抗原与蛋白偶联方法
BSA蛋白偶联多肽技术
1．1．1多肽合成按照多肽合成常规操作，合成来源于上海楚肽生物科技有限公司（Apeptide CO.,Ltd.) HPLC检测纯度为95%。
多肽C端增加的半胱氨酸残基用于以其巯基连接于偶联剂上。
1．1．2 合成多肽与载体的偶联载体蛋白选择BSA（Roche公司），用SPDP（PIERCE公司）连接法将合成的多肽与BSA进行偶联：4.6mgSPDP溶解于740ulDMSO，终浓度为20mM。
0.1008gBSA溶解于2ml PBS-EDTA溶液中，室温静置1h。
HiTrap TM Deaslting column脱盐柱洗脱多余的SPDP。
4mg多肽加入偶联好的BSA-SPDP体系中室温过夜。
1．1．3 抗多肽抗体的制备选体重1. 5～2 kg的健康雄性新西兰大白兔，按常规操作卡介苗活化其免疫系统。
将偶联的BSA-多肽过滤除菌，100mg（2ml）加等体积的不完全佐剂，充分混悬。
在新西兰大白兔背部多点皮下注射，4周后加强免疫，其后每隔2周进行1次加强免疫，注射途径与初次免疫相同，共两次后，检测效价。
耳源静脉采血、分离血清。
1．1．4 多肽抗体的纯化Protein G柱分离纯化IgG抗体：PBSpH7.4平衡Protein G亲和柱，以0.1M Gly-HCl pH3.0洗脱，PBSpH7.4透析，分装，-20℃保存。
1mM预冷的HCl充分膨胀Sepharose 4FF（GE公司）后，15个体积的1mMHCl清洗去残留的蔗糖，每次清洗2min。
偶联缓冲液0.1MNaHCO3 pH8.3 0.5M NaCl平衡2次。
多肽溶于偶联缓冲液，调节pH值到pH8.3后，加入凝胶，室温混旋3h。
加入1M预冷的乙醇胺混旋2h阻断未偶联上的活化位点。
50mM Tris-HCl pH8.0，1MNaCl 溶液与50mM Gly-HCl pH3.5，1M NaCl 交替清洗8次。
PBS缓冲液平衡10倍体积。
装柱，平衡，上样后以0.1MGly-HCl pH2.2洗脱，PBS透析，分装，-20℃冻存。
蛋白交联(参考资料)
蛋白质交联方法及其应用蛋白质交联系指将小分子物质（如药物、半抗原等）或大分子物质(如酶、蛋白毒素等)以共价键的方式连接于蛋白质分子，以制备人工抗原、酶标抗体、载体释放药物、抗体导向药物和免疫毒素等。
随着放射免疫分析法、酶标免疫技术、载体药物学和导向物学的发展，蛋白质交联技术的方法和手段也不断改进和完善，并且在生物学和医学领域得到愈来愈广泛的应用。
蛋白质交联方法首先发展于人工抗原的制备研究。
自70年前Landsteiner第一次合成人工抗原以来，人们将许多没有抗原性的小分子物质(半抗原)如化学药物、神经递质和激素等与蛋白质或多糖等载体大分子共价结台；使其具备抗原性，以诱发动物产生特异性抗体，用于放射免疫分析等。
为了使放射免疫分析达到灵敏度高、特异性强的要求，前人对半抗原和蛋白质连接的方法进行了大量的研究，建立了重氮化法、戊二醛法、混合酸酐法、二异氰酸酯法及卤代硝基苯法等交联技术。
近10多年来发展起来的酶标免疫检测技术，要求制备保持酶的生物活性和抗体的免疫结合活性的酶—抗体偶合物。
常用的交联方法如戊二醛法、碳二亚胺法和混合酸酐法不可避免地要产生酶或抗体的自身交联产物或多聚物，致使交联效率降低、结合物活性减弱。
为了克服这一不足，人们发展了异型双功能交联试剂，如N—羟基琥珀酰亚胺—3—(2吡啶基二硫)—丙酸酯，以实现控制交联，提高交联反应的选择性和交联产物的均一性。
将药物与大分子载体连接，制备药物一载体结合物，以改善和控制药物在体内的转运和代谢，实现缓释给药和定向给药，提高生物利用度和治疗指数。
这是现代药物研究领域一个崭新的分支。
载体药物必须能够在体内定量、定位释放原型药物，因此要求设计pH敏感或特定酶敏感的偶联键。
导向药物的发展对蛋白质交联方法提出了更高的要求。
早在1906年，Ehrlich就提出了靶向给药的设想。
随着生物医学的发展，这一设想不断得到具体的实现。
单克隆抗体作为导向载体的出现，更使导向药物的研究成为当代药物研究中最活跃和最引人注目的领域之一，而其中研究得最广泛的是肿瘤治疗的抗体导向研究。
蛋白质免疫印迹(Western Blot )实验步骤和原理及注意事项
