酶活力测定方法PPT课件
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相当于的单位数为
A1 - A2
0.003:1=
:X
T
A1 - A2 0.003T
每mg供试品中含胰蛋白酶单位数为
A1 - A2
0.003TW
A1—A2
P=
0.003 T W
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重组人白细胞介素 11的胰蛋白酶切肽 图分析
肽图分析是评价重组产品蛋白质结构及其 生产工艺稳定性的重要方法,目前常用的方 法有ＣＮＢｒ裂解ＳＤＳ-ＰＡＧＥ微量肽 图法和胰蛋白酶切ＲＰ ＨＰＬＣ肽图法。
加热：使酶失效
酶反应 不同的时间取样
终止反应
测定
8
连续测定法：在反应过程中对反应系统进 行直接连续检测。
检测方法： 紫外-可见分光光度法 旋光法 荧光分光光度法 电化学测定法 酶偶联测定法 离子选择性电极测定法等。
9
示例：胰蛋白酶效价测定 胰蛋白酶 肽键、酰氨键、酯键（碱性氨基酸） 水解速率：酯键﹥酰氨键﹥肽键 供试品溶液：50～60单位/ml 底物溶液：N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯
浓度：A：0.575～.0585 N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯 N-苯甲酰-L-精氨酸
10
NH
NH-CO-
H2N-C-NH2CH2CH2-CH-CO2OH5C
253nm处的A随酶促反应递增， 根据酶活力单位定义计算酶活力。
11
酶活性单位：在最适的条件下，每分钟能 转化一个微摩尔底物的酶量定为一个活性 单位。 测定： 空白：底物溶液 + 0.001mol/L HCl
至ｒｈＩＬ 11完全酶解。按此方法摸索最佳酶
切时间,在第14针后ｒｈＩＬ 11已被完全酶切,酶
切时间在18～22ｈ范围内肽图图谱基本一致,即
确定最佳酶切条件为37℃保温20ｈ。
17
2。ＨＰＬＣ系统测试
ＨＰＬＣ系统测试标准物质进样后呈3个峰,12
次 重 复 进 样 3 个 峰 保 留 时 间 的 Ｒ Ｓ Ｄ 分 别 为 0.
统误差小,重复性好,可用于ｒｈＩＬ11的肽图分
析。
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3批ｒｈＩＬ 11制品的ＲＰ ＨＰＬＣ图谱 完全一致,说明该厂ｒｈＩＬ 11的生产工艺是稳 定的;与ＧＩ公司生产的ｒｈＩＬ 11对照品比较 有20个峰与对照品一致,但第6 峰的峰高和峰面 积均明显较小,且在第9和第10 峰之间多一个峰, 说明该厂ｒｈＩＬ 11蛋白质结构与ＧＩ公司生 产的ｒｈＩＬ 11比较存在细小差别。
2
酶反应进程曲线 纵坐标为底物或产物的变化量， 横坐标为反应时间，曲线斜率表示反应速度。 从酶反应进程曲线求得反应的初速度。 酶浓度曲线 纵坐标为反应速度，横坐标为酶量。 通过酶浓度曲线检验反应测定系统是否适宜。
3
4
酶活力测定的要求：测得的反应速度 必须和酶浓度有线性的比例关系，这 也是检验酶反应和测定系统是否适宜、 正确的标准。
2．酶活力测定法
1）基本原理： 酶活力是指酶催化一定化学反应的能力。酶
活力测定实质上是测定一个被酶所催化的化学 反应速度。酶反应速度越快所表示的酶活力越 高。
1
酶反应速度可以用单位时间反应底 物的减少或产物的增加来表示。
通常酶活力测定时，先制备酶反应进 程曲线和酶浓度曲线。通过酶反应速度 的测定，求得酶的浓度或含量。
6
空白和对照试验： 空白试验：是指杂质反应和自发反应引起
的变化量，它提供的是未知因素的影响。空 白值可以通过不加酶，或不加底物，或二者 都加（酶预先经过失效处理）。
对照试验：是指用纯酶或标准酶制剂测得 的结果，主要作为比较或标定的标准。
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3）测定方法：
取样测定法：
酶变性剂：5% 三氯醋酸 3% 高氯酸 其它酸、碱、醇类
4%,0 .6% 和 0. 8%, 峰 面 积 的 Ｒ Ｓ Ｄ 分 别 为
0 .7%,0 .8%和0 .8%。ｒｈＩＬ 11对照品
37℃酶切20ｈ后于4℃温控自动进样器连续进
样5次,结果见图1。5个色谱图完全重叠在一起,
所产生21个峰的保留时间、峰高和峰面积的Ｒ
ＳＤ均分别小于1 .0%,5 .4%和9. 8%,表明本系
