基因工程概论(8-9)
基因工程概论(6-7)
核糖体结合位点
核糖体结合位点对外源基因表达的影响
SD序列的影响：
一般来说，mRNA与核糖体的结合程度越强，翻译的起始效
率就越高，而这种结合程度主要取决于SD序列与16S rRNA的碱
基互补性，其中以GGAG四个碱基序列尤为重要。对多数基因而 言，上述四个碱基中任何一个换成C或T，均会导致翻译效率大幅 度降低
核糖体结合位点
核糖体结合位点对外源基因表达的影响
ori
含有外源启动子活性的重组克隆
启动子
启动子的构建
启动子
PlL
-35 区序列
T T G A C A
-10 区序列
G A T A C T
PrecA
PtraA Ptrp Plac Ptac
T T G A T A
T A G A C A T T G A C A T T T A C A T T G A C A
核糖体结合位点
核糖体结合位点对外源基因表达的影响
起始密码子及其后续若干密码子的影响： 大肠杆菌中的起始tRNA分子可以同时识别AUG、GUG和UUG 三种起始密码子，但其识别频率并不相同，通常GUG为AUG的50% 而UUG只及AUG的25%。除此之外，从AUG开始的前几个密码子碱 基序列也至关重要，至少这一序列不能与mRNA的5’ 端非编码区
过终止子结构继续转录质粒上邻近的DNA序列，形成长短不一的mRNA混合物
过长转录物的产生在很大程度上会影响外源基因的表达，其原因如下： 转录产物越长，RNA聚合酶转录一分子mRNA所需的时间就相应增加，外源基因
《生物技术概论》1基因工程
二、目的DNA片段的获得
（三）DNA片段的化学合成 1.合成引物 2.合成DNA寡核苷酸连杆 3.合成基因片段
第二节 DNA重组
三、DNA片段的连接
（一）DNA连接酶 （二）DNA片段之间的连接 1. 互补黏性末端片段之间的连接 2.平末端DNA片段之间的连接 3.DNA片段末端修饰后进行连接 4. DNA片段加连杆或衔接头后连接
（六）基因可以通过复制把遗传信息传递给下 一代
第一节 基因工程概述
三、基因工程操作的基本技术路线
第一节 基因工程概述
四、基因工程研究最突出的优点
打破了常规育种难以突破的物种之间的界限， 可以使原核生物与真核生物之间、动物与植物 之间，甚至人与其他生物之间的遗传信息进行 相互重组和转移。人的基因可以转移到大肠杆 菌（E.coli）中表达，细菌的基因可以转移到动 植物中表达。
第二章 基因工程
第一节 基因工程概述
一、基因工程的含义
按照人们的愿望，进行严密的设计，通过体外 DNA重组和转移等技术，有目的地改造生物种 性，使现有物种在较短的时间内趋于完善，创 造出新的生物类型，这就是基因工程的基本含 义。
第一节 基因工程概述
二、基因工程研究的理论依据
（一）不同基因具有相同的物质基础 （二）基因是可以切割的 （三）基因是可以转移的 （四）多肽与基因之间存在对应关系 （五）遗传密码是通用的
质粒基因组、病毒（噬菌体）基因组、线粒体 基因组和叶绿体基因组也有少量的基因
第四节 目的基因的制备
二、分离目的基因的途径
（一）利用限制性内切核酸酶酶切法直接分离 目的基因
第一章 基因工程概述
或新性状的DNA体外操作程序，也称为分子克隆技术。
因此，供体、受体、载体是重组DNA技术的三大基
本元件。
基因工程的基本概念
B 基因工程的基本定义
基因工程是指重组DNA技术的产业化设计与应用，
包括上游技术和下游技术两大组成部分。上游技术指的
是基因重组、克隆和表达的设计与构建（即重组DNA技
术）；而下游技术则涉及到基因工程菌或细胞的大规模
酶工程
基因工程的基本概念
D 基因工程的基本形式
第一代基因工程 蛋白多肽基因的高效表达 经典基因工程 第二代基因工程 蛋白编码基因的定向诱变 蛋白质工程
第三代基因工程 代谢信息途径的修饰重构 途径工程
第四代基因工程 基因组或染色体的转移
基因组工程
第二节 基因工程的诞生和发展
一、基因
泛基因阶段
孟德尔遗传因子阶段
（如胰岛素）、干扰素、乙肝疫苗等 研制新型疫苗（HIV、霍乱、单纯疱疹病毒等）
生产具有药用价值的生物制剂，如水蛭素等
3. 基因诊断
– 遗传性疾病的分子诊断
– 癌症的分子诊断 – DNA指纹
4. 基因治疗
是指将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿因基因缺陷和异 常引起的疾病，以达到治疗目的。
3．断裂基因
1个基因被间隔区分成不连续的若干区段，这种编码序列不连续的间断基因被称为 断裂基因。
4．假基因
不能合成出功能蛋白质的失活基因 。
5．重叠基因
不同基因的核苷酸序列有时是可以共用的 即重叠的。
现代对基因的定义是DNA分子中含有特定遗传信息的一段核苷酸序列， 是遗传物质的最小功能单位。
二、 基因工程的诞生
顺反子阶段
1957 年，本泽尔（Seymour Benzer）以T4噬菌 体为材料，在DNA分子水平上研究基因内部的精细结 构，提出了顺反子（cistron）概念。 顺反子是1个遗传功能单位，1个顺反子决定 1条多肽链。
