菌种传代.

1. 目的
建立菌种的传代、保藏及菌液制备的操作规程。

2. 范围
适用于质检中心菌种的传代、保藏及菌液制备。

3. 责任人
实验室检定菌保管员、检验中心主任。

4. 内容
4.1 标准菌种的概念及其管理
4.1.1标准菌种是指由国家授权机构制备的具有稳定的生物学特性并用妥善方法保藏的菌种。

我国的标准菌种统一由中国菌种保藏管理委员会（CCCCM）管理，涉及药品微生物检验的菌种由医学微生物菌种保藏管理中心（CMCC）提供。

4.2 菌种代号的意义
4.2.1国内药品微生物检验所用的菌种代号是：CMCC（F）或 CMCC（B）
CMCC ——中国医学菌种保藏中心；B ——代表细菌， F ——代表真菌。

4.2.2 菌种的名称
▪铜绿假单胞菌［ＣＭＣＣ（Ｂ）１０１０４］
▪生孢梭菌［ＣＭＣＣ（Ｂ）６４９４１］
▪大肠埃希菌［ＣＭＣＣ（Ｂ）４４１０２］
▪金黄色葡萄球菌［ＣＭＣＣ（Ｂ）２６００３］
▪枯草芽孢杆菌［ＣＭＣＣ（Ｂ）６３５０１］
▪白色念珠菌［ＣＭＣＣ（Ｆ）９８００１］
▪黑曲霉［ＣＭＣＣ（Ｆ）９８００３］
4.3 标准菌种的保藏形式
我国提供的标准菌种通常是以冻干粉的形式包装于熔封的厚玻璃容器中。

在这种容器中，微生物通常与赋形剂共存，由于缺乏生长必须的环境条件，一般呈休眠状态。

4.4 培养基的选择
细菌一般用营养琼脂培养基，特别指出的是生孢梭菌用硫乙醇酸盐流体培养基加琼脂制成的培养基进行传代，真菌一般用改良马丁培养基。

4.5 菌种的传代
4.5.1 菌种的复苏
4.5.1.1把冻干菌种管、灭菌1ml 滴管、双碟、镊子、营养肉汤培养基、营养琼脂斜面数支，移入接种室或净化工作台。

4.5.1.2先用砂轮将冻干菌种安瓶颈部挫出刻痕,再将冻干菌种管外壁用碘酒擦洗消毒、稍干，用75% 乙醇棉擦净，放在灭菌双碟内，待干。

点燃酒精灯，将菌种管的封口一端在火焰上，烧灼红热，用灭菌滴管吸取营养肉汤培养基，滴在灼热的菌种管封口一端，使骤冷而炸裂。

4.5.1.3取灭菌镊子，在火焰旁，将炸裂的管口打开，放入灭菌双碟内，另取1支灭菌滴管，在火焰旁吸取营养肉汤少许，加至菌种管底部，将冻干菌搅动促使溶解，随即吸出管内菌液，分别接种至营养琼脂斜面及普通肉汤内，并将滴管及菌种管投入消毒液内，将已接种的营养肉汤及营养琼脂斜面置35~37℃培养22~24 h。

