酶活力测定方法PPT课件
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吲哚乙酸氧化酶活性的测定ppt课件
5
+6-BA0.5
用分光光度计在530nm波长处测A值；
查标准曲线；
计算 对照—处理(μg/ml)
IAA氧化酶活力 = 时间(h)
(μg·IAA/h·ml)
× 10
结果总结
不同培养基对怀地黄愈伤组织生长情况的影响
培养基
接种数 (瓶*片）
MS+2,4-D1.0 13*3
最早出愈 时间 （d）
18
出愈率 （%）
97.43
P144
实验目的
熟悉运用比色法测定吲哚乙酸 氧化酶活力的方法，并掌握测定酶 活力的基本要求。
实验原理
吲哚乙酸在吲哚乙酸氧化酶的作用下，被氧 化破坏失去活力。植物体内吲哚乙酸氧化酶活力 的大小，对调节体内吲哚乙酸的水平起着重要的 作用，从而影响植物的生长。
酶活力的大小可以其破坏吲哚乙酸的速度表 示。吲哚乙酸的含量可用比色法测定。
MS+2,4-D1.0 12*3
17
100
+6-BA0.4
MS+2,4-D1.0 12*3
16
100
+6-BA1.0
污染率 （%）
愈伤生长 情况
7.69 0 0
切口处较多出 愈，黄色颗粒 状，偶见灰白 色愈伤
切口及与培养 基接触处生长 愈伤，黄色透 明，较湿润
切口及与培养 基接触处生长 愈伤，黄白色， 湿润
结果总结
I型愈伤组织
Ⅱ型愈伤组织
Ⅲ型愈伤组织
不同培养基对怀地黄试管苗生长情况的影响
培养基 （mg/L)
MS+NAA 0.02
接种数 （瓶*株）
13*3
出芽时间 (d)
20
DNS法测定α-淀粉酶活力的方法课件(1)
密封121.3 ℃ 灭菌处理20min）。用时注意酶
污染。
14
标准曲线制作相关试剂加入表
试剂
管号 123456
标准麦芽糖溶液
（mL）
0 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0
蒸馏水 （mL）
2.0 1.6 1.2 0.8 0.4 0
麦芽糖含量 （mg）
0 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0
DNS试剂 （mL）
淀粉酶活力的大小与产生的还原糖的量成正比。
用标准浓度的麦芽糖溶液制作标准曲线，用比色
法测定淀粉酶作用于淀粉后生成的还原糖的量，
以单位样品（重量或体积）在一定时间内生成的
麦芽糖的量表示酶活力。
7
酶活力测定（DNS比色法）
酶活力定义：在一定反应条件下（本实验为40 ℃ ，pH5.6或6.0），1分钟反应生成1mg麦 芽糖的酶量定义为1个酶活力单位。
利用Excel中相关统计分析工具，完成回 归方程的计算及分析，并绘制标准曲线图。
12
相关试剂（第一种）
标准麦芽糖溶液（1mg/mL）：精确称取 1g麦芽糖，用蒸馏水溶解并定容至 1000mL。
0.1mol/L pH5.6的柠檬酸缓冲液：称取 柠檬酸（C6H8O7·H2O ）5.78g，柠檬酸 钠（Na3C6H5O7·2H2O）21.32g ，用 蒸馏水溶解并定容至1000mL。
称取磷酸氢二钠（Na2HPO4.12H2O）45.3g， 柠檬酸（C6H8O7·H2O ）7.74g，先在烧杯中 用蒸馏水使之溶解，然后转入容量瓶中定容至
1000mL。
1%马铃薯淀粉溶液：称取1g马铃薯淀粉
（105℃烘干2hr）溶于100mL 0.2mol/L
pH6.0 磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液中（一般需要
胰蛋白酶的活力的测定完美版PPT
法：
1、专一性研究 通过研究酶的专一性底物的结构特点，来判断 和确定活性中心的结构特点。
2、酶侧链基团的化学修饰法 酶分子中可以被化学修饰的基团 很多，如巯基、羟基、咪唑基、氨基及羧基 等。
四、酶的命名与分类
习惯命名法