生物技术概论之基因工程
细菌的接合转化
（5） 目的基因表达及蛋白质分离
进入到寄主细胞的目的基因还要 能表达产生有活性的目的蛋白，这些 目的蛋白可以是某种蛋白质药物，也 可以表达某种抗性性状（如植物的抗 病性和抗旱性）。 蛋白质的分离纯化——生物分离技术
重组 DNA 分子进入寄主细胞后，
其中的目的基因能否表达，表达效率
目前已经进入后基因组时代 基因工程——蛋白质工程——应用
※基因保护
比尔.盖茨说，第二个“比尔.盖茨”将出现在基因领域， 为此他看好这一新领域，向几个实验室投了不少钱。 中科院 “到2009年，全世界的基因产业带来的销售额将 达450亿美元。”
“基因就是钱”，由于其孕育着巨大的商业利润，争夺 基因资源的世界大战已经打响。
是否参与“计划”的讨论持续了十年
两种意见： △大多数科学家主张把有限的基金投入到基因组的下游工程— —生物基因开发上。这是建立在上游工程——基因测序当选据 公开、成果共享的基础上。 如果所有的基因图谱都向外国买，中国买不起。21世纪两大支 柱产业——信息产业的核心技术已被外国掌握，我们只能以市 场以代价换技术。 在21世纪，我们的健康需要人类基因组计划，我们的医药工业 需要它，我们的农业、畜牧业都需要它。
0 0 0
FLASH：PCR
PCR 的三个步骤为一次循环，约需
5－10 分钟。每经一次循环，所找到的
目的基因扩充一倍。经过 20 次循环， 即可扩增 106 倍，总共只需几个小时。
FLASH：PCR
（3）构造重组 DNA 分子
首先要有载体。
载体有好几种，常用的有：
质粒－－环状双链小分子DNA，适于
2-3年内绘制出覆盖率为100%的序列图，同时制订有关法律；
2002-2010年，对癌症、糖尿病等疾病将出现相关基因的检测 试验，对血友病将出现临床基因治疗方法； 2015年，将研究出适应个人基因组合的治疗方法，可治疗包 括癌症在内的很多疾病； 2025年，医生将有能力修复基因缺陷，某些如贫血之类的先 天性疾病从此将成为历史。 到2050年,许多病症将会在症发前就被消灭。
大学《基因工程学》教学大纲
《基因工程学》课程教学大纲（Genetic Engineering）一、课程说明课程编码：02200200课程总学时（理论总学时/实践总学时）：48（48/0）周学时（理论学时/实践学时）：4（4/0）学分：31．课程性质：专业必修课。
2．适用专业与学时分配：适用生物技术专业。
教学内容与学时分配3．课程教学目的与要求：本课程的授课对象是生物技术专业的本科生。
课程简介：《基因工程》是生物技术专业的专业必修课程。
其以分子遗传学理论为基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段而建立起来的一门技术学科。
基因工程兴起于20世纪70年代初，它的问世带动了生物技术的兴起和发展，是现代生物技术的核心内容。
基因工程课程的主要内容包括基因的分离、基因的克隆、基因的表达、植物基因工程、动物基因工程、药物基因工程和基因治疗等。
它是生命科学学院生物技术专业本科生的主干专业课程之一，它是生物工程（包括基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程）中最重要的课程，其它三大工程是建立在基因工程基础之上的，同时也为生物技术制药等后继学科奠定了重要的理论基础。
课程目标：设置本课程是为了让生物技术专业的学生理解和掌握基因工程的技术原理，通过本课程学习，掌握基因操作的工具酶，基因克隆常用载体，目的基因的分离与合成，重组体的构建，重组体向宿主细胞的导入，重组体克隆的筛选与鉴定以及克隆基因的表达，同时了解基因工程在生物学领域中的应用与发展前景。
对学生达到毕业要求贡献如下：1）了解基因工程学的历史、发展和前沿知识。
2）掌握基因工程学的基础理论、基本知识和基本技能；教学要求：学完基因工程学后，学生将具备以下能力：1）具有良好的自学能力；2）综合运用所掌握的基因工程学理论知识和技能、从事生物科学及其相关领域科学研究的能力。
4．本门课程与其它课程关系：先修课程为生物化学、微生物学、分子生物学、细胞学等，具备基础理论知识及实验能力是基因工程学课程的基础。
自然科学概论论文题目选题参考