4.5.1.4取出培养物，仔细观察菌苔形态、有无杂菌、涂片、革兰氏染色镜检，呈典型菌落后，转种3 代即可应用。

如发现菌型不典型，可进行平板分离单菌落。

4.5.1.5《中国药典》2010版规定，所用标准菌种的传代次数不得超过5代。

从菌种保藏中心获得的冷冻干燥的菌种为第0代，冷冻干燥的原始菌种开启后转种后为第1代，直至到第3代为工作菌种。

4.5.1.6严格控制菌种的传代
避免频繁购买菌种及复壮等费时、耗力的工作。

4.5.1.6.1.复溶菌种并转种按菌种说明书要求复溶所转菌种并转接于适当的增菌培养基内（为第一代）
4.5.1.6.2. 鉴定菌种后制甘油冷冻管经菌种特性鉴定后，挑取纯菌落制成浓菌悬液用于制备甘油冷冻管，保存管（为第二代）同时挑取纯菌落接斜面，工作用菌种（为第三代）
4.5.1.6.3. 将第二代保存，第三代以适当温度培养后用于试验
4.5.1.6.4 取1支（第二代）冷冻保存管转种于平板和斜面培养基上，平板上的菌种制成冷冻保存管（第三代）斜面养基适当温度培养后作为工作用菌种（第三代）
4.5.1.6.5.将（第三代）菌种冷冻或低温保存，将生长、转种后的第二代菌种灭菌处理。

4.5.1.6.6.当工作用用菌种代数小于5时，可直接用上代工作用菌种转接下代工作用菌（第三代）可直接转接第四代，直至四代转为五代。

4.5.1.7菌种保藏标签的规范与要求
菌种保藏标签必须规范、清晰，所有保藏的菌种容器表面均应贴有相应的标签，
标签必须字迹清晰可见，应注明：菌种的名称，系列号，传代次数，接种时间等。

一旦新一代菌种制备成功，上一代菌种务必处理掉处理过程应记录。

4.5.1.8严格菌种的质量控制，确保菌种的质量
菌种的质量对检验至关重要，对实验式储备的菌种而言，除了在起始阶段要对菌种进行纯度和属性确认外，还应对每一次传代都进行确认的质量控制系统。

因为微生物菌种从上一代传到下一代时，很可能发生污染或变异，因此每次传代中至少要对菌种进行形态学观察和革蓝染色检查，必要时应做菌种鉴定试验，所有被确认受到污染的菌种应及时销毁，不得用于常规实验。

4.5.1.9菌种处理的注意事项与有关记录
▪菌种是特殊的标准品，在一定条件下，许多种类都是病原菌，这就要求处理菌种时有一些有别于其他标准品的特殊要求。

▪1.根据菌株对人和动物的致病力、毒性流行传染的危害程度，要实行严密安全的保藏管理。

▪2.所有的与菌种有关联的事情，例如菌种的接收、检查和保藏等都应有专门的微生物分析员处理和控制，建立进出账目，填写菌种纪录，纪录内容包括：菌种名称、编号、来源、形态特征、培养特性、生化检定、传代次数、最适培养基和培养条件、保藏方法、储存条件及保存库址等。

▪3.在操作过程中，必须严格遵守实验室安全防护措施规程，采取有效预防措施进行自我保护。

▪4.为了防止菌种污染或将污染传播到别处，其他部门的人员未经允许不得进微生物实验室。

所有的意外情况，都必须立即向主管部门报告以便得到及时解决。

▪5相关记录在菌种的使用制备与保藏过程中，应建立菌种制备、保藏和使用的记录格式。

4.5.2 菌种的确认
4.5.2.1铜绿假单胞菌
▪形态特征：G-杆菌、直或微弯、较细长、散在排列、无芽胞、有荚膜、单端有1～3根鞭毛。

▪培养特性：专性需氧，最适温度为35℃，但在42 ℃生长是铜绿假单胞菌的一个特点。

营养无特殊要求，普通培养基上均能生长，菌落大小不一，扁平湿润，边缘不齐，可产生各种水溶性色素，故使培养基变为蓝绿色。

在营养肉汤培养基中呈均匀混浊生长，常在其表面形成菌膜。

▪分离培养：十六烷三甲基溴化铵培养基
▪生化反应：氧化酶试验（＋）（培养物呈粉红色渐变为紫红色）
绿脓菌素试验（＋）（盐酸溶液呈粉红色）
4.5.2.2 生孢梭菌
▪形态特征：G+粗大芽胞杆菌、但在陈旧培养物中菌体革兰染色为阴性，芽胞正圆形或卵圆形，直径大于菌体，位于军体中央或近端，有周身鞭毛，能运动。

