抗原多肽的设计、偶联策略

合集下载

多肽抗原设计原则

抗原多肽选择及抗原多肽设计的基本原则一、抗原多肽选择的基本原则1、尽可能是在蛋白表面2、保证该段序列不形成α-helix3、N,C 端的肽段比中间的肽段更好4、避免蛋白内部重复或接近重复段的序列5、避免同源性太强的肽段6、交联可以交联在N，C 两端，选择依据就是交联在对产生抗体不太重要的一端7、序列中不能有太多的Pro,但有一两个Pro 有好处，可以使肽链结构相对稳定一些，对产生特异性抗体有益。

二、抗原多肽设计的基本原则为了使生产抗体获得最佳效果，仔细地设计抗原多肽是很有必要的，设计应满足一个基本条件：在免疫过程中，该抗原既不会产生过强的免疫反应，同时又能产生出对感兴趣的蛋白有结合能力的抗体。

尽管抗原设计是一个很复杂的课题，有诸多需要注意的细节，已超过了我们所能提供的范围，根据我们所积累的经验，有几点关键的基本设计原则可以提供给大家参考：1、确定抗体的用途（应用）新开展一个研究项目，弄清楚所感兴趣的蛋白的一些基本特性是很有必要的，特别是如果知道蛋白的结构会对选择抗体易于接触和识别的识别区域有很大的帮助。

然而，在没有这样精确的结构信息（多数是这种情况）的情况下，了解研究的用途（应用）会影响多肽设计的策略。

例如：如果研究重点是集中在蛋白的不同区域，如C 端或N 端，或在一种特定状态下的蛋白，如磷酸化等，那么按照所需序列设计的多肽和产生的相应的抗体在应用上应该没有太大的困难，然而，蛋白的构象将影响抗体与其识别区域之间的相互作用。

这种情况下可能存在的问题是如果在折叠的蛋白中，该识别区域被藏在蛋白的内部，抗体将无法接触到该区域。

（无法产生相互作用）。

2、识别区域的选择原则一般说来最理想的抗原性识别区域应具备亲水、位于蛋白表面和结构上易变形性等特点。

因为在大多数的天然（自然）环境中，亲水区域倾向于集中在蛋白表面，而疏水区域常常被包裹在蛋白内部，同样道理，抗体只能与在蛋白表面发现的识别区域免责声明：以上资料来源于网络、专业书籍、发表论文、学术期刊且不限于上述媒体，由钟鼎生物专业技术人员整理汇总，所相互作用，而当这些识别区域有足够的结构易变形性而转移到抗体可接触的位置时，将会与抗体间有很高的亲和性。

多肽偶联核素技术_概述说明以及解释

多肽偶联核素技术概述说明以及解释1. 引言1.1 概述多肽偶联核素技术（Peptide-Linked Radiopharmaceutical Technology）是一种将多肽与核素结合的技术，用于诊断和治疗癌症等疾病。

多肽作为药物载体具有良好的选择性靶向特性，能够靶向特定的受体或细胞表面分子，并通过连接核素的方式实现药物传送、图像显示或放射治疗等目的。

近年来，这一技术在医学领域取得了显著进展，并被广泛应用于临床。

1.2 文章结构本文旨在全面介绍多肽偶联核素技术的原理、应用以及其在癌症治疗中的应用。

文章主要包括五个部分：引言、多肽偶联核素技术的原理和应用、多肽偶联核素技术在癌症治疗中的应用、多肽偶联核素技术的优势和不足以及结论及展望。

在引言部分，将对多肽偶联核素技术进行概述，并说明文章结构。

1.3 目的本文旨在深入探讨多肽偶联核素技术的原理和应用，特别是在癌症治疗中的应用。

通过对多肽偶联核素技术的综述，希望能够加深对这一技术的理解，为进一步开发和改进该技术提供参考。

此外，还将重点讨论多肽偶联核素技术在放射治疗和同位素治疗中的具体应用，并探讨其优势、不足以及未来发展方向。

通过本文的阐述，期望可以推动多肽偶联核素技术在临床医学中更广泛、更有效地应用。

2. 多肽偶联核素技术的原理和应用2.1 多肽偶联核素技术简介多肽偶联核素技术是一种利用合成的多肽与放射性或磁性同位素进行特定结合的技术。

通过将靶向特定受体或组织的多肽与放射性核素或磁性荧光染料等连接起来，可以实现对癌症细胞或其他疾病相关位点的准确诊断和治疗。

2.2 多肽选择性靶向药物输运系统的发展历程多肽选择性靶向药物输运系统的发展经历了多个阶段。

最早期的方法是以复杂的抗体为基础，然而抗体自身存在较大体积和高成本的问题。

随后，研究人员开始利用更小、更具可行性的多肽作为靶向配体，通过改变配体序列来提高结合亲和力，并且采取各种化学修饰手段来增强稳定性和生物可用性。

多肽和KLH偶联（1）

多肽和KLH偶联（1）MBS/BDB/SMCC/sulfo-SMCC1、SMCC琥珀酰亚胺-4-(N-马来酰亚胺)环已烷-1-1羟酸酯分⼦⼀端的NHS酯基团与某⼀蛋⽩质分⼦的伯氨反应形成稳定的酰胺键，另⼀端(马来酰亚胺基团⼀端)可与另⼀蛋⽩质分⼦的巯基交联。