自然科学概论论文题目一、最新自然科学概论论文选题参考1、《自然科学概论A(三)(地球科学卷)》课程教学大纲2、《自然科学概论A(五)(现代科学技术卷)》课程教学大纲3、自然科学概论4、自然科学概论5、自然科学概论问题解答6、自然科学概论7、自然科学概论8、自然科学概论9、自然科学概论10、自然科学概论11、辩证法的自然科学概论12、自然科学概论13、自然科学概论14、自然科学概论15、自然科学概论16、自然科学发展概论: 自然科学思想方法与人文教育17、自然科学发展概论18、现代自然科学技术概论19、近代自然科学史概论20、理工农医研究生马克思主义理论课的思考——以"自然辩证法概论"和"现代科学技术革命与马克思主义"为例二、自然科学概论论文题目大全1、自然科学与高技术概论2、科学知识图谱在研究生“自然辩证法概论”教学中的尝试3、自然科学与现代科技概论4、自然资源信息科学管理概论5、“自然辩证法概论”教学的科学技术视阈6、探索水科学自然规律,创建水科学研究框架体系——评《水科学概论》7、运动几何学: 自然科学哲学概论8、基因工程概论(公务员自然科学与人文科学丛书)9、《思想概论》教学法探讨——自然科学理论知识的创新运用10、从《自然辩证法概论》到《科学技术哲学教程》11、论自然辩证法概论课对高校医科学学生的思想教育功能12、中国西部地区自然科学地方文献资源概论13、探索水科学自然规律,创建水科学研究框架体系——评《水科学概论》14、自然哲学与科学技术概论15、评《自然地理区划概论》,李万著,1990,湖南科学技术出版社16、现代自然科学与哲学概论三、热门自然科学概论专业论文题目推荐41、自然科学与高技术概论42、科学知识图谱在研究生“自然辩证法概论”教学中的尝试43、自然科学与现代科技概论44、自然资源信息科学管理概论45、“自然辩证法概论”教学的科学技术视阈46、探索水科学自然规律,创建水科学研究框架体系——评《水科学概论》47、运动几何学: 自然科学哲学概论48、基因工程概论(公务员自然科学与人文科学丛书)49、《思想概论》教学法探讨——自然科学理论知识的创新运用50、从《自然辩证法概论》到《科学技术哲学教程》51、论自然辩证法概论课对高校医科学学生的思想教育功能52、中国西部地区自然科学地方文献资源概论53、探索水科学自然规律,创建水科学研究框架体系——评《水科学概论》54、自然哲学与科学技术概论55、评《自然地理区划概论》,李万著,1990,湖南科学技术出版社56、现代自然科学与哲学概论四、关于自然科学概论毕业论文题目1、以科技前沿信息提升《自然科学概论》教学2、自然科学概论课程的教学与实践3、高等教育中的通识教育——自然科学概论《化学与社会》的教学模式探索4、简评《自然科学概论(A)物理》5、小学教育专业《自然科学概论》(物理)教学模块及教学方法研究6、高等师范《自然科学概论》教学改革与实践探索7、《自然科学概论》中物理教学的改革探究——以郧阳师专学前教育专业为例8、自然科学概论9、自然科学概论10、自然科学概论11、自然科学概论12、《自然科学概论》出版13、自然科学概论14、现代自然科学概论15、《自然科学概论A——化学》CAI课件的设计实践——谈建构主义在教学设计中的应用16、自然科学概论17、自然科学概论18、自然科学概论19、《自然科学概论A(二)(化学卷)》课程教学大纲20、《自然科学概论A(一)(物理卷)》课程教学大纲五、比较好写的自然科学概论论文题目41、自然科学与高技术概论42、科学知识图谱在研究生“自然辩证法概论”教学中的尝试43、自然科学与现代科技概论44、自然资源信息科学管理概论45、“自然辩证法概论”教学的科学技术视阈46、探索水科学自然规律,创建水科学研究框架体系——评《水科学概论》47、运动几何学: 自然科学哲学概论48、基因工程概论(公务员自然科学与人文科学丛书)49、《思想概论》教学法探讨——自然科学理论知识的创新运用50、从《自然辩证法概论》到《科学技术哲学教程》51、论自然辩证法概论课对高校医科学学生的思想教育功能52、中国西部地区自然科学地方文献资源概论53、探索水科学自然规律,创建水科学研究框架体系——评《水科学概论》54、自然哲学与科学技术概论55、评《自然地理区划概论》,李万著,1990,湖南科学技术出版社56、现代自然科学与哲学概论。
基因工程概论复习重点
复习题一、名词解释1. 原核基因（Prokaryotic gene）：由原核生物（如大肠杆菌）基因组编码的基因，以及高等生物细胞器线粒体基因组和叶绿体基因组等编码的基因，统称原核基因。
2. 真核基因（Eukaryotic gene）：真核生物基因组DNA编码的基因,以及感染真核细胞的DNA病毒和反转录病毒基因组编码的基因，统称真核基因。
3. .前导序列（Leader sequence）：又叫前导序列区或5'-非翻译区（5'-UTR），，系指位于mRNA5'-起始密码子之前的一段长数百个核苷酸的不翻译的RNA 区段。
4. 尾随序列（Tai1er sequence）：又称尾随序列区或3'-非翻译区（3'-UTR），系指位于mRNA3'-终止密码子之后一段100多核苷酸的不翻译的RNA区段。
5 复制子（Replicon）：指有一个复制起始区（oriC）和起始基因的DNA复制单元。
例如细菌染色体、病毒基因组、质粒基因组等，凡其DNA能够进行复制的遗传单元，均称复制子。
真核细胞基因组的复制子是指含有一个复制起始位点的DNA（RNA）的复制子特称复制单元。
6. 增强子（Enhancer）：又叫增强子序列或增强子元件，是真核基因中发现的一种特异序列，能够在距离目标基因50kb以上的位置，从上游或下游的不同位置及方向增强该基因的转录活性。
