脂肪酶酶活测定方法
脂肪酶活检测原理及方法
脂肪酶活检测原理及实际方法：一、原理以及标准曲线做法1. 对硝基苯酚酯( 4-Nitrophenyl ester )是脂肪酶水解活力测定中运用最为广泛的一种底物，脂肪酶水解其产生pNP(对硝基苯酚)在碱性条件下显黄色，在410nm 下有吸光值，且灵敏度很高。
2. 所需试剂有：CAS 碳链长度出货号价格名称830-03-5C2N8130-1G ￥462 对硝基苯乙酸酯2635-54-9 C4 N9876-1G￥570 对硝基苯丁酸酯1956-10-1 C821742-1G-F ￥487 对硝基苯辛酸酯1956-11-2 C12 61716-1G ￥435 对硝基苯月桂酸酯1492-30-4 C16 N2752-1G ￥379 对硝基苯棕榈酸酯14617-86-8C18 N3627-1G￥对硝基苯硬酸脂全部为色谱纯试剂，购于sigma 公司3. 标准曲线绘制：a. 标准对硝基苯酚母液(2mM ，2mmol / L): 称取的对硝基苯酚(p-NP)溶于100ml 的溶液B(即不同pH 的缓冲液) ，置于棕色试剂瓶内，4℃冰箱保存。
方法一：b. 标准曲线绘制：分别取，，，，，的对硝基苯酚母液(2mM) ，用溶液B(即不同pH 的缓冲液)稀释至4ml ，分别测定在410nm 处的吸收值。
以对硝基苯酚浓度x(对应浓度分别是，，，，，，单位：mM ) 为横坐标，吸光值y 为纵坐标，绘制标准曲线。
方法二：全部对硝基苯酚经过与测酶活相同的处理，获得吸光度。
b.标准曲线的绘制：分别取0、、、、15、、30、45μL的对硝基苯酚分别加入、、、55、、40、、μL的异丙醇和(全部都是)的溶液B，40℃15min，95%乙醇，10000r / min ，3min ，测出标准曲线。
上表是方法一测得标准曲线脂肪酶酶活定义：在410nm 下测定吸光值, 以 1 min 内催化水解底物对硝基苯棕榈酸酯(p-NPP)产生1μmol 对硝基苯酸(p-NP) 所需的酶量为 1 个酶活单位(U)。
脂肪酶活力测定方法及其比较
万方数据苯萃取后进行比色测定．酶的活力单位定义同平板法．酶活计算同铜皂法．１．３．３对硝基苯酚法对硝基苯酚法是以对硝基苯酚酯作为底物，脂肪酶水解底物产生具有颜色的对硝基苯酚，在４２０ｎｍ波长下测出其吸光光度值，再对照对硝基苯酚吸光度工作曲线得出脂肪酶活力．这样可以使操作更加简单同时可以避免金属离子的干扰［２．１８｜．酶的活力单位定义为检测条件下每分钟产生１ｂｔｍｏｌ对硝基苯酚所需的脂肪酶量，其计算公式为：脂肪酶活力一ＶＮ（Ｃ（样）一Ｃ（空白））／丁／Ｖ（稀释酶液）．式中。
Ｖ反应总体积，Ｎ稀释倍数，Ｃ根据吸光度Ａ求出的对硝基苯酚的浓度，ｔ反应时间，ｙ（稀释酶液）稀释酶液的体积．２３种方法的比较２．１实验仪器和操作难易程度的比较平板法所使用的主要仪器是超净工作台，微量注射器。
培养皿，恒温培养箱，价格便宜，操作简单Ｌ２·１３］；滴定法仅需要酸碱滴定管、试管、恒温水浴锅、酸度计、高速组织捣碎机等一些比较常见，操作简单［”］；比色法包括铜皂法、微乳液法和对硝基苯酚法．铜皂法使用的主要仪器是分光光度计。
超声波装置，仪器较常见，但操作繁琐［１５］；微乳液法使用的仪器主要是分光光度计，操作简单。
精确度高Ｌ１６—１７］；对硝基苯酚法所使用的仪器主要是分光光度计。
操作简单［２·１８］（表１）．２．２实验试剂及精确度的比较平板法使用的试剂主要有维多利亚蓝、三丁酸甘油脂、罗丹明Ｂ等，该实验反应时间长且精确度差［１１］．滴定法所使用的主要试剂有氢氧化钠、酸碱指示剂、聚乙烯醇、橄榄油等［１３｜．滴定中酸碱指示剂不能很好地指示反应终点，即使用酸度计代替酸碱指示剂控制反应终点，产物中丙酮酸的干扰使实验的结果偏大［１ｌ’１９］．铜皂法中的底物有３种：榄橄油，三油酸甘油脂和三丁酸甘油脂［１５］．其中榄橄油作为底物，精确度不高，当用三油酸甘油脂和三丁酸甘油脂作为底物检测脂肪酶的活性。
精确度较高．微乳液法使用的试剂有三油酸甘油脂，吐温一８０和正己烷，实验重复性好，精确度高Ｌ１６。
脂肪酶
显色剂，均匀搅拌3min，油酸分子与Cu2+
生成绿色的络合物，4000r/min离心10min
后取上层有机相在710nm处测定吸光度。
（三）、对硝基苯酚法
1、溶液配制准备
底物溶液配制:量取对硝基苯酚棕榈酸酯(pNPP)0.0378g，加入Triton X-100 1mL，用50mmoL/L Tris-HCL缓冲液（pH值8.0）定容100mmL。
8
9
10
10
20
14
38
33
五、结果与讨论
测定速度： 滴定法 稳定性： 铜皂法 铜皂法 对硝基苯酚法 对硝基苯酚法 滴定法
灵敏度：
对硝基苯酚法
铜皂法
滴定法
实际应用中，可根据不同需要选择测定方法。
酶相互间无法进行正常的活力比较。本实验就酸
碱ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ定法、铜皂法、对硝基苯酚法三种常用方法 进行了比较。
二、实验材料
脂肪酶，生物工程研究室提供
榨汁机，分析天平，碱性滴定管， 分光光度计，pH计，离心机，恒温水浴锅
脂肪酶活力单位
脂肪酶活力单位定义：在一定条件下，
每分钟释放出1μmoL脂肪酸的酶的量定义为