NHS活性酯与伯胺在PH7-9的环境形成酰胺键。

马来酰亚胺与巯基在PH6.5-7.5的环境下形成稳定的硫醚键。

在⽔溶液中，NHS 活性酯的⽔解是（与氨基的反应）个竞争反应。

马来酰亚胺⽐NHS稳定，但是在PH⼤于7.5时，马来酰亚胺会慢慢⽔解，失去与巯基反应的特异性。

因⽽，在使⽤SMCC时通常是在PH7.2-7.5的环境下进⾏，并且先让NHS发⽣反应。

SMCC结构⾥的环⼰烷环可以降低马来酰亚胺的⽔解速率。

这使得蛋⽩质在⽤SMCC修饰之后可以冻⼲存放⼀段时间。

很多蛋⽩质都选⽤该试剂来进⾏马来酰亚胺修饰。

⽤SMCC来制备抗体-酶或者半抗原作载体的蛋⽩质，经常采⽤两步合成法。

⾸先，含有氨基的蛋⽩质与⼏倍的偶联剂反应，反应结束后通过脱盐柱或者透析的⽅法除掉没有反应完的SMCC。

然后，再与含有巯基的蛋⽩质反应。

在实际操作中要注意的是，SMCC怕潮湿，存放时要和⼲燥剂⼀起存放。

并且使⽤中从冰箱拿出来时要先在室外放置⼀段时间平衡温度，以免⽴刻开启，空⽓中⽔分遇冷凝结，破坏SMCC 结构。

1、将20 mg SMCC（这是联接40条多肽的量）溶于2 ml DMF。

2、将0.8 ml KLH加⼊到25 ml圆底烧瓶中，补加1×PBS(pH 7.2)使蛋⽩终浓度为15mg/ml。

3、将溶解好的SMCC溶液缓慢滴加到120 mg KLH 蛋⽩体系中，室温搅拌反应1h。

4、⽤1 L 1×PBS (PH 7.4) 溶液于4℃下透析6 ⼩时，除去游离的SMCC。

5、将透析后的KLH蛋⽩倒⼊50 ml离⼼管中，通过离⼼管的刻度确定其体积，根据反应前加⼊的KLH蛋⽩的量来计算透析后蛋⽩的浓度，然后根据其浓度将2.5 mg KLH-SMCC溶液转移到5 ml离⼼管中。

蛋白抗原表位预测及抗原多肽设计

蛋白抗原表位猜测及抗原多肽设计运用在线软件BepiPred 1.0 Server（）从蛋白序列直接猜测抗原表位还有其他在线猜测网站进Antigenic Peptide Prediction 用tools把氨基酸序列粘贴进去,就可以直接得出猜测成果抗原多肽选择的基起源基础则1.尽可能是在蛋白概况2.包管该段序列不形成α-helix3.N,C端的肽段比中央的肽段更好4.防止蛋白内部反复或接近反复段的序列5.防止同源性太强的肽段6.交联可以交联在N,C两头,选择根据就是交联在对产生抗体不太主要的一端7.序列中不克不及有太多的Pro,但有一两个Pro有利益,可以使肽链构造相对稳固一些,对产生特异性抗体有益.抗原多肽设计的基起源基础则为了使临盆抗体获得最佳后果,细心地设计抗原多肽是很有须要的,设计应知足一个根本前提：在免疫进程中,该抗原既不会产生过强的免疫反响,同时又能产生出对感兴致的蛋白有联合才能的抗体.尽管抗原设计是一个很庞杂的课题,有诸多须要留意的细节,已超出了我们所能供给的规模,根据我们所积聚的经验,有几点症结的根本设计原则可以供给应大家参考：1.肯定抗体的用处（运用）新开展一个研讨项目,弄清晰所感兴致的蛋白的一些根本特征是很有须要的,特别是假如知道蛋白的构造会对选择抗体易于接触和识此外辨认区域有很大的帮忙.然而,在没有如许准确的构造信息（多半是这种情形）的情形下,懂得研讨的用处（运用）会影响多肽设计的计谋.例如：假如研讨重点是分散在蛋白的不合区域,如C端或N端,或在一种特定状况下的蛋白,如磷酸化等,那么按照所需序列设计的多肽和产生的响应的抗体在运用上应当没有太大的艰苦,然而,蛋白的构象将影响抗体与其辨认区域之间的互相感化.这种情形下可能消失的问题是假如在折叠的蛋白中,该辨认区域被藏在蛋白的内部,抗体将无法接触到该区域.（无法产生互相感化）.2.辨认区域的选择原则一般说来最幻想的抗原性辨认区域应具备亲水.位于蛋白概况和构造上易变形性等特色.因为在大多半的天然（天然）情形中,亲水区域偏向于分散在蛋白概况,而疏水区域经常被包裹在蛋白内部,同样道理,抗体只能与在蛋白概况发明的辨认区域互相感化,而当这些辨认区域有足够的构造易变形性而转移到抗体可接触的地位时,将会与抗体间有很高的亲和性.3.持续的与不持续的辨认区域持续的区域是指由持续的氨基酸序列（残基）组成的辨认区域.大多半抗体是针对持续辨认区域的,抗体能与这类区域以很高的亲和力相联合标明这段序列不在蛋白内部.不持续的辨认区域是代表有必定折叠的一段多肽序列,或是将两段分别开的多肽连在一路的抗体的辨认区域.在某些情形下,针对如许不持续辨认区域的抗体也能产生,只是用来免疫的抗原多肽必须具备与该不持续辨认区域类似的二级构造,而序列的长度须要相符相干的请求.4.根本建议为了防止辨认区域隐蔽在蛋白内部的风险,我们平日建议选择蛋白的N,C两头来产生的响应的抗体.因为在完全的蛋白中,N,C两头平日是吐露在蛋白概况的.然而,必定要留意膜蛋白的C端疏水性太强,不合适作为抗原.5.序列的长度平日我们建议抗原多肽的序列长度在8-20个氨基酸残基之间,假如太短,就有多肽太特别.所产生的抗体与天然蛋白之间的亲和力（联合才能）不敷强的风险,同样,假如序列长度超出20,将有可能引入二级构造,所产生的抗体掉去特异性的可能,并且肽链越长,平日合成难度增大,不轻易获得高纯度的产品.6.载体蛋白交联的选择基起源基础则：将载体蛋白加在远离抗体辨认区域的一端,在序列中没有Cys的情形下在N或C端加上Cys为交联的首选办法.7.经常运用剖析软件MacVecfor TM ;DNA star TM;PC-Gene TM。