▪培养特性：专性厌氧，但要求不严格。

一般培养时不易形成芽孢，在普通营养琼脂培养基形成不规则菌落。

在硫乙醇酸盐流体培养基加琼脂制成的培养基上形成圆形、光滑、湿润、不透明的菌落。

在硫乙醇酸盐流体培养基中常在其表面形成菌膜。

4.5.2.3 大肠埃希菌
▪形态特征：G-直短杆状杆菌、无芽胞、有周身鞭毛，能运动。

有菌毛。

▪培养特性：兼性厌氧，营养要求不高，普通营养琼脂培养基上生长良好，形成较大的圆形、光滑、湿润、灰白色的菌落。

在营养肉汤培养基中呈均匀混浊生长。

▪分离培养：伊红美兰培养基（EMB平板）
▪生化反应：IMViC试验结果：＋＋－－
MUG 试验结果：荧光：＋
4.5.2.4 金黄色葡萄球菌
▪形态特征：G+球菌、呈单个、成双、短链或排列呈葡萄串样，无鞭毛、芽胞。

▪培养特性：兼性厌氧，营养要求不高，在普通营养琼脂培养基上形成较大的圆形、光滑、湿润、隆起、边缘整齐、不透明的菌落。

菌落因种不同而出现不同的色素。

在营养肉汤培养基中呈均匀混浊生长。

▪分离培养：高盐甘露醇培养基
▪生化反应：血浆凝固酶试验结果：＋
4.5.2.5 枯草芽孢杆菌
▪形态特征：G+直杆菌、多呈链状排列，有鞭毛、有芽胞，位于菌体中心或次极端，不小于菌体。

▪培养特性：为需氧或兼性厌氧，营养要求不高，在普通营养琼脂培养基上形成较大的圆形或不规则的、表面粗糙、可有皱褶、菌落下面可形成红色色素的灰白色菌落。

在营养肉汤培养基中形成菌膜,很少混浊或不混浊。

▪分离培养：营养琼脂平板
血琼脂平板
4.5.2.6 白色念珠菌
▪形态特征：G+、圆形或卵圆形、着色不均匀、在玉米培养基中可产生假菌丝和厚膜孢子。

▪培养特性：在玫瑰红钠琼脂培养基上形成灰白色、表面光滑、带有浓重酵母气味的典型的类酵母菌落。

培养稍久，菌落增大。

在改良马丁培养基中呈沉淀生长。

▪分离培养：快速显色培养基
4.5.2.7 黑曲霉
▪形态特征：单层和双层瓶梗、孢子头球形放射状、褐至黑色、孢子梗无色至褐色。

▪培养特性：在玫瑰红钠琼脂培养基上形成菌落初为白色羊毛状，继而黑色或黑褐色，粗绒状。

▪分离培养：快速显色培养基
4.5.3菌种传代的工作环境、工具及其他器皿
▪环境
1、洁净工作室：环境洁净度10000级下的局部100级的单向流空气区域内，全过程必须无菌操作，防止微生物污染。

2、无菌隔离舱
▪工具
1、接种环；
2、接种针；
3、接种铲；
4、接种钩；
5、酒精灯及其他玻璃器械
▪培养所用器具
1、玻璃器皿：如各种规格培养皿。

2、微生物实验室常用的设备，如高压灭菌锅、恒温培养箱等
4.5.4 菌种的接种操作步骤
一、斜面接种法：菌斜面→菌斜面（保存）
1. 培养基应新鲜制备，如斜面已无冷凝水者，不宜再使用。

从冷藏箱中取出菌种斜面后，应在室温放置约30分钟。

2. 将装有新鲜配制的培养基菌种保藏管管壁上注明菌名及接种日期，和传代菌种一并移入接种室或超净工作台。

打开紫外灯照射一小时。

3.关闭紫外灯。

点燃酒精灯，左手握住菌种斜面，将管口靠近火焰上方，右手拿接种棒后端，将接种环烧红约30秒，随后将接种棒金属部分在火焰上烧灼，往返通过三次。

4.右手用无名指、小指及掌部夹住管塞，左手将管口在火焰上旋转烧灼，右手再轻轻拔开管塞，将接种环伸入管内先在近壁的琼脂斜面上靠一下，稍冷后再至菌苔上，刮取少量菌苔，随即取出接种棒并将菌种管口移至火焰上方。