按催化反应类型分类 脱氢酶、脱羧酶、连接酶、聚合酶等。 按组织来源及性质分类 胃蛋白酶/胰蛋白酶，酸性/碱性磷酸 酶等。
酶活力与酶反应速度 初速度 研究酶反应的动力学以酶促反应的初速度为准
产物量
18
16
14
12
10 8
系列1
6
4
2
时间
0
0
5
10 15 20
时间
以N-苯甲酰-L—精氨酸乙酯为底物，用紫外吸收法进 行测定的原理是：N－苯甲酰－L—精氨酸乙酯英文缩 写为BAEE）在波长253nm下的紫外吸收远远弱于苯甲 酰L—精氨酸（英文缩写为BA）。在胰蛋白酶的催化 下，随着酯键的水解，苯甲酰L—精氨酸逐渐增多，反 应体系的紫外吸收宜随之相应增加。
五、酶的活力测定
酶活力（enzyme activity），是指酶催化一定化学反 应的能力。
酶活力单位（国际单位） 标准状态下，每分钟使一微克 分子作用物发生转变的酶量。人们普遍 采用是习惯用法，如 a-淀粉酶，可用每小时催化1克可溶性淀粉所需要的酶量来表 示。
胰蛋白酶活力单位的定义规定为：以BAEE为底物反应液pH8.0， 25℃，反应体积3.0ml，光径1厘米的条件下，测定A253，每分 钟使A253增加0.001，反应液中所加入的酶量为一BAEE单位。
的紫外吸收远远构弱于区苯域甲酰，L—与精氨催酸化（英作文缩用写直为B接A）相。 关。
样品胰蛋白酶BAEE活性单位＝
1、专一性研究 通过研究酶的专一性底物的结构特点，来判断 和确定活性中心的结构特点。
2、酶侧链基团的化学修饰法 酶分子中可以被化学修饰的基团 很多，如巯基、羟基、咪唑基、氨基及羧基 等。
四、酶的命名与分类
习惯命名法
按催化反应类型分类 脱氢酶、脱羧酶、连接酶、聚合酶等。 按组织来源及性质分类 胃蛋白酶/胰蛋白酶，酸性/碱性磷酸 酶等。
酶活力与酶反应速度 初速度 研究酶反应的动力学以酶促反应的初速度为准
产物量
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系列1
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时间
0
0
5
10 15 20
时间
以N-苯甲酰-L—精氨酸乙酯为底物，用紫外吸收法进 行测定的原理是：N－苯甲酰－L—精氨酸乙酯英文缩 写为BAEE）在波长253nm下的紫外吸收远远弱于苯甲 酰L—精氨酸（英文缩写为BA）。在胰蛋白酶的催化 下，随着酯键的水解，苯甲酰L—精氨酸逐渐增多，反 应体系的紫外吸收宜随之相应增加。
五、酶的活力测定
酶活力（enzyme activity），是指酶催化一定化学反 应的能力。
酶活力单位（国际单位） 标准状态下，每分钟使一微克 分子作用物发生转变的酶量。人们普遍 采用是习惯用法，如 a-淀粉酶，可用每小时催化1克可溶性淀粉所需要的酶量来表 示。
胰蛋白酶活力单位的定义规定为：以BAEE为底物反应液pH8.0， 25℃，反应体积3.0ml，光径1厘米的条件下，测定A253，每分 钟使A253增加0.001，反应液中所加入的酶量为一BAEE单位。
的紫外吸收远远构弱于区苯域甲酰，L—与精氨催酸化（英作文缩用写直为B接A）相。 关。
样品胰蛋白酶BAEE活性单位＝
淀粉酶活力的测定课件
以0号管为空白参比，测定λ=540nm处的吸光值
记录A540
•8
六. 结果处理
1、分别计算0时刻、5 min时刻的A540nm平均值。 2、根据图表中的实验结果，并利用实验 “3,5-二
硝基水杨酸比色法测定糖的含量”中制作的标准 曲线，计算淀粉酶的活力。
需要详细过程。
5 min时刻吸光值
5 min时刻还原糖mg数
一、实验目的
掌握测定淀粉酶活力的原理和基本方法
•1
二、实验原理
• 酶是一种具有高度专一性的催化剂。其催化能 力的大小用酶的活力来表示。酶活力也称酶活 性，是以酶在最适温度、最适pH等条件下，催 化一定的化学反应的初速度来表示。
•2