一个脂肪酶活力单位（U）。
三、实验方法
（一）、滴定法
底物溶液（乳化液）配制:量取4%PVA溶液150mL, 加入橄榄油50mL，用榨汁机处理3min，现配现用。
脂肪酶溶液配制:配制pH值为7.38的0.5mg/mL脂
肪酶溶液。
(二)、铜皂法
1、脂肪酸吸光度标准曲线的绘制
配制一系列不同浓度的油酸溶液，分别 取4mL油酸溶液置于锥形瓶中，加入1mL
18.32
16.98
19.23
脂肪酶实验方案
脂肪酶实验方案富集培养基( %) :酵母膏0. 02 , Na2HPO4 0.35 , K2HPO4 0. 15 , MgSO4·7H2O 0. 05 , NaCl 0.05 , 橄榄油1. 0 , pH 7. 0.溴甲酚紫筛选平板分离培养基 ( %) : 牛肉膏0. 5 , 蛋白胨1. 0 , NaCl 0. 5 ,葡萄糖0. 3 ,聚乙烯醇1. 0 ,橄榄油2. 5 , 琼脂1. 5 ;灭菌后加入过滤灭菌的溴甲酚紫(50 mg/ 100 mL) 0. 4 mL , pH 6.0 ,7.0 ,8. 0.种子培养基( %) :葡萄糖 2. 0 , (NH4 ) 2SO4 0.5 , K2HPO4 0.1 ,MgSO4·7H2O 0. 05 , 蛋白胨2. 5 ,橄榄油1. 0 , pH 7. 0.发酵培养基( %) :蛋白胨2. 0 , 蔗糖0. 5 , 橄榄油1. 0 , (NH4 ) 2SO4 0. 1 , MgSO4 〃7H2O 0. 05 ,K2HPO4 0. 1 ,pH 自然产脂肪酶菌株的筛选：将细菌接种到种子培养基上，于30 ℃,200 r/ min 摇床培养24 h，划线于溴甲酚紫筛选平板分离培养基上。
观察已生长的菌落周围有无透明圈,有红色水解圈的菌落对应的菌株即为产脂肪酶菌株。
脂肪酶高产菌株的筛选：（1）产脂肪酶菌株发酵培养：将产脂肪酶菌液按 1 %的接种量接入50 mL 发酵培养基中(250 mL 三角瓶) ,30 ℃,200 r/ min 摇床培养48 h；（2）上清液的制备：经6000 rpm/min离心10 min，收集上清液，用0.20 μm滤膜对上清液过滤除菌，滤液分装后-20℃保存待用；（3）(i)度法测定各菌株产酶相对大小：在pH7.5, 30℃条件下, 每分钟释放 1 μmol 对-硝基酚( ρ- nitrophenol) 所需的酶量, 定义为一个活力单位。
脂肪酶的测定
脂肪酶的测定脂肪酶是一种能够加速脂肪分解的酶类物质，它在人类的体内起着非常重要的作用。
脂肪酶的测定是衡量人体脂肪代谢能力的一种方法，可以用于研究肥胖、代谢疾病等疾病的发病机制。
脂肪酶的测定方法有很多种，其中最常用的是化学法和免疫法。
化学法是利用化学反应测定脂肪酶的活性，它的原理是将样品与一种特定底物反应，通过测定产生的底物或反应产物的浓度，来计算脂肪酶的活性。
常用的底物有三酰甘油、辅酶A等。
免疫法则是利用特异性抗体与脂肪酶结合反应，进行测定。
这种方法具有灵敏度高、特异性好、操作简单等优点。
在进行脂肪酶测定前，需要收集样品。
常用的样品有血浆、血清、尿液等。
对于血浆和血清样品，需要在采集后立即离心分离血清或血浆，避免冷藏时间过长而影响测定结果。
对于尿液样品，需要在采集后立即保存在冰箱中，避免样品在室温下发生酶解反应。
此外，还需要注意样品的质量和数量，以保证测定结果的准确性。
脂肪酶的测定结果可以反映人体脂肪代谢能力的强弱。
正常情况下，脂肪酶的活性处于一定的范围内。
如果脂肪酶活性过高，说明人体脂肪代谢能力较强，有利于减肥和预防肥胖等疾病；反之，如果脂肪酶活性过低，说明人体脂肪代谢能力较弱，容易出现肥胖和代谢性疾病等问题。
需要注意的是，脂肪酶的测定结果并不是唯一的评估指标，还需要结合其他指标如体重、体脂率、血糖、血脂等指标进行综合分析。
此外，脂肪酶的测定结果也受到许多因素的影响，如年龄、性别、饮食、运动等因素都会对脂肪酶活性产生影响，因此需要综合考虑。
脂肪酶的测定是衡量人体脂肪代谢能力的一种方法，它对于研究肥胖和代谢疾病等疾病的发病机制具有重要的意义。
在进行脂肪酶测定时，需要注意样品的采集、处理和测定方法的选择，以保证测定结果的准确性。
脂肪酶活力检测方法分析
▲制备乳化液
第一次制作乳化液选择高速捣碎机。
将４％ＰＶＡ溶液１００ ｍＬ和底物混合，可以在冰箱中静置５￣１０℃保持１￣２ ｈ，随后向捣碎机转移，这样操作９ ｍｉｎ ３次，乳化液可以保存在冰箱中，在之后的每一次使用时重新实施乳化。
第二可以选择乳化液初步选择超定的功率下严格实施超声乳化处理，在对底物乳化温度控制时可以考虑使用水浴，在冰箱中储存乳化液，再一次应用时需要重新实施乳化。
检测脂肪酶活力的方法
▲抽提正己烷方法
在甘氨酸缓冲液中放置１ ｍＬ橄榄油，添加规定数量的酶液在３７℃的情况。
脂肪酶的检测方法
脂肪酶的检测方法1. 引言脂肪酶是一类能催化脂肪酯的水解反应的酶。
脂肪酶在食品工业、医学领域等具有重要的应用价值。
为了准确、快速地检测脂肪酶的活性和浓度，科学家们开发了多种检测方法。
本文将详细介绍脂肪酶的相关概念以及常用的检测方法，并对其优缺点进行比较分析。
2. 脂肪酶的概述脂肪酶是一种水解酶，主要催化脂肪酯的水解反应，将脂肪酯分解为甘油和脂肪酸。