7. 沉默子（Silencer）在真核基因启动子中除了增强子之外，沉默子同样也是一种可远距离调控相关基因转录活性的顺式元件。
与增强子一样，沉默子也能够从启动子的上游、下游甚至是基因内部三种不同的位置以及正向或反向，影响相关基因启动子的转录起始效率。
同时沉默子往往是以组织特异性或时间特异的作用方式，控制基因的表达作用。
但与增强子的功能效应相反，沉默子只能抑制而不能激活相关基因的转录起始活性。
8. 绝缘子（Insulator）亦即是增强子活性的物理边界元件（physical boundaryelement），它是一段能够抑制或隔离增强子功能效应的顺式转录调节序列。
基因工程第1讲概论课件
理论上的可行性。
41
二、分子遗传学新方法是基因工程的 技术基础（六大技术）
首当其冲的是要解决: ① 如何自如地得到目的基因； ② 如何在体外改造基因，得到重 组体； ③ 如何在体外转移重组基因；
直到20世纪70年代中期，相继出现了 几项关键性技术，梦想成真。
42
实际上的可操作性 材料、实验条件、时空条件、
经济条件和政策。 基础方面的基本条件（可能性+ 可行性+ 可操作性）具备, 尚需人的科学创新 思维+ 艰苦的实践。才能得到创新的发明、 发现
49
1970年, MIT 的 科学家率先提出在体 外把不同来源的遗传 物质进行重组的设想, 但遭到反对, 不予支
50
办
不
不
到
到
的
的
22
第一节 基因工程的 发生与发展
23
一、基因工程诞生的理论基础
2生物遗传的物质基础是 DNA 肺炎链球菌光滑型和粗糙型的转化 试验
24
● 1944年, 美 国微生物学家 Avery证明基 因就是DNA分 子, 提出 DNA 是遗传信息的 载体。
32
遗 传 密 码 表
目 录33
mRNA分子上从5 至3 的方向,每3个核 苷酸构建一个密码子, 编码某一特定氨基酸或 作为蛋白质合成的起始、终止信号, 称为三联 体密码(triplet codon), 也称遗传密码子(genetic codon)。
解决了信息语言的对应关系。
34
•密码: 43 = 64
14
（4）利用重组DNA技术可以在体外大 量扩增、纯化人们感兴趣的基因, 研 究其结构、功能及调控机制, 从而拓 宽了分子生物学的研究领域。
基因工程概论(4-5)
5' 5'
人工粘性末端的连接 平头末端
5' G 3' C TdT C 3' G dTTP 5' G 3' C TdT C 3' G dATP
GTTTTTTTTTT 3' C C 3' TTTTTTTTTTG
G 3' AAAAAAAAAAC
CAAAAAAAAAA 3' G
退火
5' 5'
T4-DNA ligase
应始终悬浮在10.3%的蔗糖等渗溶液中。与原生质体接触的所
有器皿应保持无水无去污剂
转化的原理与技术
细菌原生质体的转化
细菌原生质体的转化：
取0.2 - 1ml的原生质体悬浮液（108-109个原生质体），加
入10 - 20 ml DNA重组连接液，同时加入含有PEG1000和Ca2+
的等渗溶液，混匀 细菌原生质体的再生： 原生质体再生的主要目的是使细菌重新长出细胞壁。再生 在特殊的固体培养基上进行，内含脯氨酸和微量元素
5'
4 基因工程的操作过程
B 重组DNA分子的转化和扩增（转与增）
转化的原理与技术 转化率
转化细胞的扩增
转化的原理与技术
Ca2+诱导的完整细菌细胞的转化
Ca2+诱导的完整细胞的转化适用于革兰氏阴性细菌（如 大肠杆菌等），1970年建立此技术，其原理是Ca2+与细菌外 膜磷脂在低温下形成液晶结构，后者经热脉冲发生收缩作用， 使细胞膜出现空隙，细菌细胞此时的状态叫做感受态
TG AC
CA GT
粘性末端的更换
5' BamHI 5' GGATCC CCTAGG 5'
生物工程概论复习题
第二章《基因工程》复习题一、选择题1. 限制性核酸内切酶是由细菌产生的，其生理意义是（D）A 修复自身的遗传缺陷B 促进自身的基因重组C 强化自身的核酸代谢D 提高自身的防御能力2.生物工程的上游技术是（D）A 基因工程及分离工程B 基因工程及发酵工程C 基因工程及细胞工程D 基因工程及蛋白质工程3. 基因工程操作的三大基本元件是:(I 供体 II 受体 III 载体 IV 抗体 V 配体) （A）A. I + II + IIIB. I + III + IVC. II + III + IVD. II + IV + V4. 多聚接头（ Polylinker ）指的是（A）A. 含有多种限制性内切酶识别及切割顺序的人工 DNA 片段B. 含有多种复制起始区的人工 DNA 片段C. 含有多种 SD 顺序的人工 DNA 片段D. 含有多种启动基因的人工 DNA 片段5.下列五个 DNA 片段中含有回文结构的是（D）A. GAAACTGCTTTGACB. GAAACTGGAAACTGC. GAAACTGGTCAAAGD. GAAACTGCAGTTTC6. 