5.塞上管塞，左手将菌种管放下，取营养琼脂斜面（或改良马丁琼脂斜面）一支，照上
述操作打开管塞，将接种环伸入管内至琼脂斜面的底部向上划一条直线，然后从底部向上作连续曲线划线，一直划到斜面顶端，使细菌接种在斜面的表面上。

6.取出接种环，在火焰上方将培养基管盖上塞子，然后将接种过细菌的接种环在火焰上烧灼灭菌。

,7.将已接种好的细菌管置35～37℃细菌培养箱培养22 ～24h，霉菌管置23～28℃霉菌培养箱培养7天。

取出后放人冰箱保存，一般3个月转种一次。

二菌斜面→营养肉汤→分离平板→菌斜面
1、如果菌落形态不典型可纯化，按下列方法传代（分离菌落）：
用接种环取上述菌管（斜面）菌苔少许接种置营养肉汤中(5ml/支,已灭菌), 置35~37℃培养18~24小时后，再用接种环取培养好的营养肉汤菌悬液（浓菌液），接种于分离平板，置35~37℃培养18~24小时，用接种针选典型菌落划线于营养琼脂斜面，置35~37℃培养18~24小时。

一般同时接种几支管，其中一支用于以后菌种传代或接种到半固体琼脂培养基中，其它用做工作菌种。

三、黑曲霉接种方法：
黑曲霉孢子悬液，可以保存在4℃环境，并应在一个月内尽快完成转种操作。

转种操作应在超净工作台（或相当此环境）中进行，关闭风机，靠近酒精灯，拧开瓶盖，用无菌吸管吹吸管内液体，取1～2滴滴在改良马丁琼脂斜面，用吸管涂布均匀，置23～28℃培养5～7日。

斜面正面为黑褐色厚绒状，色泽均一，不应有杂色；斜面侧面无色，接近菌层培养基略带黄色。

转种完毕的冻存管和使用过的器具应经121℃湿热灭菌30分钟再作处理。

4.5.5 菌种的保藏
4.5.5.1菌种保藏的重要意义就在于尽可能保持其原有性状和活力的稳定，确保菌种不死亡、不变异、不被污染，以达到便于研究。

4.5.5.2首先应该挑选典型菌种的优良纯种来进行保藏，最好保藏它们的休眠体，如分生孢子、芽孢等；其次应人为地创造环境条件（如：干燥、低温和缺氧），使微生物长期处于代谢不活泼、生长繁殖受抑制的休眠状态。

4.5.5.3 菌种保藏方法
4.5.5.3.1 各种微生物由于遗传特性不同，因此适合采用的保藏方法也不一样。

一种良好的有效保藏方法，首先应能保持原菌种的优良性状长期不变，同时还须考虑方法的通用性、操作的简便性和设备的普及性。

4.5.5.3.2 斜面低温保藏法－常用保藏法
4.5.5.3.2.1将菌种接种在适宜的斜面培养基上，待菌种生长完全后，置于4℃左右的冰箱中保藏，每隔一定时间（保藏期）再转接至新的斜面培养基上，生长后继续保藏，如此连续。