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2）酶促反应的条件及影响因素 底物的浓度：一般选用底物的浓度[S]=100Km。 pH：选用一个适宜的缓冲离子和离子强度、 适宜的pH值的缓冲系统来控制pH。 温度：酶反应的温度通常选用25℃、30℃或 37℃，实验中温度变动应控制在±0.1℃以内。 辅助因子：有些酶需要金属离子，有些需要 相应的辅酶。
பைடு நூலகம்16
1。酶切条件
取浓度为3ｍｇ·ｍＬ-1的样品0 4ｍＬ对1%Ｎ
Ｈ4ＨＣＯ3充分透析,然后取透析样品250μＬ至 微量进样瓶,加0 3ｍｇ·ｍＬ-1ＴＰＣＫ处理的胰
蛋白酶10μＬ混匀,于37℃温控自动进样器酶切,
每80ｍｉｎ进样一针,进样量6μＬ,用Ｍｉｌｌｅ
ｎｎｉｕｍ32色谱软件选择214ｎｍ进行分析,直
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供 试 品 溶 液 + 底 物 溶 液
计 时 摇 匀
25.0。 C— +0.5。 C
测 定 ： 每 隔30s， 读 取 A， 共5min
每30s A的改变：0.015～0.018，呈 线性关系的时间不得少于3min。
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A每分钟改变0.003，相当于1个胰蛋白 酶单位。
供试液的A每分钟改变
A1 - A2 T
21
返回
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练习与思考
1．何谓：生化药物、生物技术药物、 基因工程药物和生物制品？ 2．生化药物和基因工程药物各分哪 几种？ 3．与化学合成药物的分析相比，生 物药物的分析有何特点？
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相当于的单位数为
A1 - A2
0.003:1=
:X
T
A1 - A2 0.003T
每mg供试品中含胰蛋白酶单位数为
A1 - A2
0.003TW
A1—A2
P=
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重组人白细胞介素 11的胰蛋白酶切肽 图分析
肽图分析是评价重组产品蛋白质结构及其 生产工艺稳定性的重要方法,目前常用的方 法有ＣＮＢｒ裂解ＳＤＳ-ＰＡＧＥ微量肽 图法和胰蛋白酶切ＲＰ ＨＰＬＣ肽图法。
加热：使酶失效
酶反应 不同的时间取样
终止反应
测定
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连续测定法：在反应过程中对反应系统进 行直接连续检测。
检测方法： 紫外-可见分光光度法 旋光法 荧光分光光度法 电化学测定法 酶偶联测定法 离子选择性电极测定法等。
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示例：胰蛋白酶效价测定 胰蛋白酶 肽键、酰氨键、酯键（碱性氨基酸） 水解速率：酯键﹥酰氨键﹥肽键 供试品溶液：50～60单位/ml 底物溶液：N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯
浓度：A：0.575～.0585 N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯 N-苯甲酰-L-精氨酸
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NH
NH-CO-
H2N-C-NH2CH2CH2-CH-CO2OH5C
253nm处的A随酶促反应递增， 根据酶活力单位定义计算酶活力。
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酶活性单位：在最适的条件下，每分钟能 转化一个微摩尔底物的酶量定为一个活性 单位。 测定： 空白：底物溶液 + 0.001mol/L HCl
至ｒｈＩＬ 11完全酶解。按此方法摸索最佳酶
切时间,在第14针后ｒｈＩＬ 11已被完全酶切,酶
切时间在18～22ｈ范围内肽图图谱基本一致,即
确定最佳酶切条件为37℃保温20ｈ。
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2。ＨＰＬＣ系统测试
ＨＰＬＣ系统测试标准物质进样后呈3个峰,12
次 重 复 进 样 3 个 峰 保 留 时 间 的 Ｒ Ｓ Ｄ 分 别 为 0.