多肽设计原理和方法PPT课件

.
16
案例5 同一蛋白质不同亚型的多肽设计 NFKB1
.
17
案例6 同一蛋白质不同亚型的多肽设计 CXCR3
The CXCR3 protein belongs to G protein-coupled receptor family. Several alternatively spliced transcript variants encoding distinct isoforms have been reported.The CXCR3B protein contains 416 amino acids and has a longer N terminus that differs from the original 368-amino acid CXCR3 protein, CXCR3A, in the first 52 residues. This antibody, 60065-1-Ig, is specific for CXCR3B, not binding CXCR3A.
Query 1
WDEVS----------———- VLDDQRRLTRTFEA 19
WDEVS
. VLD ++RLT TF+A Sbjc8 t
69 WDEVSLNAKDLVRKLIVLDPKKRLT- TFQA 97
案例2 家族性蛋白的多肽设计（transgelin）
The transgelin family is a group of proteins that belong to 22kd actin-related corpnin superfamily.
DPAYIKIEEVIGTGSFGEVRQGRLQPRGRREQTVAIQALWAGGAESLQMTFLGRAAV

抗原多肽的设计、偶联策略

抗原多肽的设计、偶联策略抗体是生命科学研究中不可或缺的工具之一，应用范围包括蛋白质表达检测和鉴定、蛋白质加工、蛋白质在细胞内的定位、免疫中和反应、蛋白质同源结构域研究、蛋白质纯化以及疾病的免疫诊断和治疗。

尽管抗体的制备过程不存在技术难点，但是抗原的选择以及所制备抗体的用途对能否获得一个优质高效的抗体至关重要。

以下将对抗原多肽的设计、偶联策略等逐一介绍.抗原设计首先选择合适的多肽序列，明确最终产物的用途对选择序列非常重要。

如果仅仅需要生产针对蛋白质某个区域的特异抗体，比如研究蛋白质N端的前提物，我们就需要设计N末端的多肽抗原。

如果抗体的使用目的是识别修饰的氨基酸，如磷酸化的丝氨酸、苏氨酸或者酪氨酸，乙酰化赖氨酸等，就必须对多肽进行相应的修饰。

如果抗体最终用来识别自然状态下的蛋白质，对抗原的设计就要求更高。

一般情况下抗血清能够识别用来免疫的多肽序列，但是不一定识别蛋白质的折叠结构。

蛋白质的抗原决定簇一般由6－12个氨基酸构成，呈连续性或者非连续性序列。

连续性抗原决定簇由连续的氨基酸序列构成，而非连续抗原决定簇包括一组非连续氨基酸，这些氨基酸由于蛋白质的折叠而形成在空间上相互毗邻。

针对连续性抗原决定簇的抗体能够识别没有被埋藏在蛋白质内部的序列，而非连续性抗原的抗体能否识别抗原决定簇取决于用于抗体生产的多肽是否存在二级结构。

氨基酸序列的亲水性、表露性、柔韧性决定了多肽的抗原性。

许多水融性的自然状态下的蛋白质其亲水序列暴露在外测，而疏水性氨基酸序列包埋在内部。

抗体结合蛋白质表面的抗原决定簇，另外抗原决定簇柔韧性比较高。

蛋白质的C末端经常暴露在外测并且有较高的柔韧性，因此经常被用来作为抗体生产的抗原。

但是如果C末端是跨膜蛋白质的膜内部分，该序列可能由于疏水性太强而不适合用来作为抗原。

同C末端序列类似，蛋白质的N末端序列也经常暴露在蛋白质的表面，同样为首选抗原序列。

预测蛋白特性（例如亲水性、疏水性）及二级结构（例如α－螺旋，β－折叠，β－回旋）的一些算法有助于选择表露性较高，有抗原性的内部序列以用于抗体生成。

16多肽与载体偶联——三种不同介导方式

一、Frdbio –SH介导多肽与载体偶联1. cKLH载体蛋白与sulfo-SMCC的偶联（以偶联20mg多肽为例，根据实验实际偶联量，所有试剂体积作同比缩放）1.1 称取20mg cKLH（Frdbio，Cat No.: BCJ0002），溶于2ml超纯水，配成【10 mg/ml cKLH溶液】。