若将含有 5' 末端 4 碱基突出的外源 DNA 片段插入到含有 3' 末端 4 碱基突出的载体质粒上，又必须保证连接区域的碱基对数目既不增加也不减少，则需用的工具酶是（D）I T 4 -DNA 聚合酶 II Klenow III T 4 -DNA 连接酶 IV 碱性磷酸单酯酶A. IIIB. I + IIIC. II + IIID. I + II + III7.下列有关连接反应的叙述，错误的是（A）A. 连接反应的最佳温度为 37 ℃B. 连接反应缓冲体系的甘油浓度应低于 10%C. 连接反应缓冲体系的 ATP 浓度不能高于 1mMD. 连接酶通常应过量 2-5 倍8. T4-DNA 连接酶是通过形成磷酸二酯键将两段 DNA 片段连接在一起，其底物的关键基团是（D）A. 2' -OH 和 5' –PB. 2' -OH 和 3' -PC. 3' -OH 和 5' –PD. 5' -OH 和 3' -P9. 载体的功能是(I 运送外源基因高效进入受体细胞 II 为外源基因提供复制能力 III 为外源基因提供整合能力) （D）A. IB. I + IIIC. II + IIID. I + II + III10.克隆菌扩增的目的是 (I 增殖外源基因拷贝 II 表达标记基因 III 表达外源基因) （D）A. I + IIB. I + IIIC. II + IIID. I + II + III11. 下列各组用于外源基因表达的受体细胞及其特点的对应关系中，错误的是（C）A. 大肠杆菌－繁殖迅速B. 枯草杆菌－分泌机制健全C. 链霉菌－遗传稳定D. 酵母菌－表达产物具有真核性12.考斯质粒（cosmid）是一种（B）A. 天然质粒载体B. 由λ -DNA 的 cos 区与一质粒重组而成的载体C. 具有溶原性质的载体D. 能在受体细胞内复制并包装的载体13. 某一重组 DNA （ 6.2 kb ）的载体部分有两个 SmaI 酶切位点。
基因工程绪论
基因工程三大要素之一供体片段
基因工程三大要素之一载体片段
供体进入受体的几种方式
1、Conjugation 中文翻译为“结合” 2、Transformation 中文翻译为“转化” 3、Transfection 中文翻译为“转染” 4、Transduction 中文翻译为“转导” 5、Infection 感染
1 基因表达的概念及调控特点
A 基因表达的概念
基因表达(gene expression)是指基因经过转录、 翻译，产生具有特异生物学功能的蛋白质分子 的过程。基因表达可分为组成性表达和受调控 表达两种形式。
影 响 蛋 白 质 浓 度 的
七
个 环 节
基因表达的调控元件
基因表达的调控元件
• 目的基因的克隆
• 大肠杆菌基因工程
• 酵母基因工程
• 高等动物基因工程
• 高等植物基因工程
• 第二代基因工程
• 第三代基因工程
基因工程的基本概念
➢1 基因工程的基本定义 ➢2 基因工程的基本过程 ➢3 基因工程的基本原理 ➢4 基因工程在生物工程中的地位
常见混用名称
• 基因工程(gene engineering)常和以下名称混用: • 遗传工程(genetic engineering); • 基因克隆(gene cloning); • 分子克隆(molecular cloning); • 基因操作(gene manipulation); • 重组DNA技术(recombination DNA technique)
开形成单链。
• Topoisomerase，主要功能是消除DNA解链过程中所产生的扭曲力。
• DNA结合蛋白，使新解链的DNA保持稳定结构。
2023年中国农科院历年考博试题汇总
中国农科院历年考博基因工程概论试题2023年中国农科院博士入学基因工程概论试题一、简答题1、聚丙烯酰胺、琼脂糖在dna电泳中的区别是什么？2、举出动物转基因的两种方法，并说明其原理。
3、双脱氧法测序的原理。
4、以拟南芥或玉米为例，说明转座子标签法进行基因转移的原理。
5、southern印迹的原理及应用。
三、试论述植物基因工程研究进展以及在农业生产上的意义。
2023年中国农科院博士入学基因工程概论试题一、名词解释1、限制性内切酶2、同裂酶3、核酶4、2μ环5、hat选择6、ti质粒7、t-dna8、同功trna9、反义trna 10、有义链11、α互补12、基因文库13、cdna 14、染色体步查二．简答题01、举两种植物基因转移的方法?简述其原理。
2、southern印迹的基本原理，这种方法有何应用。
3、噬菌体与cos作载体有何区别？4、aflp的原理及其应用5、普通pcr与rapd有何区别，何谓普通pcr？6、何谓双元载体，简述其组装过程及其作用机理？三、判断题1、无论用哪种转化方法均可用pbr322作载体2、进入细菌的外来dna之所以被降解，是由于细菌只修饰自身dna，不修饰外来dna3、只有粘粒端才可以被连接起来4、用自身作引物合成的cdna链，往往cdna并不完整1998年中国农科院博士入学基因工程概论试题一、什么是基因工程，基因工程在农业生产上有何意义？二、简答：1、聚丙烯酰胺凝胶电泳和琼脂糖凝胶电泳应用有何特点？2、举两种植物基因转移的方法?简述其原理。