脂肪酶广泛存在于动植物的组织中，如胃液、胆汁、胰液等。
脂肪酶的作用对于人体的脂肪消化和吸收至关重要，但过高或过低的脂肪酶活性都可能对人体健康产生不良影响。
3. 脂肪酶的检测方法概述常见的脂肪酶检测方法包括传统的酶活性测定法、光谱法、电化学法、电镜法等。
下面将分别介绍这些方法的原理、步骤以及优缺点。
3.1 传统的酶活性测定法•原理：该方法通过测定脂肪酶对底物的水解反应，间接反映脂肪酶的活性。
•步骤：1.准备含有脂肪酶的样品和底物溶液。
2.混合样品和底物溶液，并控制反应条件（温度、pH等）。
3.反应一段时间后停止反应。
4.使用比色法、比浊法等方法来测定反应产物（如甘油）的含量。
•优点：方法简单、成本低廉。
•缺点：测定结果受其他干扰物影响较大，灵敏度相对较低。
3.2 光谱法•原理：该方法利用脂肪酶催化反应过程中底物或产物的光学性质变化来检测脂肪酶活性。
•步骤：1.准备含有脂肪酶的样品和底物溶液。
2.在一定时间内记录底物或产物的光谱变化。
3.分析光谱数据，计算脂肪酶活性。
•优点：结果准确、灵敏度较高。
•缺点：需要专用的光谱仪器，成本相对较高。
3.3 电化学法•原理：该方法利用脂肪酶催化反应过程中产生的电流或电势变化来检测脂肪酶活性。
•步骤：1.在电极表面修饰脂肪酶或底物，并固定在电极上。
2.浸入电解质溶液中，建立电化学检测系统。
3.测量电流或电位的变化，并计算脂肪酶活性。
•优点：结果准确、实时监测。
•缺点：需要专用的电化学仪器，操作复杂。
3.4 电镜法•原理：该方法通过电镜观察样品中脂肪酶的形态和数量来评估脂肪酶活性。
橄榄油乳化法
2.3.2脂肪酶酶活的测定
采用橄榄油乳化法测定。
酶活定义：脂肪酶在40℃，pH8.0水解橄榄油乳化液每分钟产生1μmol 的脂肪酸所耗的酶量，即为1个脂肪酶活力单位。
（1）底物的制备：
A．称取PVA 20g，加入800mL水，在沸水中加热搅拌，直至全部溶解，冷却后定容至1000mL，得2%PVA溶液。
以干净的双层纱布过滤，取滤液备用。
B．量取2%PVA溶液150mL，加橄榄油50 mL，用高速组织捣碎机处理6min，即成乳白色PVA溶液，该溶液现配现用，冷藏有效期为1周。
（2）测定方法：
取两个150mL的锥形瓶，编号为空白A和样品B。
分别于A和B中各加入5 mL底物溶液和4mLpH8.0的磷酸缓冲液，再向A中加入20 mL无水乙醇。
将A、B 于40℃水浴5min，然后向A、B中各加入待测酶液1 mL，立即混匀计时，40℃水浴10min后，向B中补加20 mL无水乙醇终止反应，取出。
将A和B中加两滴酚酞，用0.05mol/LNaOH溶液滴定，直至微红色并保持30秒不褪色为终点，记录耗NaOH溶液的体积。
脂肪酶活力=（b-a）×N×F/T
式中：b——样品耗NaOH溶液毫升数；
a——空白耗NaOH溶液毫升数；
N——每毫升NaOH的微摩尔数；
F——稀释倍数；
T——反应时间（min）。
由于缓冲液离子强度低，为减小误差，反应后净耗0.05mol/LNaOH溶液体积为1.5～2.5mL为宜。
脂肪酶的检测方法
脂肪酶的检测方法
脂肪酶是一种重要的酶类物质，它在人体内起着分解脂肪的作用。
脂肪酶的检测方法有多种，下面将介绍其中的几种常见方法。
1. 酶活力测定法
酶活力测定法是一种常见的脂肪酶检测方法。
该方法通过测定脂肪酶对底物的催化作用，来确定脂肪酶的活力。
具体操作步骤为：将待测样品与底物混合，加入适量的缓冲液，然后在一定的温度和时间下反应。
反应结束后，通过测定反应液中的产物浓度或底物消耗量来计算脂肪酶的活力。
2. 免疫学检测法
免疫学检测法是一种基于抗体与抗原相互作用的检测方法。
该方法通过检测脂肪酶在样品中的含量，来确定脂肪酶的水平。
具体操作步骤为：将待测样品与特异性抗体结合，形成抗原-抗体复合物。
然后加入标记有荧光物质的二抗，使其与复合物结合。
最后通过荧光信号的强度来测定脂肪酶的含量。
3. 基因检测法
基因检测法是一种通过检测脂肪酶基因的变异来确定脂肪酶水平的方法。
该方法通过PCR扩增脂肪酶基因，然后对扩增产物进行测序，检测基因序列中的变异情况。
根据不同的基因变异类型，可以预测脂肪酶的活力水平。
总之，脂肪酶的检测方法有多种，每种方法都有其特点和适用范围。
在实际应用中，应根据需要选择合适的方法进行检测。
[整理]脂肪酶活测定
![[整理]脂肪酶活测定](https://img.taocdn.com/s3/m/3ac28d35182e453610661ed9ad51f01dc28157ad.png)
一．脂肪酶活测定原理：脂肪酶在一定条件下，将甘油三酯水解。
在不同水解阶段可分别产生脂肪酸、甘油二酯、甘油一酯及甘油。
水解所产生的脂肪酸可以用标准的氢氧化钠滴定，用滴定值表示酶活力。
酸碱滴定法 :酶活力以国际单位表示，即在一定条件下，脂肪酶水解脂肪每分钟产生1微克分子脂肪酸的酶量定为一个国际单位。
脂肪酶活力单位＝(A-B)*nf/t*v式中：A为样品耗碱液ml数，B为对照组耗碱液ml数，n为每毫升碱液微克分子数(n=cM=0.05x23x1000)，f为稀释倍数，t为作用时间(分),v:反应的酶液的体积二．挥发性脂肪酸（VFA）的测定滴定法分析1原理：将废水以磷酸酸化后，从中蒸发出挥发性脂肪酸，再以酚酞为指示剂用NaOH 溶液滴定馏出液。