4.5.5.3.2.2此法适用于细菌、霉菌、酵母菌及放线菌保藏短期保藏，主要保藏措施是低温。

一般可保存1～6个月左右。

优点：简便易行、容易推广，适用于大多数微生物
缺点：菌株仍有一定程度的代谢活动能力，保藏期短；传代次数多；菌种容易发生变异和被污染。

4.5.5.3.2.3注意事项：
1、保藏的菌种应是生命活力旺盛的新鲜培养物，至少应是第三代的培养物。

2、保藏时，破伤风杆菌可用庖肉培养基；生孢梭菌用流体硫乙醇酸盐培养基。

3、必须定期检查保藏菌种冰箱的温度、湿度以及菌种管的棉塞是否松动或生霉，如
有异常应及时处理。

4、每次移植后，应与原菌种的编号、名称逐一核对，确证培养基特征和纯度无误后
再继续保藏。

5、保藏菌种的培养基应无糖，其他菌类含糖小于2 %为宜，以免产酸过多，影响菌
种存活。

6、铜绿假单胞菌在冰箱中易发生菌体自溶而死亡，不宜用本法保存。

4.5.5.3.3 甘油冷冻管保藏法
将待保藏菌种接种在适宜的斜面培养基上，适宜温度下培养适宜时间后，用无菌接种环轻轻刮取菌苔，通过接种环与试管壁之间的轻轻摩擦使细菌充分扩散到预先装于试管中的无菌蒸馏水中，调正菌液浓度，使其等同于麦氏比浊管第10号管，向已制备好的菌悬液中加入等体积、浓度为20%的无菌甘油，得到10%甘油菌悬液。

轻轻振摇小管，使内容物充分混合，分装无菌小管，最好在-30℃条件下储存，一般可保存2年。

4.5.5.3.4试管熔封（密封）保藏法
4.5.5.3.4.1熔封用各种琼脂斜面（普通肉汤等）常规灭菌后，经接种，室温培养24～48h后，将接种菌生长旺盛的试管用喷灯将其管口熔封，分别置室温和冰箱下保存。

使用时，用砂轮在管口划一圈，在乙醇灯下火烟灭菌后敲开管口即可转接到另一斜面上。

室温保存期可达3年，特别是适宜一些因培养物陈旧极易死亡的铜绿假单菌。

4.5.5.3.4.2密封将需保存种菌按无菌操作要求接种至固体培养基塞紧棉塞，放在干燥器内，干燥器密封处涂上凡士林，盖紧后使之与真空泵相连接。

开动真空泵抽真空30min 至1h（真空度约为640）关闭密封口，拨出胶塞，置于室温下保存。

待用时，打开盖，取出种菌，接种至培养基上即可。

4.5.5.3.4 石蜡油封藏法
4.5.5.3.4.1 方法：将菌种接种于斜面或穿刺于0.3~ 0.5 %琼脂半固体高层培养基中，培养好备用。

取化学纯的液体石蜡装在试管中，每管10~15ml，加棉塞，瓶口包上纸，121℃高压灭菌30min，取出置37℃温箱或110~ 170 ℃烤箱中 1 ~ 2 h 或干燥器内除去液体石蜡中的水分。

4.5.5.3.4.2此法是在无菌条件下，将灭过菌并已蒸发掉水分的液体石蜡倒入培养成熟的菌种斜面（或半固体穿刺培养物）上，石蜡油层高出斜面顶端1cm，使培养物与空气隔绝，加硅胶塞并用固体石蜡封口后，垂直放在室温或4℃冰箱内保藏。