3、双脱氧法测序的原理4、转座子标签法克隆植物基因的原理5、southern印迹的基本原理，这种方法有何应用？6、在dna复制过程中会形成一种复制体（replisome）的结构，它是由哪几部分组成的？7、sanger测序法的基本原理是什么？1999年中国农科院博士入学基因工程概论试题一．名词解释：1．cdna 2 ti质粒3. 2u环4. hat选择5 a互补6 yac 7 转导8 基因文库9 限制性内切酶10 染色体步查二．问答题：1 举例说明两种植物转基因的方法。
生物技术概论_基因工程
PvuII等酶切产生的平末端
5’…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G…3’
3’…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C…5’
PvuII 37℃
5’…G-C-T-C-A-G-OH 3’…C-G-A-G-T-C-P
P-C-T-G-G-A-G…3’ HO-G-A-C-C-T-C…5’
4、限制性内切核酸酶反应系统 反应底物 内切酶 反应缓冲液 适当的温度
5、酶切方法
单酶切方法
一个酶切反应体系 （20μ L）： 离心2S→保温1-3h（30 度或37度） →终止反应
无菌重蒸水：13μ L， 缓冲液（10×）：2μ L 底物DNA： 4μ L
（65水浴中保温1015min，或乙醇沉淀处 理，或者先用酚处理后再
（2）T4噬菌体的连接酶：连接粘性末端、齐 平末端
功用：DNA重组中促使载体与DNA连接
具互补粘性末端片段之间的连接
具平末端DNA片段之间的连接
DNA片段末端修饰后进行连接
DNA片段加连杆后或加衔接头连接
二、 基因克隆载体
基因克隆载体的含义
能够承载外源基因，并将其带入受体细胞得以相对稳定维持
什么是限制性内切酶？
命名原则？
由1973年H.O Smith和D. Nathans提议的命名系统 由三部分构成，即菌种名、菌系编号、分离顺序。
1、用属名的第一个字母（大写，斜体）和种名的头两个字母 （小写，斜体）组成3个字母的略语表示寄主菌的物种名。
大肠杆菌（Escherichia coli）用Eco表示； 流感嗜血菌（Haemophilus influenzae）用Hin表示。
（二）基因工程研究的理论依据（为何可对基因进行
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态称为细胞系形成，此时的细胞成为细胞系。
高等哺乳动物受体细胞的条件
以高效表达外源基因为目标的高等哺乳动物受体细胞应具备下列条件
细胞系特征 丧失细胞接触抑制性和锚地依赖性特征，便于大
规模培养 遗传稳定性 合适的标记 生长快且齐 安全性能好 外源基因多次传代后不至于丢失，易于长期保存 便于转化株的筛选和维持 分裂周期短，生长均一，便于控制 不合成分泌致病物质，不致癌
哺乳动物细胞的物理转化法
显微注射法
通过激素疗法使雌鼠超数排卵，并与雄性小鼠交配，然后杀死雌 鼠，从其输卵管内取出受精卵； 借助于显微镜将纯化的DNA溶液迅速注入到受精卵中变大了的雄 性原核内。
上述程序多用于动物个体的转基因过程，由于必须单细胞逐一操
作，所以不太适用于基因的克隆和表达。
哺乳动物细胞的物理转化法
BKV gene BKV ori
Neo r
删除编码病毒核心蛋白和外壳蛋白的
基因，并与大肠杆菌质粒拼接，构成 穿梭载体，它不能整合，同时也不能 形成成熟的病毒颗粒裂解受体细胞。
DRE
MMTP E.coli ori Ap r
BKV - E.coli 穿梭载体
SV40 P
安装细胞色素P450 dioxin介导的增强
8 外源基因在哺乳动物细胞中的表达
B 高等哺乳动物的受体系统
高等哺乳动物细胞的生长特性 高等哺乳动物受体细胞的条件 高等哺乳动物受体细胞的遗传标记 常用的高等哺乳动物受体细胞
高等哺乳动物ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ胞的生长特性
正常的哺乳类动物细胞具有下列四大生物学特征： 锚地依赖性：细胞必须附在固体上或固定的表面才能生长分裂 血清依赖性：细胞必须具有生长因子才能生长 接触抑制性：细胞与细胞接触后，生长便受到抑制 形态依赖性：细胞称扁平状，并有长纤维网状结构 上述特征使得正常的哺乳动物细胞在体外培养中，一般只能存活50代 且在培养皿上以平面的形式生长，即单层细胞生长。有时，正常细胞 会改变某些特征而越过生理临界点，继续增殖并无限制分裂，这种状
pBR322 SV40 ori ori pV2-GPT gpt
pBR322
Apr
SV40
viral gene
pV2-GPT是一种SV40 DNA与大肠杆菌质粒DNA杂合的载体，其 中gpt为细菌来源的谷氨酸-丙氨酸转氨酶基因，用于筛选重组子。该 载体曾被成功地用于在猴肾细胞中表达有生物活性的兔b-珠蛋白.