1.2 称取10 mg Sulfo-SMCC(Frdbio)于2ml超纯水配成【5mg/ml Sulfo-SMCC溶液】。

1.3 将以上两种溶液等体积混匀，室温(25℃)反应60 min或者37℃反应30 min，磁力搅拌器慢速均匀搅动反应，避免产生气泡。

1.4 反应完后将以上反应溶液装入10kD透析袋，在PBS（pH7.2）溶液中透析除去过多Sulfo-SMCC，每隔3h换液，至少换3～4次，确保透析完全，即为【活化的cKLH载体】（有条件的也可以用sephdex-G25分子筛色谱分离或超滤管。

活化的cKLH要尽快使用，不可久放。

）2. 多肽的偶联偶联前需检测多肽中-SH活性。

2.1 Ellman试剂法检测多肽-SH状态:方法：在96孔酶标板中，10μl多肽+100μl Ellman试剂，用分光光度计在96孔酶标板中412nm进行测量，OD ＞0.15时，多肽SH正常，如果OD＜0.15，说明多肽被氧化或者自我交联，不可使用。

偶联完成之后，透析前用上述同样方法检测DO＜0.03时，说明多肽已经80%以上全部偶联，可继续添加多肽；如果OD＞0.03，说明多肽过量未全部偶联。

如果没有Nano分光光度计，直接观察颜色，颜色变黄，说明游离—SH过量。

2.2 称取20mg多肽溶解于5ml交联缓冲液(0.1M PB，0.15M NaCl)中，配成【4mg/ml的多肽溶液】（对于难溶肽，可用≤30%的DMSO溶解），一般我们只偶联5～10mg多肽，等比例缩小体积即可。

2.3 将第1.4步透析好的cKLH与第5步配好的【4mg/ml多肽溶液】混合，室温(25℃)4h。

抗原偶联选择方法

载体的选择：1.载体表面应首先应具有化学活性基团，这些基团可以直接与抗生素或农药分子偶联，这是化学偶联制备抗原的前提；2.其次,载体应具备一定的容量,可以偶联足够的分子；3.载体还应该是惰性的,不应干扰偶联分子的功能；4.而且载体应具有足够的稳定性,且应该是廉价易得的.载体蛋白质有牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OA)、钥孔血蓝蛋白(KLH)、人血清白蛋白(HSA)及人工合成的多聚赖氨酸(PLL)等这些蛋白质分子中的α和ε-氨基（等电点8和10）、苯酚基、巯基（等电点为9）、咪唑基（等电点为7）、羧基（等电点2～4,大部分来自天冬氨酸或谷氨酸的β-和γ-羧基）等在等电点pH条件下,一部分成为质子,另一部分未质子化的亲核基团则具有反应活性,可与半抗原中的对应基团结合.当然,这些基团的反应性也取决于蛋白质各种氨基酸残基的微环境.牛血清白蛋白（BSA）和人血清白蛋白（HAS）分子中含有大量的赖氨酸,故有许多自由氨基存在,且在不同pH和离子强度下能保持较大的溶解度.此外,这些蛋白质在用有机溶剂（如吡啶、二甲基甲酰胺）溶解时,其活性基团仍呈可溶状态,因此,这两种蛋白质是最常用的载体蛋白质.近年来,有研究报道用人工合成的多聚肽(最常用的是多聚赖氨酸)作载体,表现出能增加半抗原的免疫原性,从而使产生征对半抗原的特异性抗体可能性增加,被广泛应用。

人工抗原合成方法：小分子半抗原与载体蛋白偶联效果会到偶联物的浓度及其相对比例、偶联剂的有效浓度及其相对量、缓冲液成分及其纯度和离子强度、pH以及半抗原的稳定性、可溶性和理化特性等因素的影响.通常是在条件温和的水溶液中将半抗原与载体蛋白共价结合,不宜在高温、低温、强碱、强酸条件下进行.一般是由半抗原上的活性基团决定偶联合成的方法,常用的方法如下：分子中含有羧基或者可羧化的半抗原的偶联1）混合酸酐法（mixed anhydride method）：也称氯甲酸异丁酯法。