废水中的氨态氮可能对测定形成干扰，因此应当首先在碱性条件下蒸发出氨态氮。
4．计算挥发性脂肪酸含量计算如下：VFA=V (NaOH)*C*1000/Vs (mmol/L)式中：V(NaOH)-----滴定消耗的NaOH标准溶液的体积，ml;c ------ 滴定消耗的NaOH标准溶液的准确浓度，mol/L;Vs--------被测废水水样的体积，ml.酶活力定义：40℃,ph为5.6的条件下，每分钟酶解淀粉释放出lmg的还原糖(葡萄糖)所需酶量为一个酶活力单位。
1U=1mg还原糖\min.ml酶三．淀粉水解酶活性原理：淀粉的水解产物麦芽糖及其他还原性糖能与3，5-二硝基水杨酸试剂反应，使其还原生成红色3-氨基-5-硝基水杨酸。
在一定范围内，其颜色深浅与淀粉酶水解产物的浓度成正比，可用麦芽糖(或葡萄糖)浓度表示，用比色法测定淀粉生成的还原糖的量，以单位体积样品在一定时间内生成的麦芽糖的量表示酶活力。
四.纤维素酶酶活力测定：原理：纤维素酶水解纤维素，产生的纤维二糖、葡萄糖等还原糖，能将3,5-二硝基水杨酸中硝基还原成橙黄色的氨基化合物，在550nm波长处有最大光吸收，在一定的范围内，还原糖的量与反应液的颜色强度成比例关系，利用比色法测定其还原糖的量就可测定纤维素酶的活力。
土壤脂肪酶活性检测
迪信泰检测平台
土壤脂肪酶活性检测
脂肪酶（Lipase, LPS），又称为甘油酯水解酶，催化甘油三酯水解生成脂肪酸和甘油（或者甘油二酯和单酯），普遍存在于动植物组织及微生物中。
土壤脂肪酶在土壤生物动力学中具有重要的作用。
迪信泰检测平台采用生化法，可高效、精准的检测土壤脂肪酶活性。
此外，我们还提供其他土壤酶类检测服务，以满足您的不同需求。
生化法测定土壤脂肪酶样本要求：
1. 请确保样本量大于0.2g或者0.2mL。
周期：2~3周。
项目结束后迪信泰检测平台将会提供详细中英文双语技术报告，报告包括：
1. 实验步骤（中英文）。
2. 相关参数（中英文）。
3. 图片。
4. 原始数据。
5. 土壤脂肪酶活性信息。
迪信泰检测平台可根据需求定制其他物质测定方案，具体可免费咨询技术支持。
酶活测定方法(翻译)
测定方法（FIP法脂肪酶，pH 7）步骤：分析“真菌脂肪酶国际f.i.p.标准”通过自动滴定：在反应容器中添加底物乳液24毫升，蒸馏水9毫升，2毫升的牛磺胆酸钠溶液。
在37℃±0.5℃预培养反应容器10±15分钟。
将pH电极和滴定管的前端浸入到该溶液中。
将氮气轻轻的吹到溶液中（可选）。
用0.02 N NaOH将pH值调整至7。
设置自动滴定管至零。
添加精确的5毫升的酶溶液；同时开始计时。
用自动滴定法维持pH值在7。
10分钟后，立即“手动”加入滴定剂（0.02n NaOH）把pH值提升至9。
这必须在30秒内完成。
读出滴定管体积并记录0.02N的NaOH消耗的体积（N1）。
用相同的方法再做一次空白对照组，但是要将另外加入酶的时间延迟在滴定的PH值为9的时候。
由于酶降低pH值，当pH 值再返回为9时，进一步添加氢氧化钠0.02N。
读取并记录0.02n NaOH消耗量（N2）。
通过手动滴定：该程序是相同的自动滴定法，用手动滴定从0.02 n ，25毫升的氢氧化钠滴定管,滴下0.02毫升，使pH值保持在7.0。
计算:一个单位的酶活性（FIP单元）是指数量的一个标准（真菌脂肪酶脂肪酶制剂国际f.i.p.标准），根据所描述的测定条件，每分钟从橄榄油中释放1µmol的脂肪酸。
比活性被表示为国际FIP 单位每毫克酶制剂。
用公式计算酶制剂的活性1ml 0.02N的NaOH对应于中和20µmol的脂肪酸。
5ml酶溶液每间隔10分钟的时间释放（N1-N2）20毫升×µ摩尔脂肪酸。
如果酶液中含有C毫克的酶制剂/毫升，具体的活性计算如下：其中（N1 - N 2）体积（毫升）的NaOH是用于滴定。
使用已知活性的酶参考标准，它是由“中心委员会标准”控制的，消除了由于在试剂（如阿拉伯树胶，橄榄油，衬底乳剂）的质量，实验室间的差异或在实验设置上存在的差异。
酶活性使用参考标准（FIP单位/毫克）由下式计算其中A是单位/毫克的测试样品（测量）；B是真菌脂肪酶国际f.i.p. /毫克单位标准（测量）;C 是真菌脂肪酶f.i.p. FIP国际标准单位/ mg（瓶子上的说明）。
脂肪酶酶活测定方法
0.05mol/L氢氧化钠按GB/T601配制与标定。
使用时稀释10倍。
10g/LGB/T603配制。
1.5 待测酶液的制备称取酶样品1g~2g，精确至0.0002g，用磷酸缓冲液溶解并稀释。
如果是粉末，可加少量缓冲液研磨再稀释。
测定时控制酶液浓度，样品与对照消耗碱量之差控制在1mL~2mL范围内。
1.6 测定1.6.1 电位滴定法①②取两个100mL烧杯，分别作为空白A和样品B，分别参加底物溶液4mL和缓冲液5mL，再于A中参加95％酒精15.00mL，于40℃±0.2℃水浴中预热5min，然后各加1mL酶液，立即混匀计时，准确反响15min后，于B中立即补加15.00mL95％酒精终止反响，取出。