蛋白质免疫印迹（Western Blot ）实验步骤和原理及注意事项1.收集蛋白样品(Protein sample preparation)可以使用适当的裂解液。
收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。
根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。
因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。
BCA法。
2. 电泳(Electrophoresis)(1) SDS-PAGE凝胶配制(2) 样品处理在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
使用5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。
100℃或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白（根据蛋白分子的大小，煮沸时间可适当变化，一般不低于5min。
煮沸只是变性蛋白，而不是分解，一般加了抑制酶不会分解。
煮沸对于SDS-PAGE凝胶电泳是必须的，只有煮沸,才能消除蛋白质的立体二级结构,伸展为一维线性结构,所以一般来讲二聚体都会解体,才能完全按照分子量跑电泳,加的蛋白Marker才有指示分子量的意义。
蛋白样品变性后与SDS充分结合，SDS使每个氨基酸带相同的电荷,使整个蛋白呈线性结构. 抗体因为要是线性表位结合的，100度煮10min 后13000,离心5分钟,取上清电泳,因为沉淀会导致拖尾.也可以取上清到另一管,4度可以放一周备再次电泳）。
(3)电泳i.清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。
两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。
ii.灌胶与上样（1）玻璃板对齐后放入夹中卡紧。
然后垂直卡在架子上准备灌胶。
（操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。
）（2）配10%分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。
灌胶时，可用10 ml枪吸取5 ml胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。
ELISA原理和实验
ELISA原理和实验ELISA的原理基于免疫学和酶学的原理。
它利用抗原与抗体之间的高度专一性和互相结合的性质，通过将抗原或抗体固定在固相（如微孔板）上，再加入未标记或标记有酶的抗体或抗原，利用酶反应可见色素形成的特性来测定目标物的存在和浓度。
直接ELISA是一种简单的ELISA方法，直接测定样品中的抗原。
首先，在微孔板上涂覆纯化的抗体，使其与微孔板表面结合。
然后，将含有抗原的样品加入微孔板孔中，抗原与涂覆的抗体结合。
接下来，加入与抗原特异性结合的抗体（通常是与酶标记物共偶联的抗体），洗涤掉非特异性结合物质，并使抗原与酶标记物的抗体发生结合。
最后，加入适当的底物，通过酶反应产生的可见色素变化测定抗原的存在和浓度。
间接ELISA是一种常用的ELISA方法，用于检测抗体。
首先，在微孔板上涂覆纯化的抗原或蛋白质，使其与微孔板表面结合。
然后，加入样品，例如患者血清，其中包含待测抗体。
接下来，加入与待测抗体特异性结合的抗体（通常是与酶标记物共偶联的抗人或抗动物IgG抗体），洗涤掉非特异性结合物质。
最后，加入适当的底物，通过酶反应产生的可见色素变化测定抗体的存在和浓度。
竞争ELISA也称为抗原饱和法，用于测定溶液中的抗原。
首先，在微孔板上涂覆纯化的抗体，使其与微孔板表面结合。
然后，加入含有已知浓度的抗原的样品溶液和待测抗原样品溶液，它们将竞争与涂覆的抗体结合。
接下来，加入与该抗原特异性结合的抗体（通常是与酶标记物共偶联的抗体），洗去未结合的抗体。
最后，加入适当的底物，通过酶反应产生的可见色素变化测定待测抗原的存在和浓度。
夹心ELISA是一种用于检测特定抗原的双抗体夹心法。
首先，在微孔板上涂覆特异性抗体，使其与微孔板表面结合。