偶联时，半抗原分子中的羧基可与氯甲酸异丁酯在有机溶剂中形成混合酸酐(mixed acid anhydride)，然后与蛋白分子中的氨基形成肽键。

小分子和多肽偶联

小分子和多肽偶联小分子和多肽偶联是一种常见的生物化学研究方法，通过将小分子化合物与多肽分子结合，可以改变多肽的性质和功能。

这种偶联技术在药物研发、生物传感器、分子诊断等领域具有重要应用价值。

小分子和多肽的偶联可以通过多种化学反应实现。

其中，最常用的方法是通过偶联剂将小分子与多肽分子连接起来。

常见的偶联剂包括活性酯、酰胺、胺反应试剂等。

这些偶联剂能够与多肽分子中的氨基酸残基反应，形成稳定的化学键。

通过这种偶联反应，可以将小分子与多肽分子紧密结合，形成新的化合物。

小分子和多肽的偶联可以改变多肽的生物活性和稳定性。

多肽作为药物分子往往具有较短的半衰期和较低的生物利用度，限制了其在体内的应用。

而小分子化合物往往具有较长的半衰期和较高的生物利用度，具有更好的药物性质。

通过将小分子与多肽偶联，可以提高多肽的生物稳定性和药物活性，从而扩大其应用范围。

小分子和多肽的偶联还可以实现多肽的定向传递。

多肽分子往往具有特异性的靶向作用，可以与特定的受体结合。

通过将小分子与多肽偶联，可以将小分子的药物作用靶向到特定的组织或细胞。

这种定向传递的策略可以提高药物的疗效，减少副作用。

小分子和多肽的偶联在生物传感器领域也具有重要应用。

生物传感器是一种能够检测特定分子或生物事件的装置，具有高灵敏度和高选择性。

通过将小分子与多肽偶联，可以将多肽的靶向性和小分子的检测特异性相结合，实现对特定分子的灵敏检测。

这种偶联技术在疾病诊断、环境监测等领域有着广泛的应用前景。

小分子和多肽的偶联是一种重要的生物化学研究方法，可以改变多肽的性质和功能。

通过偶联技术，可以提高多肽的生物稳定性和药物活性，实现药物的定向传递，以及构建高灵敏度的生物传感器。

这种偶联技术在生物医药领域具有广阔的应用前景，有望为新药研发和疾病诊断提供新的思路和方法。

多肽药物设计的新思路和方法

多肽药物设计的新思路和方法在临床上，肽类药物具有广阔的应用前景，例如生长激素、降血糖素等，因为它们比蛋白质药物和小分子药物都具有更高的选择性和特异性。

虽然肽类药物具有许多优点，但是它们的发展在过去几十年里被一些缺点制约，例如代谢不稳定性、缺乏口服生物利用度和缺乏组织特异性等。

现在，多肽药物的设计思路和方法已经得到了很大的改进，这使得它们更容易被应用于临床。

以下是多肽药物设计的新思路和方法。

1. 间隔肽间隔肽是一种新型的肽类药物设计策略，它将两个或更多的肽类药物连结在一起，从而产生一个具有更高特异性和选择性的复合物。

间隔肽在药物设计中占据了一个越来越重要的位置，因为它能够增加肽类药物的稳定性、生物利用度和特异性。

与单一肽类药物相比，间隔肽还可以减少药物的副作用和毒性。

2. 结合增强剂结合增强剂是一种可用于肽类药物设计的新方法，它通过改变肽类药物与其受体的结合方式，从而增强药物的作用。

结合增强剂有两种形式：一种是可逆的结合增强剂，另一种是不可逆的结合增强剂。

在药物设计中，可逆的结合增强剂通常被用于增加肽类药物与其受体的亲和力，而不可逆的结合增强剂则用于增加药物的持续时间和效力。

3. 肽类药物的表面修饰肽类药物的表面修饰是一种将化学团添加到肽链上的新方法，从而增强药物的稳定性、选择性和生物利用度。

表面修饰可以使用多种方法进行，包括氨基酸修饰、糖基化、PEG化等。

一些表面修饰后的肽类药物已经在临床上获得了成功，并且正在被用于治疗多种疾病。

4. 全合成肽类药物全合成肽类药物是一种从头合成肽链的方法，它可以减少产生肽链剪切位点的风险，并且允许在药物设计中进行更广泛的化学修饰。

全合成肽类药物的设计可以通过多种途径进行，包括顺序合成、逆向合成和单片段合成等。

5. 胜肽技术胜肽技术是一种逆向合成肽类药物的新方法。

通过使用固相合成的技术，胜肽可以在不需要酶解作用的情况下从肽前体中合成。

胜肽技术可以为肽类药物的合成提供更高的速度和效率，从而在药物设计中得到广泛应用。

多肽偶联方案

多肽合成时, 先了解多肽的位点. 如果是炭末端多肽,直接用ALPHA氨基作为连接点. 如果是氨基末端的多肽, 得在多肽的炭末端加一个半胱氨酸(提供-SH基团)
赖氨酸Lys提供游离-NH2 天冬氨酸D 提供游离-COOH 谷氨酸E 提供游离-COOH 半胱氨酸C 提供游离-SH
标记到BSA 羧基端。

1、BSA稀释到1mg/mL（66KD，100个羧基）, 缓冲液为50mM MES（pH 6.0）+0.5M NaCl；
2、搅拌条件下，迅速加入2mM EDC（母液为：50mg/ml 0.25mol/ml）和5mM sulfo-NHS
（母液为：50mg/ml）；室温反应15min；
3、搅拌条件下，加入20mM巯基乙醇（约1/600），室温反应10min（如果蛋白对巯基乙醇
敏感，请改用脱盐柱），活化完毕；
4、目标多肽稀释到适当浓度（考虑与BSA 有效羧基的mol数成一定比例），缓冲液为
100mM PB7.5。

5、搅拌条件下，室温反应2hr；
6、透析至pbs 。

抗原与蛋白偶联方法

抗原与蛋白偶联方法常用的半抗原与蛋白偶联方法EDAC：EDC是一种羧基和氨基反应零长度交联剂。

EDC和与羧基反应形成氨基活化的O酰基异脲中间体，他可以迅速与氨基反应形成酰胺键，释放异脲副产物。

该媒介在水中不稳定，因此两步共轭反应依赖N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)稳定结构。

和氨基失败的反应导致媒介水解，羧基再生，释放N 代尿素。

副反应形成N酰基脲，这通常限制羧基定位蛋白的疏水区。

EDC用于偶联半抗原到载体蛋白原料：1.载体蛋白：2mg牛血清白蛋白BSA，卵白蛋白OV A或血蓝蛋白Keyhole limpet hemocyanin KLH2.偶联缓冲液：0.1M MES，pH4.5-53.EDC：10mg4.Hapten：1-2mg5.脱盐柱或凝胶过滤柱5-6KD阻隔。