本实验是以一定量的α-淀粉酶液，于37 ℃ 、 pH6.8的条件下，在一定的初始作用时间内将淀粉 转化为还原糖，然后通过与DNS试剂作用，比色 测定求得还原糖的生成量，从而计算出酶反应的 初速度，即酶的活力
收集1管的同学，将0.05 mL稀释到15 mL 收集2管的同学，将0.05 mL稀释到10 mL
•6
试管排列顺序
室温
装约20 mL淀粉溶液， 标记，转至37℃水浴
锅中
37 ℃
粗酶液
1
空白
淀粉
盐析
2
脱盐
3
B1
B2
B3
B1
B2
B3
F1
F2
F3
F1
F2 F3
因淀粉中含有少量还原糖， 某些溶液有色素、杂质，需
这里规定，一个淀粉酶活力单位为在37 ℃ 、 pH6.8的条件下，每分钟水解淀粉生成1 mg还原 糖所需要的酶量。
1 U=1 mg 还原糖/min·mL 酶
《酶活力的测定》课件
数据记录与整理
实验数据记录
在实验过程中，应准确、及时地记录实验数据，包括实验条件、实验步骤、实 验结果等。
数据整理
将实验数据整理成表格或图表，便于分析和比较。数据整理时应确保数据的准 确性和完整性。
数据分析与处理
数据分析
对实验数据进行统计分析，包括平均值、标准差、误差等指 标的计算。
数据处理
对异常值或离群数据进行处理，如剔除、替换或修正，以确 保数据分析的准确性。
未来，酶活力测定技术的发展将更加注重高灵 敏度、高特异性和自动化方向，为生物工程领 域的研究提供更加精准和高效的工具。
感谢您的观看
THANKS
问题
实验操作复杂，耗时较长。
改进建议
优化实验流程，简化操作步骤，提高实验 效率。
酶活力测定在生物工程领域的应用前景
酶活力测定是生物工程领域中重要的研究手段 ，可用于研究酶促反应动力学、酶的抑制剂和 激活剂等方面的研究。
随着生物工程技术的不断发展，酶活力测定的 应用范围将不断扩大，如应用于生物制药、生 物能源和生物环保等领域。
通过实验，我们掌握了酶活力测定的基本原理和方法，学会了如何设置实验条件和 操作实验。
实验过程中，我们观察到了酶促反应的动力学特征，如米氏方程的适用性和酶促反 应的速率常数。
实验中存在的问题与改进建议
问题
改进建议
实验过程中存在误差，如温度控制不精确 、底物浓度不均匀等。
采用更精确的仪器和设备，如恒温控制器 和磁力搅拌器，以提高实验的准确性和可 重复性。
米氏方程是描述酶促反应速率与底物浓度关系的方程，其形式为V=Vmax[S]/（Km+[S]），其中V代表反应速率，Vmax代表 最大反应速率，[S]代表底物浓度，Km代表米氏常数。
生化实验课件-尿液淀粉酶活力测定
澱粉酶活性單位的規定是：在37℃，30分鐘，將0.1%澱 粉溶液1mL水解後與碘液作用呈無色的酶量定為一個活 力單位。
三.操作步驟
1. 尿液等梯度稀釋
取8支試管，按次序記上號碼，各加0.9% NaCl 1 mL。 用1mL移液管加尿液1mL於第一管，使其與0.9%NaC1混合
1mL 尿液 1mL 1mL 1mL 1mL 1mL 1mL 1mL
4.顯色
各管中加稀碘液2滴
搖勻。觀察各管的顏色
四.實驗結果與分析
1.酶活力單位的計算：
選擇無色管中尿液稀釋倍數最大的一管來計算。假設第5管為無色 （從第6管起仍有紅色或藍色）。已知第5管內含尿液為1/32mL。 即1/32mL尿液能在37℃，30分鐘水解0.1%澱粉1 mL。所以，1 mL尿液在同樣條件下可水解0.1%澱粉32 mL。即每1 mL尿液中 所含澱粉酶的活性為32個活力單位。
棄之
1mLNaCl 稀釋度 1/2 1/4 1/8 1/32 1/64 1/128 1/256 對照
從第1管吸出1mL到第2管中，再從第2管吸出1mL到第3管……依次類推。 第7管吸出1mL棄之。可得分別含有尿液1/2、1/4，1/8…1/256 mL的 不同濃度的尿稀釋液，第8管不加尿液作為對照管。
2.對實驗結果進行分析
五.實驗注意事項
1.尿液取樣要準確 2.稀釋時取樣要準確 3.移液管反復沖洗 4.Fra bibliotek液不能加的太多
附：試劑與器材