③在烧杯中参加一转子，置于电磁搅拌器上，边搅拌，边用氢氧化钠标准溶液滴定，至pH10.3，为滴定终点，记录消耗氢氧化钠标准溶液的体积。
1.6.2①取两个100mL三角瓶，分别作为空白A和样品B，分别参加底物溶液4mL和缓冲液5mL，再于A中参加95％酒精15.00mL，于40℃±0.2℃水浴中预热5min，然后各加1mL酶液，立即混匀计时，准确反响15min后，于B中立即补加15.00mL 95％酒精终止反响，取出。
②于A、B瓶中各酚酞两滴，用氢氧化钠标准溶液滴定，直至微红色并保持30s不退色为滴定终点，记录消耗氢氧化钠标准溶液的体积。
1.6.3 计算脂肪酶制剂的酶活力按以下公式计算：式中：X1——样品的酶活力，u/g；V1——滴定样品时消耗氢氧化钠标准溶液的体积，单位为毫升〔mL〕；V2——滴定空白时消耗氢氧化钠标准溶液的体积，单位为毫升〔mL〕；c——氢氧化钠标准溶液，单位为摩尔每升〔mol/L〕50——0.05mol/L氢氧化钠溶液1.00mL相当于脂肪酸50μmol；n1——样品的稀释倍数；0.05——氢氧化钠标准溶液浓度换算系数；15——反响时间15min，以1min计算。
脂肪酶酶活测定方法
附录A(规范性附录)脂肪酶酶活测定方法A.1 原理碱性脂肪酶可将甘油酯（油、脂）水解，在不同阶段可释放出脂肪酸、甘油二酯、甘油单酯及甘油。
水解生成的脂肪酸，可以用标准的碱溶液滴定，以滴定值表示酶活力。
反应式为：RCOOH+NaOH RCOONa+H2OA.2 适用范围本规定仅适用于脂肪酶对油脂水解活性测定方法。
A.3 用语定义A.3.1 酶活在一定条件下（温度36℃和pH9.4），水解甘油三酯每分钟生成1μmol脂肪酸的酶量，即为一个国际单位，以u/ml或者u/g表示。
A.3.2 基质被酶水解的物质，又称为底物。
A.4 试剂A.4.1 0.05 mol/LGly-NaOH缓冲液（pH9.4）A液：0.2 mol/L NaOH，称取NaOH（A.R）8.0 g，用蒸馏水定容至1000 ml；B液：0.2 mol/L Gly，称取甘氨酸15.014 g，用蒸馏水定容1000 ml；使用前取A液16.8 ml + B液50 ml，加部分蒸馏水稀释，再用酸度计调节pH至9.4，定容到200 ml。
A.4.2 橄榄油分析纯。
A.4.3 4%聚乙烯醇（PVA）溶液称取聚乙烯醇40 g（聚合度1750+50），加1000 ml 0.05 mol/L pH 9.4Gly - NaOH 缓冲液，沸水浴完全溶解后，冷却，必要时过滤，溶解过程中蒸发的水分要用蒸馏水补充，定容至1000 ml。
A.4.4 乙醇含量在95 %以上，为分析纯。
A.4.5 0.01 mol/L NaOH称取0.40 g A.R的NaOH，溶于新制备的冷却蒸馏水中并定容至1000 ml，置冰箱。
取分析纯邻苯二甲酸氢钾（A.R）少量于称量瓶中，105℃烘干至恒重（约2小时），然后称取4份，每份各0.600 g，分别放入4个100ml容量瓶中，加蒸馏水定容至刻线，溶解后，分别取10ml至4个250ml的三角瓶中，各取加入40 ml蒸馏水，摇允后，加三滴1 ％酚酞，用待标定的NaOH溶液滴定至微红，即为终点。
脂肪酶活力测定方法及其比较
脂肪酶活力测定方法及其比较一、本文概述脂肪酶是一类能够催化脂肪酸酯水解的酶类，广泛存在于动物、植物和微生物中，其在生物体内起着重要的代谢作用。
脂肪酶活力测定方法的研究对于了解脂肪酶的催化性质、生物合成、调控机制以及在工业、医药和农业等领域的应用具有重要意义。
本文旨在介绍常见的脂肪酶活力测定方法，包括滴定法、比色法、荧光法、高效液相色谱法等，并比较它们的优缺点，以期为读者提供一个全面、系统的脂肪酶活力测定方法参考。
通过本文的阐述，读者可以了解各种测定方法的基本原理、操作步骤、适用范围以及注意事项，从而根据自身研究需求选择最合适的测定方法。
本文还将探讨脂肪酶活力测定方法的未来发展趋势，以期为相关领域的研究提供有益的参考和启示。
二、脂肪酶活力测定的基本原理脂肪酶活力测定主要基于脂肪酶水解脂肪酸的特性，通过测量水解产物的生成速率来评估酶的活性。
脂肪酶是一种能够催化脂肪酸酯水解的酶，其催化反应可以表述为：脂肪酶 + 脂肪酸酯→脂肪酸 + 醇。
在测定脂肪酶活力时，通常使用特定的底物，如三乙酸甘油酯（p-nitrophenyl butyrate）或橄榄油等，这些底物在脂肪酶的作用下会水解生成相应的脂肪酸和醇。
在测定过程中，通常使用比色法、滴定法或高效液相色谱法等方法来检测水解产物的生成量。
例如，当使用p-nitrophenyl butyrate 作为底物时，水解产生的p-nitrophenol在碱性条件下会呈现黄色，其颜色深浅与浓度成正比，因此可以通过比色法来测定其浓度，从而推算出脂肪酶的活力。
不同的测定方法具有各自的优缺点，比如比色法操作简便，但可能受到颜色干扰和pH值变化的影响；滴定法则需要精确的化学计量和反应条件控制；高效液相色谱法则具有更高的灵敏度和准确性，但设备成本较高，操作相对复杂。
因此，在选择脂肪酶活力测定方法时，需要根据实验条件和目的来综合考虑各种因素。
脂肪酶活力测定的结果还受到多种因素的影响，如酶浓度、底物浓度、反应温度、pH值等。
脂肪酶活检测原理及方法