操作步骤：1.平衡EDC到室温，加入2mg的BSA、OVA或KLH到200ul偶联缓冲液，如果用热电的载体蛋白用无菌水溶解。

2.溶解2mg多肽或半抗原到500ul偶联缓冲液加入200ul载体蛋白中。

3.对BSA或OVA结合，溶解10mg EDC到1ml超纯水立即加100ul(1mg EDC)该溶液到载体-多肽溶液中。

对KLH结合溶解10mg EDC到1ml超纯水立即加50ul(0.5mgEDC)该溶液到载体-多肽溶液中，如果发生沉淀进一步减少EDC用量。

4.室温反应2小时。

用脱盐柱纯化偶联蛋白，如果存储免疫原数天，无菌过滤储存在无菌容器中4或-20度保存。

用EDC和NHS或Sulfo-NHS两步法偶联偶联蛋白用EDC和Sulfo-NHS活化反应在pH4.5-7.2有效，然而NHS激活或Sulfo-NHS激活的分子具有伯胺在pH7-8时有效。

最好的结果是最初第一步反应在MES缓冲液中(或其他无氨基无羧基缓冲液pH5-6)，接着用磷酸盐缓冲液提高pH7.2-7.5(或其他无氨基无羧基缓冲液)立即与含氨基分子反应。

为了淬灭第一个反应用2巯基乙醇或其他可以容易去除的试剂，用脱盐柱换液。

了解多肽偶联药物

了解多肽偶联药物（PDC）通过癌细胞表面表达的分子选择性结合并发挥作用的靶向治疗是癌症治疗的一个重大进展，因为与传统的细胞毒性药物相比，靶向治疗具有更高的疗效和更好的耐受性。

在癌症治疗中，有三种靶向方法用于增强癌症治疗的特异性和抗肿瘤活性。

靶向制剂可设计为抑制肿瘤细胞表达的蛋白质，如受体或酶；另一种方法是使效应分子（例如ADC、双抗或CAR-T）与肿瘤细胞表面过表达的分子结合，并协同抑制肿瘤细胞分裂，同时提供细胞毒性有效载荷或刺激肿瘤导向免疫反应；第三种方法是使用多肽偶联药物（PDC），驱动肿瘤细胞中毒性有效载荷的富集。