然后，加入待测样品，使其与固定的抗体结合。
接下来，加入另一种特异性抗体（通常与酶标记物共偶联的抗体），使其与抗原结合。
最后，加入适当的底物，通过酶反应产生的可见色素变化测定抗原的存在和浓度。
常用的半抗原与蛋白偶联方法简介
常用的半抗原与蛋白偶联方法简介公司标准化编码 [QQX96QT-XQQB89Q8-NQQJ6Q8-MQM9N]常用的半抗原与蛋白偶联方法简介（一）分子中含有羧基或可羧化的半抗原的偶联）1、混合酸酐法，也称氯甲酸异丁酯法（isobutyl chloroformate method）偶联时，半抗原分子中的羧基可与氯甲酸异丁酯在有机溶剂中形成混合酸酐(mixed acid anhydride),然后与蛋白分子中的氨基形成肽键。
氨甲喋呤（MIT）与β-半乳糖苷酶偶联的混合酐法1、5．8mg MIT用二甲基甲酰胺溶解，冷却至10度，加2ul氯甲酸异丁酯，10度搅拌反应30分钟。
2、酶用2ml 50 m mol/L Na2CO3溶解。
3、10度反应4小时（必要时加NaOH,以维持溶液的pH为，q然后4度过夜。
4、过sephadex G-25层析柱，柱用含NaCl 100m mol/L、MgCl2 10 m mol/L、2-巯基乙醇10 m mol/L的50m mol/L Tris-醋酸缓冲液平衡和洗脱，合并含酶的洗脱管内液体，进一步纯化后，保存于含BSA ％（w/v）、NaN3 %(w/v)的缓冲液中。
碳化二亚胺法制备3,3`,5-三碘甲腺氨酸-血蓝蛋白免疫原的操作步骤1、??取EDC 100mg , 用的10 m mol/L PBS液使之充分溶解（I液）2、??取3，3`,5-三碘甲腺原氨酸 25mg , 用L NaOH 溶液2ml 溶解(II液)3、??取血蓝蛋白(lemocyanin) 25mg, 溶于10mmol/L PBS （）液中（III 液）4、??将II液与III液混合，在磁力搅拌下逐滴加入I液（余下）5、??室温下避光搅拌1小时，逐滴加入余下的I液6、??4度搅拌12小时7、??静置10小时（4度）8、??有蒸馏水使之充分透析（约48小时），得免疫原。
孕酮与与β-半乳糖苷酶偶联的N-羟琥珀酰亚胺酯法1、??用二垩烷(dioxane)溶解孕酮-11-半琥珀酸酯，配成浓度为100m mol/L 的溶液。
生物素偶联抗体原理
生物素偶联抗体原理引言：生物素偶联抗体技术是一种常用的生物化学和分子生物学实验技术，用于检测和定位特定分子在细胞或组织中的位置。
本文将介绍生物素偶联抗体的原理及其在实验中的应用。
一、生物素偶联抗体的原理生物素偶联抗体技术是利用生物素与生物素结合蛋白（biotin-binding protein）的高度特异性结合来实现的。
生物素与生物素结合蛋白之间的结合非常紧密，形成了极为稳定的化学键。
因此，将生物素偶联到抗体分子上，可以通过与生物素结合蛋白的结合，实现对目标分子的检测和定位。
生物素偶联抗体的制备可以通过多种方法实现，最常见的方法是利用偶联剂将生物素与抗体分子进行共价结合。
偶联剂通常是活化的生物素分子，可以与抗体上的氨基或硫基发生化学反应，形成共价键。
这样，生物素就被牢固地连接到抗体上，形成生物素偶联抗体。
二、生物素偶联抗体的应用生物素偶联抗体技术在生物学和医学研究中得到了广泛应用，主要包括以下几个方面：1. 免疫组织化学（IHC）：生物素偶联抗体技术可以用于在组织切片中检测和定位特定抗原的表达。
通过将生物素偶联抗体与组织切片中的抗原特异性结合，再利用生物素结合蛋白与生物素的结合，可以通过染色或荧光标记的方法，可视化目标抗原在组织中的位置。
2. 免疫印迹（Western blot）：生物素偶联抗体技术也可以用于检测和定量目标蛋白在细胞或组织中的表达水平。
通过将生物素偶联抗体与目标蛋白结合，再利用生物素结合蛋白与生物素的结合，可以通过化学发光或荧光检测方法，定量目标蛋白的表达水平。
3. 免疫沉淀（Immunoprecipitation）：生物素偶联抗体技术可以用于纯化目标蛋白及其与其他蛋白的相互作用。
通过将生物素偶联抗体与目标蛋白结合，再利用生物素结合蛋白与生物素的结合，可以将目标蛋白及其结合蛋白从混合物中特异性地沉淀下来，实现对蛋白的纯化。
4. 免疫染色（Immunostaining）：生物素偶联抗体技术可以用于检测和定位细胞表面或内部蛋白的表达。