脂肪酶活检测原理与实际方法：一、原理以与标准曲线做法1.对硝基苯酚酯〔4-Nitrophenyl ester〕是脂肪酶水解活力测定中运用最为广泛的一种底物,脂肪酶水解其产生pNP〔对硝基苯酚〕在碱性条件下显黄色,在410nm下有吸光值,且灵敏度很高.2.所需试剂有：CAS 碳链长度出货号价格名称830-03-5 C2 N8130-1G ￥462 对硝基苯乙酸酯2635-54-9 C4 N9876-1G ￥570 对硝基苯丁酸酯1956-10-1 C8 21742-1G-F ￥487 对硝基苯辛酸酯1956-11-2 C12 61716-1G ￥435 对硝基苯月桂酸酯1492-30-4 C16 N2752-1G ￥379 对硝基苯棕榈酸酯14617-86-8 C18 N3627-1G ￥2621.97 对硝基苯硬酸脂全部为色谱纯试剂,购于sigma公司3.标准曲线绘制：a.标准对硝基苯酚母液<2mM,2mmol / L>:称取0.02789g的对硝基苯酚<p-NP>溶于100ml的溶液B〔即不同pH的缓冲液〕,置于棕色试剂瓶内,4℃冰箱保存.方法一：b.标准曲线绘制：分别取0.02,0.04,0.06,0.08,0.12,0.16ml的对硝基苯酚母液<2mM>,用溶液B〔即不同pH的缓冲液〕稀释至4ml,分别测定在410nm处的吸收值.以对硝基苯酚浓度x〔对应浓度分别是0.01,0.02,0.03,0.04,0.06,0.08,单位：mM〕为横坐标,吸光值y为纵坐标,绘制标准曲线.方法二：全部对硝基苯酚经过与测酶活相同的处理,获得吸光度.b.标准曲线的绘制：分别取0、1.875、3.75、7.5、15、22.5、30、45μL的对硝基苯酚分别加入62.5、60.625、58.75、55、47.5、40、32.5、17.5μL的异丙醇和〔全部都是〕562.5的溶液B,40℃15min,95%乙醇,10000r / min,3min,测出标准曲线.上表是方法一测得标准曲线脂肪酶酶活定义：在410nm下测定吸光值,以 1 min内催化水解底物对硝基苯棕榈酸酯<p-NPP>产生1μmol对硝基苯酸<p-NP>所需的酶量为1个酶活单位<U>.公式y=14.474x+0.0272中x是p-NP的浓度<单位：mmol/l>,y是吸光值,14.474、0.0272是反应系数,R2是相关系数.则,酶活计算公式为：酶活=1000*n*V*<y-0.0272> / 14.474t 其中n为稀释倍数,t为反应时间〔单位：min〕,V为反应体系的总体积〔单位：L〕、1000是mmol到μmol的比例.二、底物耐碱性测定与试验液配制1.底物耐碱性测定a.6种底物分别加至pH7,pH8的37℃的PBS缓冲液中〔选择37℃培养箱〕,每隔5min检测一次颜色变化,拍照；b.6种底物分别加至pH8,pH9的Tris-HCl缓冲液中〔37℃〕,每隔5min检测一次颜色变化,拍照；c.分别加至pH9,pH10的Gly-NaOH缓冲液.2.测酶活所需要试剂的配制,酶活测定方法方法一：〔96孔板法,粗略,速度快〕a.溶液的配制溶液A：溶液A:30.0mg对硝基苯棕桐酸脂<p-NPP,Sigma,或者其他底物,337.52g/mol,即8.89*10-5mol>溶于10.00ml异丙醇〔浓度为8.89*10-3M,或8.89mM〕,4℃棕色瓶〔可以使用包锡箔纸的15ml离心管〕保存,每10ml可用于单个酶500次测定；溶液B:缓冲液<pH缓冲液,可更改>100.0ml加入1滴TritonX-100,混匀,4℃保存.96孔板〔220μL〕：A液〔底物液〕：18μL↗体系液180〔μL〕+ 酶液〔40μL〕↘B液〔pH缓冲液〕：162μL此步骤中,底物再次被稀释,浓度为0.889mM.方法二：〔吸光度法,精准,速度慢〕a.溶液的配制溶液A:30.0mg对硝基苯棕桐酸脂<p-NPP,Sigma,或者其他底物>溶于10.00ml异丙醇,4℃棕色瓶〔可以使用包锡箔纸的15ml离心管〕保存,每10ml可用于单个酶8-10次测定,或用于8-10个酶一次测定,或用于一个酶4次密精测定；溶液B:缓冲液<pH缓冲液,可更改>100.0ml加入1滴TritonX-100,混匀,4℃保存.b.脂肪酶的活力测定〔以单个酶液做一个/ 两个对照为例〕①准备试管30个,10个15ml离心管；②取1ml / 1.2ml溶液A加入到9ml / 10.8ml溶液B于离心管中,充分混匀,37℃水浴保温5min,分装至3 / 4个试管中,每个2.7ml,即体系液；③向每个试管中加入适量酶液〔粗酶液加300μL〕,对照组中加入灭活酶液<沸水煮沸5min>,加入酶液后即为反应液；④37℃反应10-15min,加入95%乙醇终止反应,在410nm下测定吸光值,每个样品重复2 / 3次,取平均值.三、96孔板装样方式：步骤一：温度不变,定为40℃,以pH和底物为变量,先在EP管内反应,后加入至96孔板中.其中每个孔是220μL体系.pH缓冲液分别采取PBS缓冲液〔7、8〕、Tris-HCl缓冲液〔8、9〕.a.该方法需要的总酶液量〔每个酶的单次实验〕：40*80=3.2ml,其中需要灭活的是800μL.以方便计算以与加样,取4ml酶液,1ml用来灭活.b.