1.0.9%NaC1； 2.0.1%澱粉； 3.碘化鉀一碘溶液（20gKI和10g碘溶於100mL水中，使用前稀釋10倍） 4.移液管； 5.試管； 6.恒溫水浴鍋。
2.加底物
各管加入0.1%澱粉液1mL
三.操作步驟
1. 尿液等梯度稀釋
取8支試管，按次序記上號碼，各加0.9% NaCl 1 mL。 用1mL移液管加尿液1mL於第一管，使其與0.9%NaC1混合
1mL 尿液 1mL 1mL 1mL 1mL 1mL 1mL 1mL
4.顯色
各管中加稀碘液2滴
搖勻。觀察各管的顏色
四.實驗結果與分析
1.酶活力單位的計算：
選擇無色管中尿液稀釋倍數最大的一管來計算。假設第5管為無色 （從第6管起仍有紅色或藍色）。已知第5管內含尿液為1/32mL。 即1/32mL尿液能在37℃，30分鐘水解0.1%澱粉1 mL。所以，1 mL尿液在同樣條件下可水解0.1%澱粉32 mL。即每1 mL尿液中 所含澱粉酶的活性為32個活力單位。
棄之
1mLNaCl 稀釋度 1/2 1/4 1/8 1/32 1/64 1/128 1/256 對照
從第1管吸出1mL到第2管中，再從第2管吸出1mL到第3管……依次類推。 第7管吸出1mL棄之。可得分別含有尿液1/2、1/4，1/8…1/256 mL的 不同濃度的尿稀釋液，第8管不加尿液作為對照管。
2.對實驗結果進行分析
五.實驗注意事項
1.尿液取樣要準確 2.稀釋時取樣要準確 3.移液管反復沖洗 4.Fra bibliotek液不能加的太多
附：試劑與器材
1.0.9%NaC1； 2.0.1%澱粉； 3.碘化鉀一碘溶液（20gKI和10g碘溶於100mL水中，使用前稀釋10倍） 4.移液管； 5.試管； 6.恒溫水浴鍋。
2.加底物
各管加入0.1%澱粉液1mL
酶活性的测定PPT课件
（1）样品对照：只加样品不加底物 （2）底物对照：不加样品只加底物 （3）时间对照：含有酶和底物但反应时间为零的对
照管；也可以先用蛋白沉淀剂或其他试剂停止反 应后，再加底物予以抵销。
11
酶的区域化分布
表7-3 诊断常用血清酶的来源
血清酶
符号
鸟氨酸氨基甲酰转移酶
OCT
卵磷脂胆固醇酰基转移酶 LCAT
谷氨酸脱氢酶
GLDHΒιβλιοθήκη 山梨醇脱氢酶SDH
丙氨酸氨基转移酶
ALT
异柠檬酸脱氢酶
ICD
-谷氨酰转肽酶
-GT
5ˊ-核苷酸酶
5ˊ-NT
单胺氧化酶
MAO
天门冬氨酸氨基转移酶
AST
肌酸激酶
CK
乳酸脱氢酶
LDH
碱性磷酸酶
ALP
酸性磷酸酶
ACP
淀粉酶
AMS
脂肪酶
LPS
来源
肝 肝 肝 肝 肝、肾、心 肝、胎盘、心 肝、胆、肾、小肠 肝、胆道 肝、肾、脑 心、肝、骨骼肌 骨骼肌、心、脑 心、肾、骨骼肌、肝、肺 小肠、胎盘、肝、肾 前列腺、红细胞、血小板 胰、唾液腺
5
6
米-曼氏方程：
Vmax〔S〕 v = —————
〔S〕+ Km
上式中v代表反应速度，Vmax代表最大反应速度， 〔S〕代表底物浓度，Km称为米氏常数。
7
由米-曼氏方程可以导出：
（Vmax-v）〔S〕 Km = ———————
v
当v = 1/2Vmax时，Km =〔S〕。因此Km值为反应速度相当于 最大反应速度一半时的底物浓度。Km值是酶的特征常数，具有重 要的应用价值。
应加入不抑制该酶活性的防腐剂并冰箱保存，以 防止底物被分解或变质 • 4、在测定过程中所用器材应绝对清洁，不应含有 酶的抑制物 • 5、使酶活性测定在线性期内进行
照管；也可以先用蛋白沉淀剂或其他试剂停止反 应后，再加底物予以抵销。
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酶的区域化分布
表7-3 诊断常用血清酶的来源
血清酶
符号
鸟氨酸氨基甲酰转移酶
OCT
卵磷脂胆固醇酰基转移酶 LCAT
谷氨酸脱氢酶
GLDHΒιβλιοθήκη 山梨醇脱氢酶SDH
丙氨酸氨基转移酶
ALT
异柠檬酸脱氢酶