统误差小,重复性好,可用于ｒｈＩＬ11的肽图分
析。
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3批ｒｈＩＬ 11制品的ＲＰ ＨＰＬＣ图谱 完全一致,说明该厂ｒｈＩＬ 11的生产工艺是稳 定的;与ＧＩ公司生产的ｒｈＩＬ 11对照品比较 有20个峰与对照品一致,但第6 峰的峰高和峰面 积均明显较小,且在第9和第10 峰之间多一个峰, 说明该厂ｒｈＩＬ 11蛋白质结构与ＧＩ公司生 产的ｒｈＩＬ 11比较存在细小差别。
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酶反应进程曲线 纵坐标为底物或产物的变化量， 横坐标为反应时间，曲线斜率表示反应速度。 从酶反应进程曲线求得反应的初速度。 酶浓度曲线 纵坐标为反应速度，横坐标为酶量。 通过酶浓度曲线检验反应测定系统是否适宜。
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酶活力测定的要求：测得的反应速度 必须和酶浓度有线性的比例关系，这 也是检验酶反应和测定系统是否适宜、 正确的标准。
2．酶活力测定法
1）基本原理： 酶活力是指酶催化一定化学反应的能力。酶
活力测定实质上是测定一个被酶所催化的化学 反应速度。酶反应速度越快所表示的酶活力越 高。
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酶反应速度可以用单位时间反应底 物的减少或产物的增加来表示。
通常酶活力测定时，先制备酶反应进 程曲线和酶浓度曲线。通过酶反应速度 的测定，求得酶的浓度或含量。
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空白和对照试验： 空白试验：是指杂质反应和自发反应引起
的变化量，它提供的是未知因素的影响。空 白值可以通过不加酶，或不加底物，或二者 都加（酶预先经过失效处理）。
对照试验：是指用纯酶或标准酶制剂测得 的结果，主要作为比较或标定的标准。
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3）测定方法：
取样测定法：
酶变性剂：5% 三氯醋酸 3% 高氯酸 其它酸、碱、醇类
4%,0 .6% 和 0. 8%, 峰 面 积 的 Ｒ Ｓ Ｄ 分 别 为
0 .7%,0 .8%和0 .8%。ｒｈＩＬ 11对照品
37℃酶切20ｈ后于4℃温控自动进样器连续进
样5次,结果见图1。5个色谱图完全重叠在一起,
所产生21个峰的保留时间、峰高和峰面积的Ｒ
ＳＤ均分别小于1 .0%,5 .4%和9. 8%,表明本系
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2）酶促反应的条件及影响因素 底物的浓度：一般选用底物的浓度[S]=100Km。 pH：选用一个适宜的缓冲离子和离子强度、 适宜的pH值的缓冲系统来控制pH。 温度：酶反应的温度通常选用25℃、30℃或 37℃，实验中温度变动应控制在±0.1℃以内。 辅助因子：有些酶需要金属离子，有些需要 相应的辅酶。
பைடு நூலகம்16
1。酶切条件
取浓度为3ｍｇ·ｍＬ-1的样品0 4ｍＬ对1%Ｎ
Ｈ4ＨＣＯ3充分透析,然后取透析样品250μＬ至 微量进样瓶,加0 3ｍｇ·ｍＬ-1ＴＰＣＫ处理的胰
蛋白酶10μＬ混匀,于37℃温控自动进样器酶切,
每80ｍｉｎ进样一针,进样量6μＬ,用Ｍｉｌｌｅ
ｎｎｉｕｍ32色谱软件选择214ｎｍ进行分析,直
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供 试 品 溶 液 + 底 物 溶 液
计 时 摇 匀
25.0。 C— +0.5。 C
测 定 ： 每 隔30s， 读 取 A， 共5min
每30s A的改变：0.015～0.018，呈 线性关系的时间不得少于3min。
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A每分钟改变0.003，相当于1个胰蛋白 酶单位。
供试液的A每分钟改变
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练习与思考
1．何谓：生化药物、生物技术药物、 基因工程药物和生物制品？ 2．生化药物和基因工程药物各分哪 几种？ 3．与化学合成药物的分析相比，生 物药物的分析有何特点？
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