BSA蛋白偶联多肽技术

1．1．1多肽合成

按照多肽合成常规操作，合成来源于上海楚肽生物科技有限公司（Apeptide CO.,Ltd.) HPLC检测纯度为95%。多肽C端增加的半胱氨酸残基用于以其巯基连接于偶联剂上。

1．1．2 合成多肽与载体的偶联

载体蛋白选择BSA（Roche公司），用SPDP（PIERCE公司）连接法将合成的多肽与BSA进行偶联：4.6mgSPDP溶解于740ulDMSO，终浓度为20mM。0.1008gBSA溶解于2ml PBS-EDTA溶液中，室温静置1h。HiTrap TM Deaslting column脱盐柱洗脱多余的SPDP。4mg多肽加入偶联好的

BSA-SPDP体系中室温过夜。

1．1．3 抗多肽抗体的制备

选体重1. 5～2 kg的健康雄性新西兰大白兔，按常规操作卡介苗活化其免疫系统。将偶联的BSA-多肽过滤除菌，100mg（2ml）加等体积的不完全佐剂，充分混悬。在新西兰大白兔背部多点皮下注射，4周后加强免疫，其后每隔2周进行1次加强免疫，注射途径与初次免疫相同，共两次后，检测效价。耳源静脉采血、分离血清。

1．1．4 多肽抗体的纯化

Protein G柱分离纯化IgG抗体：PBSpH7.4平衡Protein G亲和柱，以0.1M Gly-HCl pH3.0洗脱，PBSpH7.4透析，分装，-20℃保存。1mM预冷的HCl充分膨胀Sepharose 4FF（GE公司）后，15个体积的1mMHCl清洗去残留的蔗糖，每次清洗2min。偶联缓冲液0.1MNaHCO3 pH8.3 0.5M NaCl平衡2次。多肽溶于偶联缓冲液，调节pH值到pH8.3后，加入凝胶，室温混旋3h。加入1M预冷的乙醇胺混旋2h阻断未偶联上的活化位点。50mM Tris-HCl pH8.0，1MNaCl 溶液与50mM Gly-HCl pH3.5，1M NaCl 交替清洗8次。PBS缓冲液平衡10倍体积。装柱，平衡，上样后以0.1MGly-HCl pH2.2洗脱，PBS透析，分装，-20℃冻存。

1．1．5 免疫双扩散

在制备的琼脂板上按7孔一组的梅花形打孔（中间1孔，周围6孔），孔径约5mm，孔距2mm~5mm，吸取多肽抗原悬液滴入中间孔，等倍稀释的血清分别加入外周的对称孔中。37℃温箱中作用，于24h 后观察结果。吸取血清滴入中间孔，等倍稀释的多肽抗原分别加入外围的对称孔中，37℃温箱中作用，于24h后观察结果。

好的设计+好的多肽质量是制备好的抗体必要条件！SPDP

中文名：3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯

英文名：N-succinimidyl-3-(2-pyridyldithiol)propionate

分子式：C12H12N2O4S2；分子量：312.37；应用：交联氨基和巯基

外观：白色或浅黄色粉末；储存条件：0-5℃；运输条件：室温；储存条件：冷藏保存

产品描述：SPDP，一种异-双官能试剂，用于结合两种不同的蛋白质，诸如酶和抗体。SPDP首先经由其氨基与一个蛋白质分子反应。SPDP向该蛋白质中引入吡啶二硫基，接着该吡啶二硫基由DTT还原形成硫醇基。这些硫醇基接着与另一蛋白质分子形成二硫键，从而产生异二聚物蛋白质。

BSA

牛血清白蛋白BSA，Bovine Serum Albumin：1、在酶切反应缓冲液中加入BSA，通过提高溶液中蛋白质的浓度，对酶起保护作用。防止酶的分解和非特异性吸附，能减轻有些酶的变性，能减轻

2 、ELISA中也常常用到，比如封闭液，样本稀释液，酶结合物稀释液都可以用BSA。