大多数正常的高等哺乳动物细胞并不能同时具备上述条件，癌细胞能 满足上述前四项要求，但在安全性能上有欠缺。
高等哺乳动物受体细胞的遗传标记
营养缺陷型的哺乳动物受体细胞
嘌呤核苷酸生物合成途径
5-磷酸核糖-1-焦磷酸（PRPP）
嘧啶核苷酸生物合成途径
从头合成途径
氨基喋呤（AP） 尿嘧啶核苷一磷酸（UMP） 氨基喋呤（AP）
SV40感染猴细胞时呈裂解型，不致癌；但感染啮齿类动物后，
便发生非同源整合而致癌。
猴多瘤病毒DNA（SV40）
SV40的基因组DNA
t / T基因编码病毒的小抗原和大
t ori
VP2
VP3
抗原与病毒的致癌作用密切相关 SV40在裂解宿主细胞前的晚期 状态时，每个宿主细胞含有105个病 毒DNA拷贝，因此十分适合用于高效 表达外源蛋白
高等哺乳动物受体细胞的遗传标记
哺乳动物受体细胞常见的遗传选择标记
遗传标记 APHDHFR HPH编码产物 氨基糖苷磷酸转移酶 二氢叶酸还原酶 潮霉素B磷酸转移酶 筛选药物 G418 氨甲喋呤 潮霉素B 作用机理 APH灭活G418 DHFR变体抗氨甲喋呤 HPH灭活潮霉素B
TK-
胸腺嘧啶核苷激酶
氨基喋呤
T
SV40 DNA
VP1
猴多瘤病毒DNA（SV40）
SV40 DNA-质粒DNA杂合载体的构建
重组的SV40 DNA分子必须经过 包装后才具有感染能力，因此插入的 外源DNA片段不能太大。为了尽量提 高SV40的装载量，必须删除一些基因 片段，因此重组的SV40分子必须与野 生型病毒共感染受体细胞，才能形成 有感染力的重组病毒颗粒。
猴多瘤病毒DNA（SV40）
利用SV40 DNA载体表达外源基因的程序
病毒晚期基因启动子 插入外源基因 SV40 载体 重组分子 筛选 增殖 转化
去除细菌序列
筛选标记
ori 分离病毒DNA
感染
缺陷的SV40 辅助病毒
猴多瘤病毒DNA（SV40）
SV40 DNA载体的特点
基因表达好 外源基因能高效表达 基因重排高 病毒基因组和重组分子常发生重排和缺失现象
组质粒导入哺乳动物受体细胞，此时外源基因整合在受体细胞染色体
DNA上，并在T7RNA聚合酶的作用下表达出重组蛋白。
人囊状纤维化基因就是采用这种战略高效表达的。
人牛痘病毒DNA
利用人牛痘病毒载体表达外源基因的程序
感染 转化 培养
T7启动子
外源基因
收集
牛痘病毒 T7 RNA 启动子 聚合酶基因
细菌重组质粒
宿主范围窄 只能转染猴细胞 装载量较小
人乳多瘤病毒DNA（BKV）
人乳多瘤病毒的生物学特性
人乳多瘤病毒（BKV）属于乳多瘤病毒科乳头瘤病毒属，其基因 组为双链DNA，感染宿主细胞后基因不发生整合，独立于染色体而自 主复制，每个宿主细胞最高可达500个拷贝
人乳多瘤病毒DNA（BKV）
人乳多瘤病毒表达载体的构建
机整合在染色体DNA上，导致受体细胞基因灭活、外源基因不表达。
哺乳动物细胞的物理转化法
磷酸钙共沉淀法
将待转化的DNA溶解在磷酸缓冲液中，加入CaCl2溶液混匀，此
时DNA被包裹在磷酸钙晶体颗粒内； 将上述制备的颗粒悬浮液滴入细胞培养皿中，37℃保温4-16小时 此时细胞膜形成吞噬泡，磷酸钙晶体局部溶解膜结构，DNA便进入受 体细胞； 弃去DNA溶液，加入新鲜培养基，继续培养7天即可筛选转化株。 如果在外源DNA中掺入少量的受体细胞内源性DNA可以提高转化 效率。利用磷酸钙共沉淀法转化肿瘤病毒DNA，可使正常细胞转化为
TK合成TMP
XGPRT合成GMP
XGPRT- 黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶 霉酚酸 ADA腺嘌呤核苷脱氨酶