目前临床上使用的许多靶向药物都是基于单克隆抗体，然而，ADC的治疗应用受到其理化和药效学特性的多种限制。

PDC把多肽作为肿瘤靶向载体具有许多优点，与ADC相比，它们易于合成，结构修饰可以很容易地引入，支持合理的药物设计，以提高生物利用度、亲和力和稳定性。

此外，多肽具有较低的免疫原性。

Melfulfen是目前已获批的一种高度亲脂性的PDC，它利用增加的氨基肽酶活性选择性地增加肿瘤细胞内细胞毒性烷化剂的释放和浓度，目前应用于多发性骨髓瘤的治疗。

另外一种获批的PDC是177Lu dotatate，一种结合生长抑素类似物和放射性核素的靶向放射治疗形式，它被批准用于治疗胃肠胰神经内分泌肿瘤。

偶联药物的结构为靶向给药而开发的偶联药物通常由三种成分组成，所有这些成分都有助于药物的整体生物疗效和选择性。

载体部分包括在该结构中，其靶向肿瘤特异性标记物。

除多肽外，还研究了一系列其他小分子和生物制剂，如天然蛋白质、抗体、粘附体、设计的锚蛋白重复蛋白和适配体，以提供肿瘤选择性。

载体分子与活性抗癌药物相连，可诱导多种生物功能。

目前，用于癌症治疗的药物偶联物主要包括介导细胞毒性的细胞毒性分子和放射性核素。

连接靶向载体分子与效应分子的共价连接子可以是可切割的或不可切割的。

一旦偶联药物与肿瘤细胞结合进入肿瘤细胞，可切割的连接子就能够控制有效载荷的药物释放。

关于半抗原偶联载体的方案

关于半抗原偶联载体的方案早上起来，一杯咖啡，看着窗外的阳光，心情大好。

今天要写的方案是关于半抗原偶联载体的，这个课题我已经研究了10年，是时候把我的思考整理出来了。

我们得明确半抗原偶联载体的概念。

简单来说，就是将半抗原和载体结合起来，形成一种新的免疫原，用于制备抗体或疫苗。

这个过程涉及到生物化学、分子生物学和免疫学等多个领域，所以方案要尽量全面，又要突出重点。

一、方案背景1.1半抗原概述半抗原，顾名思义，就是只有抗原性而没有免疫原性的物质。

它不能单独引起免疫反应，但可以与载体结合，形成免疫原。

常见的半抗原包括药物、糖类、多肽等。

1.2载体概述载体是具有免疫原性的物质，能够与半抗原结合，形成免疫原。

常见的载体有蛋白质、多聚糖、脂质等。

1.3半抗原偶联载体研究意义半抗原偶联载体在疫苗研发、抗体制备等领域具有广泛的应用前景。

通过半抗原偶联载体，我们可以提高抗原的免疫原性，降低副作用，提高疫苗的疗效。

二、方案目标2.1筛选合适的半抗原和载体2.2优化偶联方法，提高偶联效率2.3评估偶联载体的免疫原性2.4探索偶联载体在疫苗研发和抗体制备中的应用三、方案实施3.1半抗原筛选3.1.1收集文献，整理半抗原候选物质3.1.2分析候选物质的抗原性和免疫原性3.1.3筛选出具有潜在应用价值的半抗原3.2载体筛选3.2.1收集文献，整理载体候选物质3.2.2分析候选物质的免疫原性和生物相容性3.2.3筛选出具有潜在应用价值的载体3.3偶联方法优化3.3.1分析现有偶联方法的优缺点3.3.2设计新型偶联方法，提高偶联效率3.3.3对比实验，验证新型偶联方法的优越性3.4免疫原性评估3.4.1制备偶联载体3.4.2检测偶联载体的免疫原性3.4.3分析免疫原性结果，优化偶联载体3.5应用研究3.5.1疫苗研发3.5.2抗体制备3.5.3产业化推广四、方案进度安排4.1第一阶段：半抗原和载体筛选（1-3个月）4.2第二阶段：偶联方法优化（4-6个月）4.3第三阶段：免疫原性评估（7-9个月）4.4第四阶段：应用研究（10-12个月）五、预期成果5.1筛选出具有潜在应用价值的半抗原和载体5.2优化偶联方法，提高偶联效率5.3成功制备具有免疫原性的偶联载体5.4探索偶联载体在疫苗研发和抗体制备中的应用前景这个方案的实施需要团队的共同努力，大家一起加油，争取早日取得突破性成果！注意事项一：半抗原筛选的准确性解决办法：筛选半抗原时，一定要仔细分析文献，避免遗漏任何可能的候选物质。

多肽抗原的设计与抗体制备ppt课件

• 多肽两端的氨基酸对多肽溶解性的影响要远大于其中间序
列，因此要避免其两端有连续的两个疏水性氨基酸。
Ago2 SR0009 IVEHMVQHFKTQIF 极难溶
DGCR8 SR0004 LHILSKLQEEMKRL
TNFRSF19 SR0303 WSLRSQDIQYNGSELS 不溶于甲醇
可以用peptide companion 软件辅助判定多肽合成的难易程度，但是由于该软件默认了最后四个氨基酸是容易合成的，可是有时实际情况并不如此，因此依然需要综合考虑
>9810(100)
>9810(100)
4905(50) 3434(35) 1472(15) 981(10)
多肽脱盐条件选择
• Sephdex G-15: 适用于分子量在1500-2000多肽的脱盐，对于分子量
超过1500的多肽能够完全排阻。
• 柱子的选择：鼎国自产10mm×20cm色谱柱 • 柱床体积：根据上样体积确定，一般柱床的体积不要少于上样体积的
(7) OD214 =0.869 (8) OD214 =1.095 (9) OD214 =0.909 (10) OD214 =0.780 (11) OD214 =0.661 (12) OD214 =0.598
峰形区带变宽，收集第（6），（7），（8），（9），（10）管共约2.5ml，会有部分损失。
43
41
40
37
35
37
〉%
质谱分析（MS/ESI）
• 用途：测定合成的粗肽产物中目标肽的分子量，以此来衡量我们合成
的肽序列是否正确
• 原理：将样品分子离子化后，根据离子间不同的质荷比（m/z）来分
离并确定分子量。

蛋白抗原表位预测及抗原多肽设计

蛋白抗原表位预测及抗原多肽设计公司标准化编码 [QQX96QT-XQQB89Q8-NQQJ6Q8-MQM9N]蛋白抗原表位预测及抗原多肽设计利用在线软件BepiPred Server（）从蛋白序列直接预测抗原表位还有其他在线预测网站进Antigenic Peptide Prediction 用tools把氨基酸序列粘贴进去，就可以直接得出预测结果抗原多肽选择的基本原则1、尽可能是在蛋白表面2、保证该段序列不形成α-helix3、N,C端的肽段比中间的肽段更好4、避免蛋白内部重复或接近重复段的序列5、避免同源性太强的肽段6、交联可以交联在N，C两端，选择依据就是交联在对产生抗体不太重要的一端7、序列中不能有太多的Pro,但有一两个Pro有好处，可以使肽链结构相对稳定一些，对产生特异性抗体有益。

抗原多肽设计的基本原则????? 为了使生产抗体获得最佳效果，仔细地设计抗原多肽是很有必要的，设计应满足一个基本条件：在免疫过程中，该抗原既不会产生过强的免疫反应，同时又能产生出对感兴趣的蛋白有结合能力的抗体。

然而，在没有这样精确的结构信息（多数是这种情况）的情况下，了解研究的用途（应用）会影响多肽设计的策略。

例如：如果研究重点是集中在蛋白的不同区域，如C端或N端，或在一种特定状态下的蛋白，如磷酸化等，那么按照所需序列设计的多肽和产生的相应的抗体在应用上应该没有太大的困难，然而，蛋白的构象将影响抗体与其识别区域之间的相互作用。