《蛋白质连接技术》课件
重组蛋白
通过基因工程技术将两个或多个蛋白 质基因连接起来，在大肠杆菌或酵母 等微生物中表达，得到连接的重组蛋 白。
蛋白质连接技术的应用领域
蛋白质结构研究
通过蛋白质连接技术可以研究 和了解蛋白质的结构和功能关 系，进一步用蛋白质连接技术可以设计 和构建新的蛋白质药物或蛋白 质导向药物，用于治疗疾病。
02
基因工程技术连接蛋白质的方法 包括基因克隆、基因表达和蛋白 质纯化等步骤，可以用于制备具 有特定功能的蛋白质。
化学合成法连接蛋白质
化学合成法连接蛋白质是指通过化学 合成的方法将氨基酸序列不同的蛋白 质进行连接。
化学合成法连接蛋白质的方法包括固 相肽合成、多肽缩合、肽段连接等步 骤，可以用于制备具有特定序列和功 能的蛋白质。
生物传感器
将不同的蛋白质分子连接起来 制备生物传感器，用于检测生 物样品中的物质。
生物催化
将酶和其他蛋白质分子连接起 来制备生物催化剂，用于催化
化学反应。
02
蛋白质连接技术的基本原理
蛋白质的化学结构与性质
蛋白质由氨基酸组成，具有复 杂的空间结构。
蛋白质的性质包括稳定性、可 溶性、生物活性等，这些性质 与蛋白质的结构密切相关。
蛋白质连接的效率是 指连接反应的速度和 产物的纯度。
提高连接效率和选择 性是蛋白质连接技术 的关键。
选择性是指连接反应 具有高度的专一性， 能够区分不同的蛋白 质分子。
03
蛋白质连接技术的方法与步骤
基因工程技术连接蛋白质
01
基因工程技术连接蛋白质是指通 过基因工程技术将蛋白质的编码 基因进行重组，实现蛋白质的连 接。
蛋白质连接技术经历了从传统化学方 法到现代基因工程方法的演变，具有 越来越广泛的应用前景。
半抗原与蛋白质偶联技术课件
录
• 半抗原的介绍 • 蛋白质偶联技术的介绍 • 半抗原与蛋白质偶联的方法 • 偶联效果的评估 • 实例展示
01
半抗原的介绍
半抗原的定义
半抗原
是指那些能够与抗体结合，但没 有免疫原性的小分子物质。
半抗原的特点
具有反应原性，即能够与抗体结 合的特性，但本身不具有免疫原 性，不能诱导机体产生免疫应答 。
蛋白质偶联技术的应用
蛋白质偶联技术在免疫分析、 生物传感器、抗体药物等领域 具有广泛的应用。
通过将半抗原与蛋白质载体进 行偶联，可以制备出具有特定 功能的免疫分析试剂，用于检 测生物样品中的目标物质。
此外，蛋白质偶联技术还可以 用于制备抗体药物和生物传感 器，以治疗疾病和监测环境中 的有害物质。
03
荧光标记法
利用荧光标记技术检测偶联产物的荧光强度，通过与标准品比较，判断偶联产 物的活性。
偶联产物的稳定性检测
热稳定性检测
通过加热处理偶联产物，观察其稳定性和热失活情况，以评 估偶联产物的热稳定性。
储存稳定性检测
将偶联产物在不同温度和湿度条件下储存，定期检测其活性 变化，以评估偶联产物的储存稳定性。
偶联产物的活性检测
通过生物学实验验证偶联产物是否保 持了原有蛋白质的生物学活性，如细 胞增殖、信号转导等。
实际应用中的实例
肿瘤免疫治疗
利用半抗原与蛋白质的偶联技术制备肿瘤免疫治疗药物，通过激活患者自身的免疫系统 来攻击肿瘤细胞。
疫苗研发
将半抗原与病毒或细菌的蛋白质结合，制备出具有免疫原性的疫苗，用于预防传染病。
碳二亚胺法
总结词
一种高选择性的偶联方法，通过形成稳 定的酰胺键将半抗原偶联到蛋白质上。
VS
抗原与蛋白偶联方法
抗原与蛋白偶联方法常用的半抗原与蛋白偶联方法EDAC：EDC是一种羧基和氨基反应零长度交联剂。
EDC和与羧基反应形成氨基活化的O酰基异脲中间体，他可以迅速与氨基反应形成酰胺键，释放异脲副产物。
该媒介在水中不稳定，因此两步共轭反应依赖N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)稳定结构。
和氨基失败的反应导致媒介水解，羧基再生，释放N 代尿素。
副反应形成N酰基脲，这通常限制羧基定位蛋白的疏水区。
EDC用于偶联半抗原到载体蛋白原料：1.载体蛋白：2mg牛血清白蛋白BSA，卵白蛋白OV A或血蓝蛋白Keyhole limpet hemocyanin KLH2.偶联缓冲液：0.1M MES，pH4.5-53.EDC：10mg4.Hapten：1-2mg5.脱盐柱或凝胶过滤柱5-6KD阻隔。