ICD
-谷氨酰转肽酶
-GT
5ˊ-核苷酸酶
5ˊ-NT
单胺氧化酶
MAO
天门冬氨酸氨基转移酶
AST
肌酸激酶
CK
乳酸脱氢酶
LDH
碱性磷酸酶
ALP
酸性磷酸酶
ACP
淀粉酶
AMS
脂肪酶
LPS
来源
肝 肝 肝 肝 肝、肾、心 肝、胎盘、心 肝、胆、肾、小肠 肝、胆道 肝、肾、脑 心、肝、骨骼肌 骨骼肌、心、脑 心、肾、骨骼肌、肝、肺 小肠、胎盘、肝、肾 前列腺、红细胞、血小板 胰、唾液腺
5
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米-曼氏方程：
Vmax〔S〕 v = —————
〔S〕+ Km
上式中v代表反应速度，Vmax代表最大反应速度， 〔S〕代表底物浓度，Km称为米氏常数。
7
由米-曼氏方程可以导出：
（Vmax-v）〔S〕 Km = ———————
v
当v = 1/2Vmax时，Km =〔S〕。因此Km值为反应速度相当于 最大反应速度一半时的底物浓度。Km值是酶的特征常数，具有重 要的应用价值。
应加入不抑制该酶活性的防腐剂并冰箱保存，以 防止底物被分解或变质 • 4、在测定过程中所用器材应绝对清洁，不应含有 酶的抑制物 • 5、使酶活性测定在线性期内进行
《酶活力测定方法》PPT课件_OK
18
19
20
3批ｒｈＩＬ 11制品的ＲＰ ＨＰＬＣ图谱完 全一致,说明该厂ｒｈＩＬ 11的生产工艺是稳定 的;与ＧＩ公司生产的ｒｈＩＬ 11对照品比较有 20个峰与对照品一致,但第6 峰的峰高和峰面积均 明显较小,且在第9和第10 峰之间多一个峰,说明 该厂ｒｈＩＬ 11蛋白质结构与ＧＩ公司生产的 ｒｈＩＬ 11比较存在细小差别。
加热：使酶失效
不同的时间取样
终止反应
测定
8
连续测定法：在反应过程中对反应系统进 行直接连续检测。
检测方法： 紫外-可见分光光度法 旋光法 荧光分光光度法 电化学测定法 酶偶联测定法 离子选择性电极测定法等。
9
示例：胰蛋白酶效价测定 胰蛋白酶 肽键、酰氨键、酯键（碱性氨基酸） 水解速率：酯键﹥酰氨键﹥肽键 供试品溶液：50～60单位/ml 底物溶液：N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯
供试液的a每分钟改变15相当于的单位数为每mg供试品中含胰蛋白酶单位数为000316重组人白细胞介素11的胰蛋白酶切肽图分析肽图分析是评价重组产品蛋白质结构及其生产工艺稳定性的重要方法目前常用的方法有cnbr裂解sdspage微量肽图法和胰蛋白酶切rphplc肽图171
2．酶活力测定法
1）基本原理： 酶活力是指酶催化一定化学反应的能力。酶
A1 - A2
0.003 : 1 =
:X
T
A1 - A2 0.003T
每mg供试品中含胰蛋白酶单位数为
A1 - A2
0.003TW
A1—A 2 P=
0.003 T W
15
重组人白细胞介素 11的胰蛋白酶切肽 图分析
肽图分析是评价重组产品蛋白质结构及其 生产工艺稳定性的重要方法,目前常用的方 法有ＣＮＢｒ裂解ＳＤＳ-ＰＡＧＥ微量肽 图法和胰蛋白酶切ＲＰ ＨＰＬＣ肽图法。
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3批ｒｈＩＬ 11制品的ＲＰ ＨＰＬＣ图谱完 全一致,说明该厂ｒｈＩＬ 11的生产工艺是稳定 的;与ＧＩ公司生产的ｒｈＩＬ 11对照品比较有 20个峰与对照品一致,但第6 峰的峰高和峰面积均 明显较小,且在第9和第10 峰之间多一个峰,说明 该厂ｒｈＩＬ 11蛋白质结构与ＧＩ公司生产的 ｒｈＩＬ 11比较存在细小差别。
加热：使酶失效
不同的时间取样
终止反应
测定
8
连续测定法：在反应过程中对反应系统进 行直接连续检测。
检测方法： 紫外-可见分光光度法 旋光法 荧光分光光度法 电化学测定法 酶偶联测定法 离子选择性电极测定法等。