这种情况下可能存在的问题是如果在折叠的蛋白中，该识别区域被藏在蛋白的内部，抗体将无法接触到该区域。

蛋白抗原表位预测算法及抗原多肽设计原则

蛋白抗原表位预测算法及多肽抗原设计原则概述为了获取识别天然蛋白的抗体，有两种方式可以选择。

一种是利用重组蛋白的方式获取尽可能接近天然条件下的重组蛋白，然后刺激试验动物免疫系统，进而获取相应抗体。

这种方式获取抗体的成功率较高且效价较好；另一种是预测天然蛋白的抗原决定簇，这种抗原决定簇最终体现为多肽形式，将其与相应的载体偶联后刺激试验动物免疫系统，也可以获取相应的抗体。

这种方式的选择有其特殊需要。

我们德泰生物科技南京有限公司提供这两种类型的抗体定制服务。

什么是抗原决定簇蛋白质表面部分可以使免疫系统产生抗体的区域叫抗原决定簇。

一般抗原决定簇是由 6－12 氨基酸或碳水基团组成，它可以是由连续序列（蛋白质一级结构）组成或由不连续的蛋白质三维结构组成。

蛋白抗原表位预测方法目前蛋白质抗原表位预测的方法大致可以分为两类，一类是基于蛋白质高级结构预测，像beta‐转角、膜蛋白跨膜区预测等；一种是基于氨基酸的统计学倾向性，像亲水性（hydrophilicity）、弹性（flexibility）、表面可接触性（surface accessibility）、抗原倾向性（antigenic propensity）。

具体算法请参考相关文献，部分文献如下：1)Chou, Fasman Adv Enzymol Relat Areas Mol Biol. 1978;47:45‐148.2)Hopp, T.P. and Woods, K.R. (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 3824‐3828.3)Welling, G.W., Weijer, W.J., van der Zee, R. and Welling‐Wester, S. (1985) FEBS Lett. 188,215‐218.4)Karplus PA, Schulz GE. Naturwissenschafren 1985; 72:212‐3.5)Emini EA, Hughes JV, J Virol. 1985 Sep;55(3):836‐9.6)Parker, J.M.R., Guo, D. and Hodges, R.S. (1986) Biochemistry 25, 5425‐5432.7)Schmidt, A.M. (1989) Biotect. Adv. 7, 187‐213.8) A.S. Kolaskar and Prasad C. Tongaonkar (1990) FEBS 092109)K. Hofmann & W. Stoffel (1993)10)Paul Horton, Keun‐Joon Park, Takeshi Obayashi & Kenta Nakai, Proceedings of the 4th AnnualAsia Pacific Bioinformatics Conference, Taiwan. pp. 39‐48, 2006.11)Jens Erik Pontoppidan Larsen, Ole Lund and Morten Nielsen. Immunome Res. 2006选择多肽抗原的方法不同算法预测出的候选多肽序列有所不同，需要综合考虑各种预测方法，同时结合实际应用进行最终选择。

抗原多肽设计

抗原多肽选择的基本原则1．尽可能是在蛋白表面2．保证该段序列不形成α-helix3．N,C端的肽段比中间的肽段更好4．避免蛋白内部重复或接近重复段的序列5．避免同源性太强的肽段6．交联可以交联在N、C两端，选择依据就是交联在对产生抗体不太重要的一端7.序列中不能有太多的Pro,但有一两个Pro有好处，可以使肽链结构相对稳定一些，对产生特异性抗体有益。

为了使生产抗体获得最佳效果，仔细地设计抗原多肽是很有必要的，设计应满足一个基本条件：在免疫过程中，该抗原既不会产生过强的免疫反应，同时又能产生出对感兴趣的蛋白有结合能力的抗体。

1.确定抗体的用途（应用）新开展一个研究项目，弄清楚所感兴趣的蛋白的一些基本特性是很有必要的，特别是如果知道蛋白的结构会对选择抗体易于接触和识别的识别区域有很大的帮助。

然而，在没有这样精确的结构信息（多数是这种情况）的情况下，了解研究的用途（应用）会影响多肽设计的策略。

例如：如果研究重点是集中在蛋白的不同区域，如C端或N端，或在一种特定状态下的蛋白，如磷酸化等，那么按照所需序列设计的多肽和产生的相应的抗体在应用上应该没有太大的困难，然而，蛋白的构象将影响抗体与其识别区域之间的相互作用。

这种情况下可能存在的问题是如果在折叠的蛋白中，该识别区域被藏在蛋白的内部，抗体将无法接触到该区域。

（无法产生相互作用）。

2.识别区域的选择原则一般说来最理想的抗原性识别区域应具备亲水、位于蛋白表面和结构上易变形性等特点。

因为在大多数的天然（自然）环境中，亲水区域倾向于集中在蛋白表面，而疏水区域常常被包裹在蛋白内部，同样道理，抗体只能与在蛋白表面发现的识别区域相互作用，而当这些识别区域有足够的结构易变形性而转移到抗体可接触的位置时，将会与抗体间有很高的亲和性。

3.连续的与不连续的识别区域连续的区域是指由连续的氨基酸序列（残基）构成的识别区域。

大多数抗体是针对连续识别区域的，抗体能与这类区域以很高的亲和力相结合表明这段序列不在蛋白内部。