操作步骤：1.平衡EDC到室温，加入2mg的BSA、OVA或KLH到200ul偶联缓冲液，如果用热电的载体蛋白用无菌水溶解。
2.溶解2mg多肽或半抗原到500ul偶联缓冲液加入200ul载体蛋白中。
3.对BSA或OVA结合，溶解10mg EDC到1ml超纯水立即加100ul(1mg EDC)该溶液到载体-多肽溶液中。
对KLH结合溶解10mg EDC到1ml超纯水立即加50ul(0.5mgEDC)该溶液到载体-多肽溶液中，如果发生沉淀进一步减少EDC用量。
4.室温反应2小时。
用脱盐柱纯化偶联蛋白，如果存储免疫原数天，无菌过滤储存在无菌容器中4或-20度保存。
用EDC和NHS或Sulfo-NHS两步法偶联偶联蛋白用EDC和Sulfo-NHS活化反应在pH4.5-7.2有效，然而NHS激活或Sulfo-NHS激活的分子具有伯胺在pH7-8时有效。
最好的结果是最初第一步反应在MES缓冲液中(或其他无氨基无羧基缓冲液pH5-6)，接着用磷酸盐缓冲液提高pH7.2-7.5(或其他无氨基无羧基缓冲液)立即与含氨基分子反应。
为了淬灭第一个反应用2巯基乙醇或其他可以容易去除的试剂，用脱盐柱换液。
3.细胞融合及单克隆抗体的制备
(3) 细胞融合： 50%PEG(400~1000), pH8.0, 37oC, 2min
3.融合细胞的筛选
融合后细胞混合液
HAT培养基
2 weeks later
HT培养基
1 week later
正常培养基
4.抗体的检测
常用方法：
要求： ➢ 简便、快速、敏感; ➢ 在短时间内能检测大量样品
+3.6ml M
150ul/孔
E、F、 G、H
调细胞浓度为1-5х103cell/ml 取100个cell于7.2ml完全培养液 (M)中
2个cell/孔
1个cell/孔
0.5个cell/孔
6.杂交瘤细胞的鉴定
染 色 体 核 型 分 析
大规模培养——批量生产单克隆抗体
常用的大规模培养方法：
动物接种法 转瓶培养法
溶液能产生最多杂交细胞。 PEG溶液在pH6.0时细胞融合率最高。
PEG诱导融合的特点：其优点是融合成本低，勿 需特殊设备；融合子产生的异核率较高；融合过 程不受物种限制。其缺点是融合过程繁琐，PEG 可能对细胞有毒害。
PEG的作用机理： Kao等认为，由于PEG分子具有 轻微的负极性，故可以与具有正极性基团的水、蛋 白质和碳水化合物等形成H键，从而在在质膜之间 形成分子桥，其结果是使细胞质膜发生粘连进而促 使质膜的融合；另外，PEG能增加类脂膜的流动 性，也使细胞的核、细胞器发生融合成为可能。
电融合的基本过程：
细胞膜的接触：当原生质体置于电导率很低的溶液
中时，电场通电后，电流即通过原生质体而不是通过 溶液，其结果是原生质体在电场作用下极化而产生偶 极子，从而使原生质体紧密接触排列成串；
半抗原偶联
• 对氨基苯胺的衍生物的半抗原与抗体反应
• 抗苯胺、邻氨基苯甲酸、间氨基苯甲酸、 对氨基苯甲酸的抗血清。
• 旋光异构体（右旋酒石酸、左旋酒石酸、 内消旋酒石酸）
半抗原与载体偶联时，思考问题 •
1）半抗原的溶解度和稳定性：在结合反应中应不导致半抗原活性 的改变，同时也不能使载体变性至不溶解的程度。 2）偶联的位置：抗体对远离蛋白质联接点的半抗原部分有最好的 特异性，故联接时应使联接键远离半抗原的决定簇。 3）选择适合的偶联试 剂：不同的半抗原在偶联时，应根据半抗 原的化学结构，以及反应方式选择适当的偶联试剂。如小分子肽 类有一定的三级结构，在溶液中依靠氨基酸残基来维持其结 构的 稳定。因此，用双功能的亚氨酸酯不但对氨基酸有选择，而且能 代替被取代的每一个ε-氨基的正电荷。蛋白质与偶联剂接触后， 使不同蛋白质分子的功能基团 交联并凝聚。广泛交联的蛋白质， 其溶解度常降低，而这种溶解度差的蛋白质却是有效的免疫源。 • 4)载体蛋白的选择,异源性以及不干扰未来的检测对象 .
• （1） 琥珀酸酐法：本法用于带有羟基的半抗 原的改造。琥珀酸酐加水转变成琥珀酸。如将 带有羟基的半抗原和琥珀酸酐在无水吡啶中反 应，即可得到带有羧基的半抗原琥珀酸的衍生 物。
四、通过巯基偶联
• 将半抗原中的巯基，通过交联剂马来酰亚胺活 化的载体蛋白与含SH-的半抗原的交联
含巯基半抗原偶联反应图
七、通过酚基与载体蛋白偶联 • 一氯醋酸钠：本法适于带有酚基半抗原的改造。 将带有酚基的药物与一氯醋酸钠反应即可得到 带有羧基的半抗原衍生物