该方法需要的单个底物的总量是〔每个酶的单次试验〕：18*16=288μL,以方便计算和加样,取300μL.c.以三个酶为例仅做pH和底物交叉实验为例,需要每个酶液4ml,每个底物900μL.表为96孔加样模式：C2等代表底物,后面的数字代表pH,红色字体表示一个空白对照和三个平行.蓝色字体中,pH8分别用了PBS缓冲液和Tris-HCl缓冲液,以便比较不同缓冲液对酶活的影响.步骤二：pH不变,以温度和底物为变量,先在EP管内反应,后加至96孔板中.其中每个孔是220μL体系.a.该方法需要的总酶液量〔每个酶的单次实验〕：40*60=2.4ml,其中需要灭活的是600μL.以方便计算以与加样,取3ml酶液,750ml用来灭活.b.该方法需要的单个底物的总量是〔每个酶的单次试验〕：18*12=216μL,以方便计算和加样,取250μL.c.以三个酶为例仅做pH和底物交叉实验为例,需要每个酶液3ml,每个底物750μL.表为96孔加样模式其中C2等代表底物,后面的数字代表温度,红色字体表示一个空白对照和三个平行.40℃因已经在上个步骤中做过,不再重复.。
脂肪酶生产菌的筛选及酶活性测定
脂肪酶生产菌的筛选及酶活性测定脂肪酶是类脂化合物分解合成和酯交换的催化剂在有机相中脂肪酶可以完成酯化交换及转酯等反应具有区域选择性立体选择性较高的稳定性尤其是它的立体选择催化特性可以完成用化学法难以进行的消旋化合物的拆分不对称合成等使这一古老的酶在有机合成精细化工药物中间体合成以及生物能源等诸多领域有着崭新而广阔的发展前景。
脂肪酶在微生物界的分布很广几乎所有的微生物都能产生脂肪酶芽孢杆菌脂肪酶是细菌中产生的脂肪酶的之一具有能耐受较高的温度较宽的pH 作用范围和对有机溶剂良好的耐受性等特点非常适用于非水相的催化鉴于目前对芽孢杆菌脂肪酶研究较少以及潜在的应用价值和巨大的需求潜力寻找新酶种和脂肪酶的扩大应用研究具有十分现实的意义从油污土壤中分离到一株产脂肪酶菌株经初步鉴定属于芽孢杆菌为后续产脂肪酶菌株的菌种改良以及脂肪酶基因工程菌的构建等工作奠定了基础1 材料与方法1.1材料1.1.1 土样采集土壤采集于承德石油高等专科学校石化楼附近的土样及学校汇龙餐厅；共9 份样品1.1.2 主要试剂橄榄油，聚乙烯醇，Rhodamine B （玫瑰红B,或碱性玫瑰精，俗称花粉红），酵母提取物YE，维多利亚兰，1mol/lNaoH 6mol/L Na2CO3 1mol/L HCl 等分析试剂1.1.3 培养基⑴富集培养基组成（%）NH4 2SO4 0.1，NH4NO3 0.1 ，NaCl 0.1 ，MgSO4 7H2O 0.05 ，K2HPO40.1，用6mol/L Na2CO3 调pH 为7.0 再加入1%橄榄油，蒸馏水100ml ，121摄氏度蒸汽灭菌20min ⑵平板初筛培养基组成（%）NH4 2SO4 0.1，NH4NO3 0.1，NaCl 0.1，MgSO4 7H2O 0.05 ，K2HPO4 0.1，琼脂 1.2~1.8 ，用6mol/L Na2CO3 调pH 为7.0 灭菌后再加入橄榄油聚乙烯醇乳化液10ml/100ml ⑶Rhodamine B 显色培养基在配制好的初筛培养基中加入10ml 0.1mg/ml Rhodamine B 作为指示剂⑷维多利亚兰显色培养基在配制好的初筛培养基中每100ml 中加入0.1g 维多利亚兰充分振荡使其溶解⑸复筛培养基组成（%）蛋白胨2.35，蔗糖1，K2HPO4 0.1 ，MgSO4 7H2O 0.05 ，用6mol/L Na2CO3 调pH 为6.5 115摄氏度蒸汽灭菌30min；⑹橄榄油聚乙烯醇乳化液，取1.8g聚乙烯醇溶于90ml蒸馏水中，用1mol/lNaoH调至Ph9.0再加入30ml橄榄油离心10000r/min 5分钟；⑺LB培养基胰蛋白胨1g，酵母提取物0.5g，NaCl1g用5mol/lNaoH调Ph7.0高压蒸汽灭菌21min1.2方法1.2.1 筛选方法⑴富集培养采集的土样称5g 溶于10ml 无菌水中充分摇匀静置取1ml 上层液体加入到装有20ml 富集培养基的三角瓶中在摇床上30摄氏度180r/min，振荡培养2d，富集3 次；⑵初筛培养取1ml 富集菌液加入到9ml 无菌水中进行倍比稀释稀释到10 7取10 210 610 73 个梯度菌液各200 l 分别涂布在Rhodamine B 显色培养基和维多利亚兰显色培养基中30摄氏度培养2~3d；⑶复筛培养将初筛培养后的菌株在紫外灯波长为365nm 下观察将变色圈较大的菌落划线分离纯化随后接种到复筛培养基中在摇床上30 摄氏度175r/min 振荡培养2d1. 2. 2 温度对脂肪酶活性的影响摇瓶发酵液离心取上清，分成5 份，加橄榄油乳化液分别于20℃、30℃、40℃、50℃、60℃反应，并测定相应的酶活力。
乳品中脂肪酶的测定方法
乳品中脂肪酶的测定方法
脂肪酶是一种重要的酶类，在乳品加工中具有关键的作用。
测定乳品中脂肪酶
的含量是保证乳品质量的重要环节之一。
以下是几种常见的脂肪酶测定方法：
1. 滴定法：滴定法是一种简便而常用的测定脂肪酶活性的方法。
该方法通过将
乳样溶液与含有标准化脂肪酶的试剂混合，在一定的反应条件下，用酸碱滴定的方法测定反应溶液中未被分解的脂肪酶的剩余量。