4.5.5.3.4.3 此法的主要保藏措施是低温、阻氧。

一般可保存1～2年左右。

适用范围：适用于保藏部分霉菌，酵母菌和放线菌，对细菌保藏效果较差。

4.5.5.3.4.4注意事项：
①保藏时，用新鲜培养物接种，应检查纯度和特征后，方可进行保藏。

②保藏过程中，需经常观察斜面是否干燥，如干燥，需重新移种。

③使用菌种时，先将菌种管倾斜使液体石蜡流至一边，再用接种针挑取培养物接种到新鲜斜面上培养，待长出新培养物后，再移种一次到新斜面上即可使用。

④将沾有少量液体石蜡的接种针浸于95%酒精中片刻，再烧灼灭菌，以免直接在酒精灯下烧灼时，液体石蜡四溅，引起污染。

⑤液体石蜡在菌种管中高出培养基的高度要严格控制，如太多，会影响菌种交换气体，使保藏效果不好；如太少，斜面容易干燥，将缩短保藏期。

一般以高出斜面1 ㎝为宜。

⑥制备无菌液体石蜡时，每管装量不能太多，否则分装到菌种培养基中易造成污染。

4.5.5.3.5 冷冻真空干燥保藏法
又称冷冻干燥保藏法，简称冻干法。

它通常是用保护剂制备拟保藏菌种的细胞悬液或孢子悬液于安瓿管中，再在低温下快速将含菌样冻结，并减压抽真空，使水升华将样品脱水干燥，形成完全干燥的固体菌块。

并在真空条件下立即熔封，造成无氧真空环境，最后置于低温下，使微生物处于休眠状态，而得以长期保藏。

此法适用于各大类微生物。

此法的主要保藏措施是低温、干燥、缺氧、有保护剂，保藏期一般长达5～15年，存活率高，变异率低，是目前被广泛采用的一种较理想的保藏方法。

该法操作比较烦琐，技术要求较高，且需要冻干机等设备。

4.5.5.3.6 液氮超低温保藏法
简称液氮保藏法或液氮法。

它是以甘油、二甲基亚砜等作为保护剂，在液氮超低温（－196℃）下保藏的方法。

其主要原理是菌种细胞从常温过渡到低温，并在降到低
温之前，使细胞内的自由水通过细胞膜外渗出来，以免膜内因自由水凝结成冰晶而使细胞损伤。

此法适用于各种微生物菌种的保藏。

主要保藏措施是超低温、有保护剂，保藏期一般可达到15年以上，是目前公认的最有效的菌种长期保藏技术之一。

优点是操作简便、高效，且可使用各种培养形式的微生物进行保藏。

其缺点是需购置超低温液氮设备，且液氮消耗较多，操作费用较高。

4.5.6菌种的保藏条件及时间
4.5.7 菌液的制备
4.5.7.1接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物接种至营养肉汤培养基或营养琼脂培养基中，生孢梭菌的新鲜培养物接种至硫乙醇酸盐流体培养基中置30～35℃细菌培养箱培养18 ～24h；白色念珠菌的新鲜培养物接种至改良马丁培养基中或改良马丁琼脂培养基上，置23～28℃霉菌培养箱培养24～48h。

上述培养好的营养肉汤菌悬液（浓菌液）1ml，加到9ml 0.9%无菌氯化钠溶液混匀，为10-1，再取另一只吸管吸取10-1菌液1 ml加到9ml 0.9%无菌氯化钠溶液混匀，为10-2……以此类推，稀释至含活菌数小于100 个。

用平板计数。

4.5.7.2 黑曲霉的菌液制备
将黑曲霉的孢子接种至改良马丁琼脂斜面培养基上，于23～28℃霉菌培养箱培养5～7天，使大量的孢子产生。

加入3 ～5ml的含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，用无菌玻棒或接种环轻轻将孢子洗脱，然后，用一支管口塞有无菌棉花的无菌球形毛细吸管吸出孢子菌液至无菌试管内，用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数小于100cfu的孢子悬液。

4.5.7.3菌液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用；若保存在2～8℃，可在24小时内使用。

黑曲霉孢子悬液可保存在2～8℃，在验证过的贮存期内使用。

4.5.7.4 菌种
4.5.8 细菌的分离培养技术—平板划线分离法
4.5.8.1连续划线分离法：此法用于含菌量少的菌液。

先将培养物于平板1/5处密集涂布，然后来回做曲线连续划线接种，线于线之间有一定的距离，划满平板为止。

4.5.8.2分区划线分离法：此法用于含菌量多的菌液。

先将培养物涂布于平板表面边缘第一区，约占平板1/5面积，再在二、三、…区依次连续划线。

每划完一个区，均将接种环灭菌一次。

每一区的划线均接触上一区的接种线1 ~ 2次，使菌量逐渐减小，以获得单个菌落。