将酚基与对氨基苯甲酸反应 • 将酚基与对氨基苯甲酸反应导入羧基，再进一 步通过EDC等方法，实现半抗原与载体蛋白质 的偶联
八、通过糖基的过碘酸氧化法
edc nhs酰胺化反应比例
一、edc nhs酰胺化反应的定义edc nhs酰胺化反应是一种常用的生物化学实验技术，用于在蛋白质或肽链上引入功能基团，以实现蛋白质的共价修饰或与其他生物大分子的偶联。
该方法通过使用1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide (EDC) 和n-hydroxysuccinimide (NHS) 催化、转化为草酰胺活性基团，实现对生物大分子的特异性偶联，可以应用于抗原与载体偶联，酶或荧光物质的标记等多种研究领域。
二、edc nhs酰胺化反应的机理edc nhs酰胺化反应的机理主要分为三个步骤：EDC与NHS在水溶液中反应生成O-acylisourea活性中间体；O-acylisourea中间体与氨基酸或肽链上含有的羧基发生酰胺化反应，形成二肽键产物；NHS与生成的羧基活化剂发生互解反应，再生EDC。
整个反应过程中EDC和NHS起着催化剂的作用，通过生成活性中间体，将生物大分子上的羧基与胺基特异性地连接起来。
三、edc nhs酰胺化反应应用范围1. 蛋白质偶联：edc nhs酰胺化反应可用于将某种蛋白质偶联到另一种蛋白质或固相载体上，用于制备免疫原、抗原、酶联免疫分析试剂盒等生物试剂。
2. 基因工程：该反应可应用于基因工程研究中，制备融合蛋白、构建基因库等。
3. 药物载体：利用edc nhs酰胺化反应，可以将药物载体与药物分子进行偶联，制备靶向药物输送系统。
4. 生物传感器：该反应可用于制备生物传感器，将生物识别分子或酶等部位特异性高的固定在传感器表面，用于病原检测、药物筛选等领域。
四、edc nhs酰胺化反应的优缺点1. 优点：a. 特异性：该反应可实现对生物大分子上特定残基的偶联，实现对生物分子的精准修饰；b. 可逆性：反应产物O-acylisourea中间体不稳定，易发生水解反应，避免了固相载体与非特异性偶联的问题；c. 高效性：反应条件温和，在中性条件下即可进行。
如何用碳二亚胺法将半抗原偶联到蛋白上
如何用碳二亚胺法将半抗原偶联到【摘要】用碳二亚胺（EDC）法将14位羟基修饰的雷公藤内酯醇(TP)和不同的蛋白载体（阳离子化牛血清白蛋白、鸡卵清蛋白）偶联合成TP的人工免疫抗原和检测抗原，紫外光谱鉴定偶联效果，计算偶联率。
利用免疫抗原免疫小鼠，制备小鼠多克隆抗体，用检测抗原分析血清抗体效价，利用抗原竞争ELISA分析抗体特异性，为进一步研究TP的分子作用机理以及制备TP的单克隆抗体奠定基础。
【关键词】雷公藤内酯醇；14位羟基修饰；人工抗原；多克隆抗体雷公藤内酯醇（triptolide，TP）分子式C20H24O6，分子结构如图1，相对分子质量360.41，为二萜类三环氧内酯化合物，是从植物雷公藤（Tripterygium Wilfordii Hook.f.）中提取的有效成分里活性最强的部分，具有消炎散结、清热解毒、抗菌、免疫抑制以及抗生育等功效。
长期以来，TP作为临床上公认的免疫抑制剂，主要用于各种自身免疫性疾病，如类风湿性关节炎以及器官移植排斥反应的治疗。
近年来研究发现，该药对多种肿瘤细胞有诱导凋亡的作用，与化疗药物联合应用能协同杀伤肿瘤细胞或逆转肿瘤耐药，说明它具有抗肿瘤效果，因此在肿瘤治疗方面的应用也日益受到人们的关注。
除此以外，它还对细胞发育增殖、细胞周期等有调控作用。
近年来，国内外对TP具有如此广泛作用的分子机理产生了越来越浓厚的兴趣，从多个不同的角度进行了研究。
但是，由于缺少方便快捷的TP检测手段，长期以来对TP直接作用位点的研究一直十分困难，对TP作用的靶蛋白和作用途径知之甚少。
细胞免疫化学是追踪分子在细胞内作用过程的有力工具，如果能够得到TP的抗体，就为利用细胞免疫化学研究TP的作用靶点和在细胞内的定位等提供了分子探针，为最终研究TP作用机制和寻找其靶蛋白提供了可能。
作为小分子半抗原，TP需要和大分子蛋白载体偶联才能成为能够诱导产生抗体的免疫原。
为了不影响小分子的生物活性，提高偶联效率，我们需要选择合适的反应基团。
蛋白互作验证方法