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示例：胰蛋白酶效价测定 胰蛋白酶 肽键、酰氨键、酯键（碱性氨基酸） 水解速率：酯键﹥酰氨键﹥肽键 供试品溶液：50～60单位/ml 底物溶液：N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯
供试液的a每分钟改变15相当于的单位数为每mg供试品中含胰蛋白酶单位数为000316重组人白细胞介素11的胰蛋白酶切肽图分析肽图分析是评价重组产品蛋白质结构及其生产工艺稳定性的重要方法目前常用的方法有cnbr裂解sdspage微量肽图法和胰蛋白酶切rphplc肽图171
2．酶活力测定法
1）基本原理： 酶活力是指酶催化一定化学反应的能力。酶
A1 - A2
0.003 : 1 =
:X
T
A1 - A2 0.003T
每mg供试品中含胰蛋白酶单位数为
A1 - A2
0.003TW
A1—A 2 P=
0.003 T W
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重组人白细胞介素 11的胰蛋白酶切肽 图分析
肽图分析是评价重组产品蛋白质结构及其 生产工艺稳定性的重要方法,目前常用的方 法有ＣＮＢｒ裂解ＳＤＳ-ＰＡＧＥ微量肽 图法和胰蛋白酶切ＲＰ ＨＰＬＣ肽图法。
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浓度：A：0.575～.0585 N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯 N-苯甲酰-L-精氨酸
10
NH-CO-
H2N-C-NH2CH2CH2-CH-CO2OH5C
253nm处的A随酶促反应递增， 根据酶活力单位定义计算酶活力。
11
酶活性单位：在最适的条件下，每分钟能 转化一个微摩尔底物的酶量定为一个活性 单位。 测定： 空白：底物溶液 + 0.001mol/L HCl
21
返回
22
练习与思考
1．何谓：生化药物、生物技术药物、 基因工程药物和生物制品？ 2．生化药物和基因工程药物各分哪 几种？ 3．与化学合成药物的分析相比，生 物药物的分析有何特点？
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23
16
1。酶切条件
取浓度为3ｍｇ·ｍＬ-1的样品0 4ｍＬ对1%Ｎ
Ｈ4ＨＣＯ3充分透析,然后取透析样品250μＬ至 微量进样瓶,加0 3ｍｇ·ｍＬ-1ＴＰＣＫ处理的胰
蛋白酶10μＬ混匀,于37℃温控自动进样器酶切,
每80ｍｉｎ进样一针,进样量6μＬ,用Ｍｉｌｌｅ
ｎｎｉｕｍ32色谱软件选择214ｎｍ进行分析,直
2
酶反应进程曲线 纵坐标为底物或产物的变化量， 横坐标为反应时间，曲线斜率表示反应速度。 从酶反应进程曲线求得反应的初速度。 酶浓度曲线 纵坐标为反应速度，横坐标为酶量。 通过酶浓度曲线检验反应测定系统是否适宜。
3
4
酶活力测定的要求：测得的反应速度 必须和酶浓度有线性的比例关系，这 也是检验酶反应和测定系统是否适宜、 正确的标准。
6
空白和对照试验： 空白试验：是指杂质反应和自发反应引起
的变化量，它提供的是未知因素的影响。空 白值可以通过不加酶，或不加底物，或二者 都加（酶预先经过失效处理）。
对照试验：是指用纯酶或标准酶制剂测得 的结果，主要作为比较或标定的标准。
7
3）测定方法：
取样测定法：
酶变性剂：5% 三氯醋酸 3% 高氯酸 其它酸、碱、醇类
至ｒｈＩＬ 11完全酶解。按此方法摸索最佳酶
切时间,在第14针后ｒｈＩＬ 11已被完全酶切,酶
切时间在18～22ｈ范围内肽图图谱基本一致,即
确定最佳酶切条件为37℃保温20ｈ。
17
2。ＨＰＬＣ系统测试
ＨＰＬＣ系统测试标准物质进样后呈3个峰,12
次 重 复 进 样 3 个 峰 保 留 时 间 的 Ｒ Ｓ Ｄ 分 别 为 0.
