴性对照血清)；

5.3.3每孔加淋巴细胞1µl 置室温35分钟；

5.3.4每孔加补体5µl，室温65分钟；

5.3.5每孔加伊红2µl，室温2分钟；

5.3.6每孔加甲醛8µl，盖板；

5.3.7将反应板置湿盒内至少4小时或过夜再读板，若是急诊可以600转/分离心5分钟后读

板。

6结果判定将反应板置于倒置相差显微镜下观察淋巴细胞死亡情况，死细胞（被染色细胞）体积大，颜色暗，无折光性；活细胞（未被染色细胞）体积小而亮，有折光性。通过估计各孔死细胞的百分数判定结果（见下表）

结果死亡细胞（%）打分

阴性0-10 1

可疑阴性11-20 2

可疑阳性21-40 4

阳性41-80 6

强阳性81-100 8

7注意事项

7.1血清分离时，血块退缩要充分自然，避免退缩不彻底时纤维蛋白干扰。

7.2淋巴细胞提纯去血小板时，注意凝血酶不要加过量，防止淋巴细胞被去除物包裹而丢失。

7.3判定结果时，应先观察阴性对照孔，以此判定试验的可信程度。

8依据《全国临床检验操作规程》（第3版）中华人民共和国卫生部医政司