蛋白互作验证方法蛋白质互作验证方法通常是使用实验室技术来验证蛋白质及其相互作用之间的物理关系。
一些常见的实验室技术包括免疫沉淀、荧光免疫沉淀、蛋白质结合印迹（PLI）、蛋白质交互体外可溶性实验、实验测序及免疫荧光等。
1、免疫沉淀：免疫沉淀是利用抗原特异性的抗体介导一种特异性的相互作用来确定蛋白质相互作用的一种实验方法。
将抗体与抗原物（如原核及真核生物细胞中的蛋白质）结合形成免疫复合物，然后用能聚集該复合物并最终形成沉淀的抗体或其他物质，以查看抗原的存在。
2、荧光免疫沉淀：荧光免疫沉淀是一种可以直接检测用荧光素标记的抗体与抗原前体蛋白之间相互作用的实验方法。
合成荧光素标记的抗体，在可溶性状态下与含有抗原残基的蛋白质偶联，然后在能够聚集荧光素标记的抗体的液体中，检测其聚集的荧光强度。
3、蛋白质结合印迹（PLI）：蛋白质结合印迹（PLI）是一种用来观察抗原蛋白与特异性抗体之间相互作用情况的技术。
该技术包括双向结合印迹和单向结合印迹。
在双维度结合印迹中，抗原蛋白以及所检测到的特异性抗体（如抗体IgG）都是吸附在特定底物表面上，在具有特定pH和电荷条件环境下相互作用，判断是否发生了蛋白质与抗体的特异性结合。
在单维度结合印迹中，抗原蛋白是采用玻片表面吸附的方法确定的，而特异性抗体是以流体方式混合进去，并检测抗原蛋白与抗体之间的特异性结合。
4、質譜：質譜是一种常用的用于检测相互作用的实验室技术，可以用于衡量蛋白质家族和其他分子的结构性和功能性差异。
它可以用来观察蛋白质与其他大分子的相互作用，包括糖蛋白、核酸、酶、细胞因子及定量分析其相互作用的程度。
質譜的一般原理是通过分析实验材料静态状态及动态状态的“标签”，从而得出相应的结论。
5、实验测序及免疫荧光：实验测序及免疫荧光是一种用于检测蛋白互作及其相互影响的方法，细胞样本被染上荧光抗体，实验测序及免疫荧光分析可以用来直接观测被检测蛋白的表达和空间分布信息。
甲醛法klh蛋白偶联
甲醛法klh蛋白偶联
甲醛法KLH蛋白偶联是一种常用的方法，用于将甲醛与KLH蛋白结合，以产生高度免疫原性的复合物。
下面将详细介绍该方法的步骤和应用。
步骤：
1. 准备KLH蛋白和甲醛溶液。
KLH蛋白是一种常用的蛋白质载体，可用于增强抗原的免疫原性。
甲醛是一种交联剂，可用于将KLH蛋白与其他分子结合。
2. 将KLH蛋白溶液与甲醛溶液混合。
一般情况下，KLH蛋白和甲醛的比例为1:1至1:10，可以根据具体实验要求进行调整。
3. 在混合液中加入缓冲液，以调整pH值和离子浓度，保持适宜的反应条件。
4. 混合液中的KLH蛋白和甲醛发生交联反应，形成甲醛法KLH 蛋白偶联物。
反应时间一般为数小时至数天，具体时间也可根据实验要求进行调整。
5. 反应结束后，通过透析或其他方法去除未反应的甲醛和其他杂质，得到纯化的甲醛法KLH蛋白偶联物。
应用：
1. 免疫学研究：甲醛法KLH蛋白偶联物可用作免疫原，用于动物免疫实验，如制备抗体、研究免疫应答等。
2. 抗原制备：甲醛法KLH蛋白偶联物可用于制备特定抗原，用于检测和诊断相关疾病，如肿瘤标志物的检测等。
3. 药物研发：甲醛法KLH蛋白偶联物可用于药物研发中的免疫毒性评估，帮助评估药物对免疫系统的影响。
4. 免疫治疗：甲醛法KLH蛋白偶联物可用于免疫治疗，如癌症免疫治疗中的肿瘤疫苗制备等。
总结：
甲醛法KLH蛋白偶联是一种常用的方法，通过将甲醛与KLH蛋白结合，产生高度免疫原性的复合物。
该方法在免疫学研究、抗原制备、药物研发和免疫治疗等领域具有广泛的应用前景。
g蛋白偶联受体介导的信号通路
g蛋白偶联受体介导的信号通路
蛋白偶联受体（GPCR）是主要信号通路中一类重要的靶点，它们是早期生物中大量流行的受体。
蛋白偶联受体是由单细胞蛋白组成的大型多肽结构，可以在细胞外识别和结合抗原，以及在细胞内触发相关的信号通路。
蛋白偶联受体介导的信号通路涉及建立细胞内的细胞信号网络，将外部信号转化为细胞行为的变化。
在其中，当抗原相互作用时，免疫反应就会开始。
当抗原结合到蛋白偶联受体上时，受体就会结合信号分子，例如G蛋白，GTP或cAMP等，从而为后续信号转导建立起初始条件。
随后，G蛋白与GTP结合时，会引起蛋白偶联受体的激活，并且有一系列的引起后续信号的反应，其中最重要的是蛋白激酶参与信号通路的调节，它能够激活或抑制下游底物的合成和功能，这一反应将有助于细胞表面的魔窟或细胞间的通信。