2．酶活力测定法
1）基本原理： 酶活力是指酶催化一定化学反应的能力。酶
活力测定实质上是测定一个被酶所催化的化学 反应速度。酶反应速度越快所表示的酶活力越 高。
1
酶反应速度可以用单位时间反应底 物的减少或产物的增加来表示。
通常酶活力测定时，先制备酶反应进 程曲线和酶浓度曲线。通过酶反应速度 的测定，求得酶的浓度或含量。
加热：使酶失效
酶反应 不同的时间取样
终止反应
测定
8
连续测定法：在反应过程中对反应系统进 行直接连续检测。
检测方法： 紫外-可见分光光度法 旋光法 荧光分光光度法 电化学测定法 酶偶联测定法 离子选择性电极测定法等。
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示例：胰蛋白酶效价测定 胰蛋白酶 肽键、酰氨键、酯键（碱性氨基酸） 水解速率：酯键﹥酰氨键﹥肽键 供试品溶液：50～60单位/ml 底物溶液：N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯
12
供 试 品 溶 液 + 底 物 溶 液
计 时 摇 匀
25.0。 C— +0.5。 C
测 定 ： 每 隔30s， 读 取 A， 共5min
每30s A的改变：0.015～0.018，呈 线性关系的时间不得少于3min。
13
A每分钟改变0.003，相当于1个胰蛋白 酶单位。
供试液的A每分钟改变
A1 - A2 T
14
相当于的单位数为
A1 - A2
0.003:1=
:X
T
A1 - A2 0.003T
每mg供试品中含胰蛋白酶单位数为
A1 - A2
0.003TW
A1—A2
P=
0.003 T W
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重组人白细胞介素 11的胰蛋白酶切肽 图分析
肽图分析是评价重组产品蛋白质结构及其 生产工艺稳定性的重要方法,目前常用的方 法有ＣＮＢｒ裂解ＳＤＳ-ＰＡＧＥ微量肽 图法和胰蛋白酶切ＲＰ ＨＰＬＣ肽图法。
统误差小,重复性好,可用于ｒｈＩＬ11的肽图分
析。
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20
3批ｒｈＩＬ 11制品的ＲＰ ＨＰＬＣ图谱 完全一致,说明该厂ｒｈＩＬ 11的生产工艺是稳 定的;与ＧＩ公司生产的ｒｈＩＬ 11对照品比较 有20个峰与对照品一致,但第6 峰的峰高和峰面 积均明显较小,且在第9和第10 峰之间多一个峰, 说明该厂ｒｈＩＬ 11蛋白质结构与ＧＩ公司生 产的ｒｈＩＬ 11比较存在细小差别。
5
2）酶促反应的条件及影响因素 底物的浓度：一般选用底物的浓度[S]=100Km。 pH：选用一个适宜的缓冲离子和离子强度、 适宜的pH值的缓冲系统来控制pH。 温度：酶反应的温度通常选用25℃、30℃或 37℃，实验中温度变动应控制在±0.1℃以内。 辅助因子：有些酶需要金属离子，有些需要 相应的辅酶。
4%,0 .6% 和 0. 8%, 峰 面 积 的 Ｒ Ｓ Ｄ 分 别 为
0 .7%,0 .8%和0 .8%。ｒｈＩＬ 11对照品
37℃酶切20ｈ后于4℃温控自动进样器连续进
样5次,结果见图1。5个色谱图完全重叠在一起,
所产生21个峰的保留时间、峰高和峰面积的Ｒ
ＳＤ均分别小于1 .0%,5 .4%和9. 8%,表明本系
10
NH-CO-
H2N-C-NH2CH2CH2-CH-CO2OH5C
253nm处的A随酶促反应递增， 根据酶活力单位定义计算酶活力。
11
酶活性单位：在最适的条件下，每分钟能 转化一个微摩尔底物的酶量定为一个活性 单位。 测定： 空白：底物溶液 + 0.001mol/L HCl
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返回
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练习与思考
1．何谓：生化药物、生物技术药物、 基因工程药物和生物制品？ 2．生化药物和基因工程药物各分哪 几种？ 3．与化学合成药物的分析相比，生 物药物的分析有何特点？
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1。酶切条件
取浓度为3ｍｇ·ｍＬ-1的样品0 4ｍＬ对1%Ｎ
Ｈ4ＨＣＯ3充分透析,然后取透析样品250μＬ至 微量进样瓶,加0 3ｍｇ·ｍＬ-1ＴＰＣＫ处理的胰
蛋白酶10μＬ混匀,于37℃温控自动进样器酶切,
每80ｍｉｎ进样一针,进样量6μＬ,用Ｍｉｌｌｅ
ｎｎｉｕｍ32色谱软件选择214ｎｍ进行分析,直
2
酶反应进程曲线 纵坐标为底物或产物的变化量， 横坐标为反应时间，曲线斜率表示反应速度。 从酶反应进程曲线求得反应的初速度。 酶浓度曲线 纵坐标为反应速度，横坐标为酶量。 通过酶浓度曲线检验反应测定系统是否适宜。
3
4
酶活力测定的要求：测得的反应速度 必须和酶浓度有线性的比例关系，这 也是检验酶反应和测定系统是否适宜、 正确的标准。
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空白和对照试验： 空白试验：是指杂质反应和自发反应引起
的变化量，它提供的是未知因素的影响。空 白值可以通过不加酶，或不加底物，或二者 都加（酶预先经过失效处理）。
对照试验：是指用纯酶或标准酶制剂测得 的结果，主要作为比较或标定的标准。
7
3）测定方法：
取样测定法：
酶变性剂：5% 三氯醋酸 3% 高氯酸 其它酸、碱、醇类
至ｒｈＩＬ 11完全酶解。按此方法摸索最佳酶
切时间,在第14针后ｒｈＩＬ 11已被完全酶切,酶
切时间在18～22ｈ范围内肽图图谱基本一致,即
确定最佳酶切条件为37℃保温20ｈ。
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2。ＨＰＬＣ系统测试
ＨＰＬＣ系统测试标准物质进样后呈3个峰,12
次 重 复 进 样 3 个 峰 保 留 时 间 的 Ｒ Ｓ Ｄ 分 别 为 0.