滴定法的优点是操作简便，结果可靠，但缺点是该方法只能测定总脂肪酶活性，无法区分特定种类的脂肪酶。
2. 电化学法：电化学法是一种使用电化学传感器来测定脂肪酶活性的方法。
该
方法通过将乳样溶液与含有底物的电化学传感器接触，利用脂肪酶的催化作用产生的电流变化来测定脂肪酶的活性。
电化学法具有灵敏度高、结果稳定等优点，但需要专业的设备和操作人员，所以适用范围有一定限制。
3. 酶联免疫吸附法（ELISA）：酶联免疫吸附法是一种利用特异性抗体与脂肪
酶结合并通过酶的底物催化生成的产物来测定脂肪酶的含量的方法。
该方法通过将待测样品与含有特异性抗体的酶标记试剂反应，然后用酶底物进行显色反应，最后根据显色产物的浓度来测定脂肪酶的含量。
酶联免疫吸附法具有高灵敏度、高特异性和较宽的适用范围等优点，但需要耗时和复杂的实验操作。
综上所述，选择适当的乳品中脂肪酶测定方法需要根据实际需求和实验条件来
决定。
不同的方法具有各自的优缺点，在实际应用中需综合考虑实验操作的方便性、测定结果的准确性以及设备和人员的可用性等因素。
只有选择合适的测定方法并严格执行相关操作步骤，才能保证乳品中脂肪酶含量的精确测定，从而保障乳品的质量和安全。
脂肪酶活检测原理及方法
脂肪酶活检测原理及实际方法：一、原理以及标准曲线做法1.对硝基苯酚酯（4-Nitrophenyl ester）是脂肪酶水解活力测定中运用最为广泛的一种底物，脂肪酶水解其产生pNP（对硝基苯酚）在碱性条件下显黄色，在410nm下有吸光值，且灵敏度很高。
2.所需试剂有：CAS 碳链长度出货号价格名称830-03-5C2N8130-1G ￥462对硝基苯乙酸酯2635-54-9 C4 N9876-1G￥570 对硝基苯丁酸酯1956-10-1 C821742-1G-F ￥487 对硝基苯辛酸酯1956-11-2 C12 61716-1G ￥435 对硝基苯月桂酸酯1492-30-4 C16 N2752-1G ￥379 对硝基苯棕榈酸酯14617-86-8C18 N3627-1G￥对硝基苯硬酸脂全部为色谱纯试剂，购于sigma公司3.标准曲线绘制：a.标准对硝基苯酚母液(2mM，2mmol / L):称取的对硝基苯酚(p-NP)溶于100ml的溶液B（即不同pH的缓冲液），置于棕色试剂瓶内，4℃冰箱保存。
方法一：b.标准曲线绘制：分别取，，，，，的对硝基苯酚母液(2mM)，用溶液B（即不同pH的缓冲液）稀释至4ml，分别测定在410nm处的吸收值。
以对硝基苯酚浓度x（对应浓度分别是，，，，，，单位：mM）为横坐标，吸光值y为纵坐标，绘制标准曲线。
方法二：全部对硝基苯酚经过与测酶活相同的处理，获得吸光度。
b.标准曲线的绘制：分别取0、、、、15、、30、45μL的对硝基苯酚分别加入、、、55、、40、、μL的异丙醇和（全部都是）的溶液B，40℃15min，95%乙醇，10000r / min，3min，测出标准曲线。
上表是方法一测得标准曲线脂肪酶酶活定义：在410nm下测定吸光值,以1 min内催化水解底物对硝基苯棕榈酸酯(p-NPP)产生1μmol对硝基苯酸(p-NP)所需的酶量为1个酶活单位(U)。
公式y=+中x是p-NP的浓度(单位：mmol/l)，y是吸光值，、是反应系数，R2是相关系数。
脂肪酶活性条件试验设计
脂肪酶活性条件试验设计脂肪酶的最适温度测定试验一、目的：测量脂肪酶的最适反应温度二、原理：脂肪酶能分解脂肪产生脂肪酸，使得反应液ph下降，用0.01mol/LNaOH溶液中和所产生的脂肪酸，所消耗的0.01mol/LNaOH溶液体积与酶的活性成正相关性。
不同温度下，酶的活性与温度的关系可以通过0.01mol/LNaOH溶液体积间接反映出来。
三、方法：为保证测量结果的准确，脂肪酶的最适反应温度试验在国标里脂肪酶的活性测定的检验方法基础上改动震荡水浴温度，其余尽量保持不变。
四、检测步骤：酶活的测定（NaOH滴定法）固体：精密称取固状酶粉0.500g，放入小烧杯中，用约50ml缓冲液溶解，磁力搅拌15-20分钟，转移至100ml容量瓶中，用缓冲液都次冲洗烧杯，同时转移到容量瓶中，（注意不要起泡），定容至刻度，振摇1分钟左右，静置20分钟以上，取上清液再次进行下一步稀释，稀释倍数：以样品与对照消耗碱量之差在4.5-5.5ml范围内。
液体：准确吸取1ml样品于100ml容量瓶中，用缓冲液定溶到刻度，摇匀，进行下一步稀释，稀释倍数：以样品与对照品之差在4.5-5.5ml范围内。
再次稀释不得超过两次。
测定：取100ml三角瓶3只，其中2只是试样，1只是空白对照，每杯中的组成液为：4.0ml 缓冲液（pH9.4），5.0ml橄榄油乳化液，1.0ml酶液。
以上除酶液以外的组成液置于20摄氏度水浴锅预热5分钟，然后精确加入1ml酶液，精确计时，缓慢震荡（80次每分钟），保温10分钟，立即加入95%酒精20ml，取出，加入10ml30%氯化钠溶液，摇匀，使之破乳约1分钟，并同时做空白对照，对照同样品一样，先预热5分钟，保温10分钟，立即加入20ml95%酒精（1ml酶液先加入该20ml95%酒精灭活）。
用0.01mol/NaOH滴定样品至空白溶液的pH。
反应后的样品应在半小时内完成滴定。
通过计算算出酶的活性，记录结果。