腺嘌呤木酮糖苷 ADA灭活Xyl-A
常用的高等哺乳动物受体细胞
迄今为止，用于医疗用品（药物、抗体、诊断试剂）大规模生产
的高等哺乳动物受体细胞主要还是中国仓鼠卵巢细胞（CHO），其优
势有如下几个方面：
GMP
次黄嘌呤核苷一磷酸（HMP）
次黄嘌呤磷酸 核糖转移酶
AMP
胸腺嘧啶核苷一磷酸（TMP）
（TK） 胸腺嘧啶 核苷激酶
（HPRT） 补救合成途径 次黄嘌呤核苷（HR）
胸腺嘧啶核苷（TR）
高等哺乳动物受体细胞的遗传标记
营养缺陷型的哺乳动物受体细胞
含有胸腺嘧啶核苷激酶（TK）编码基因缺陷的受体细胞（tk -）
9 外源基因表达产物的分离纯化
8 外源基因在哺乳动物细胞中的表达
A 高等哺乳动物基因工程的基本概念
高等哺乳动物基因工程
高等哺乳动物转基因技术 高等哺乳动物细胞基因表达技术
转基因动物个体 哺乳动物遗传性状改良 药物筛选研究评价模型 人体基因治疗
动物工程细胞 蛋白多肽物质大规模生产 药物筛选研究评价模型
人牛痘病毒DNA
人腺病毒DNA
腺病毒的生物学特性
腺病毒科为线状双链DNA病毒，无包膜，呈二十面体，共有93个 成员，分哺乳动物腺病毒和禽腺病毒两个属。目前已鉴定的人腺病毒
有6个亚属，其中常用来构建载体的主要是C亚属的2型（Ad2）和5型
（Ad5）病毒。 腺病毒感染人细胞时呈裂解型，不致癌；但对啮齿目动物来说， 绝大多数的腺病毒成员均能致癌。
人腺病毒DNA
腺病毒DNA载体的特点
基因重排低 外源基因与病毒DNA重组后能稳定复制几个周期 安全性能好 不整合人的染色体DNA，不会导致恶性肿瘤
宿主范围广 对受体细胞是否处于分裂期要求不严格
使用效果好 外源基因在载体上容易高效表达
猴多瘤病毒DNA（SV40）
SV40的生物学特性
SV40属于乳多瘤病毒科多瘤病毒属，呈小型二十面体，由VP1、 VP2、VP3三种衣壳蛋白包装而成，基因组为5224bp的双链环状DNA SV40可以与所有哺乳动物宿主细胞中的组蛋白H2、H3、H4结合，从 而使其DNA形成类似核小体的微型染色体结构。
血影细胞介导法
血影细胞是指哺乳动物的红细胞在机械作用、病毒诱导、低渗环
境下发生溶血，血红蛋白大量溢出，最后形成仅被细胞膜包裹的细胞
核结构。在溶血过程中，红细胞膜的通透性大增，在血红蛋白溢出的 同时，外源DNA也容易进入。当上述外界条件消失后，红细胞膜又可 恢复原来的通透性。因此，可先将外源DNA转入血影细胞，然后再将
人牛痘病毒DNA
人牛痘病毒DNA表达载体的构建
目前广泛使用的牛痘病毒表达系统是一种预先构建好的重组病毒 其基因组上插入了一个可表达的大肠杆菌T7RNA聚合酶编码基因。在 外源基因导入受体细胞之前，先以上述的重组病毒感染细胞，使其大 量表达T7RNA聚合酶，然后再将含有外源基因和T7启动子的细菌型重
人腺病毒DNA
腺病毒的基因组DNA
IVa2 ITR VA L1 L2 L3 L4 L5 ITR
E1
E2
E3
E4
腺病毒基因组DNA全长36 kb，其包装上限为原基因组的105%， DNA两端各有 一个反向重复序列（ITR）；E1-E4为早期基因，与病毒基因组的复制及晚期基因的 表达调控有关，其中E3编码晚期基因的调控因子， L1-L5为编码病毒包装蛋白的晚期 基因；IVa2和VA均为病毒RNA聚合酶的亚基编码基因。E3区缺失只会影响病毒颗粒 的成熟，不影响基因组的复制功能，因而在构建载体时往往除去这个2.2 kb的片段， 使得载体的装载量提高到4 kb以上。