2．酶活力测定法
1）基本原理： 酶活力是指酶催化一定化学反应的能力。酶
活力测定实质上是测定一个被酶所催化的化学 反应速度。酶反应速度越快所表示的酶活力越 高。
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酶反应速度可以用单位时间反应底 物的减少或产物的增加来表示。
通常酶活力测定时，先制备酶反应进 程曲线和酶浓度曲线。通过酶反应速度 的测定，求得酶的浓度或含量。
加热：使酶失效
酶反应 不同的时间取样
终止反应
测定
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连续测定法：在反应过程中对反应系统进 行直接连续检测。
检测方法： 紫外-可见分光光度法 旋光法 荧光分光光度法 电化学测定法 酶偶联测定法 离子选择性电极测定法等。
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示例：胰蛋白酶效价测定 胰蛋白酶 肽键、酰氨键、酯键（碱性氨基酸） 水解速率：酯键﹥酰氨键﹥肽键 供试品溶液：50～60单位/ml 底物溶液：N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯
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供 试 品 溶 液 + 底 物 溶 液
计 时 摇 匀
25.0。 C— +0.5。 C
测 定 ： 每 隔30s， 读 取 A， 共5min
每30s A的改变：0.015～0.018，呈 线性关系的时间不得少于3min。
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A每分钟改变0.003，相当于1个胰蛋白 酶单位。
供试液的A每分钟改变
A1 - A2 T
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相当于的单位数为
A1 - A2
0.003:1=
:X
T
A1 - A2 0.003T
每mg供试品中含胰蛋白酶单位数为
A1 - A2
0.003TW
A1—A2
P=
0.003 T W
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重组人白细胞介素 11的胰蛋白酶切肽 图分析
肽图分析是评价重组产品蛋白质结构及其 生产工艺稳定性的重要方法,目前常用的方 法有ＣＮＢｒ裂解ＳＤＳ-ＰＡＧＥ微量肽 图法和胰蛋白酶切ＲＰ ＨＰＬＣ肽图法。
统误差小,重复性好,可用于ｒｈＩＬ11的肽图分
析。
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3批ｒｈＩＬ 11制品的ＲＰ ＨＰＬＣ图谱 完全一致,说明该厂ｒｈＩＬ 11的生产工艺是稳 定的;与ＧＩ公司生产的ｒｈＩＬ 11对照品比较 有20个峰与对照品一致,但第6 峰的峰高和峰面 积均明显较小,且在第9和第10 峰之间多一个峰, 说明该厂ｒｈＩＬ 11蛋白质结构与ＧＩ公司生 产的ｒｈＩＬ 11比较存在细小差别。
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2）酶促反应的条件及影响因素 底物的浓度：一般选用底物的浓度[S]=100Km。 pH：选用一个适宜的缓冲离子和离子强度、 适宜的pH值的缓冲系统来控制pH。 温度：酶反应的温度通常选用25℃、30℃或 37℃，实验中温度变动应控制在±0.1℃以内。 辅助因子：有些酶需要金属离子，有些需要 相应的辅酶。
4%,0 .6% 和 0. 8%, 峰 面 积 的 Ｒ Ｓ Ｄ 分 别 为
0 .7%,0 .8%和0 .8%。ｒｈＩＬ 11对照品
37℃酶切20ｈ后于4℃温控自动进样器连续进
样5次,结果见图1。5个色谱图完全重叠在一起,
所产生21个峰的保留时间、峰高和峰面积的Ｒ
ＳＤ均分别小于1 .0%,5 .4%和9. 8%,表明本系