不同蛋白偶联受体介导的信号通路和相应的激活可以促进许多非特定的细胞功能，如细胞增殖、迁移、凋亡、膜融合和细胞胞浆分离这些。
蛋白偶联受体将不同的抗原结合到细胞内信号转导的中心，启动一系列的蛋白磷酸化作用，从而促进相关信号通路的活动，从而影响细胞的功能。
因此，蛋白偶联受体介导的信号通路是细胞和组织表型的基础框架，是不可或缺的，此外，失调的信号激活也是许多疾病的根源。
因此，蛋白偶联受体是有药性抗原设计的重要靶点，多种新的抗疾病药物发现方式的基础之一。
生物偶联技术原理与应用
生物偶联技术原理与应用一、偶联技术原理偶联技术是指在生物体系中将两个或多个分子连接起来的方法。
在生物学领域，偶联技术常用于将一个生物分子（称为偶联物）与另一个目标分子（称为底物）连接起来，以实现特定的功能或研究目的。
二、抗体偶联抗体偶联是指将抗体与另一种分子连接起来，形成偶联抗体。
这种偶联抗体可以用于诊断或治疗，例如免疫疗法、药物传递和放射免疫显像等。
在抗体偶联过程中，要确保抗体的活性和特异性不受影响，同时保证连接的分子与目标分子有较高的亲和性。
三、核酸偶联核酸偶联是指将核酸（如DNA或RNA）与另一个分子连接起来。
这种偶联的核酸可以用于基因诊断、基因治疗和核酸疫苗等领域。
在核酸偶联过程中，要保证核酸的稳定性和活性，同时选择适当的连接方法以保证偶联物的功能和安全性。
四、酶偶联酶偶联是指将酶与另一个分子连接起来，形成偶联酶。
这种偶联酶可以用于生物催化反应和生物传感器等领域。
在酶偶联过程中，要选择适当的酶和连接分子，以保证偶联酶的活性和稳定性。
五、荧光标记偶联荧光标记偶联是指将荧光物质与另一个分子连接起来，形成荧光标记物。
这种荧光标记物可以用于生物成像、生物传感和免疫分析等领域。
在荧光标记偶联过程中，要选择适当的荧光物质和连接方法，以保证荧光标记物的稳定性和灵敏度。
六、放射性标记偶联放射性标记偶联是指将放射性同位素与另一个分子连接起来，形成放射性标记物。
这种放射性标记物可以用于放射免疫分析、放射显像和放射治疗等领域。
在放射性标记偶联过程中，要选择适当的放射性同位素和连接方法，以保证放射性标记物的安全性和有效性。
七、免疫偶联技术免疫偶联技术是指利用免疫反应原理将两个不同的分子连接起来的方法。
这种技术可以用于免疫分析、免疫疗法和疫苗研发等领域。
在免疫偶联技术中，要选择适当的抗体、抗原和连接方法，以保证连接物的特异性和活性。
八、生物传感器偶联生物传感器偶联是指将生物分子与传感器材料连接起来，形成生物传感器。
半抗原与蛋白质偶联技术
纯度鉴定 利用吸附与分配层析和电泳技术可鉴定人工抗原的偶联的纯度。如果电泳图谱上只出现一条电泳带，则表明人工抗原达到电泳纯，否则说明人工抗原中含有未偶联的物质。
利用电泳技术鉴定人工抗原偶联的纯度
偶联比的测定
分光光度法 如果半抗原的紫外最大吸收大于220nm(蛋白质在220nm以下会产生肽的强紫外吸收，如果半抗原的紫外最大吸收少于220nm，则与蛋白质肽的吸收发生重叠)，则可根据蛋白质及其半抗原特定的吸收峰的光密度值和各自的摩尔消光系数，计算出结合到每个蛋白质分子上的半抗原分子数
3
人工抗原
4
如：人工结合抗原、人工合成抗原、
5
基因工程抗原
6
常见的天然抗原-细菌
链球菌 痢疾杆菌 霍乱弧菌 伤寒杆菌
常见的天然抗原-病毒
狂犬病病毒 腺病毒 口蹄疫病毒 流感病毒
常见的其他天然抗原
真菌 白色念珠菌 (1,000X oil) 疟原虫
01
异种动物血清
02
异嗜性抗原
03
血型抗原
研究发现各种载体的分子量不论是否接近，最佳结合比都不尽相同，并建议为了取得最佳免疫效果，应逐个确定各种载体的最佳结合比。
影响人工抗原质量的因素
有研究者认为，一定长度的手臂的介入，有助于半抗原暴露在外面，利于所产生抗体专一性的增强．但也有一些研究者发现，手臂结构对免疫检测经常有不利的影响，有时产生的抗体对手臂结构亲和力特别强，对待测小分子亲和力却很弱，因此造成对特异性抗体检测的干扰。
抗原性:
抗原的性质
抗原（按照免疫原性及免疫反应性）分类
01
完全抗原 : 既有免疫原性又有抗原性的物质，如多数蛋白质分子。 半抗原:又称不完全抗原，单独存在时只具有抗原性而无免疫原性的物质，如二硝基酚、青霉素。
protein a 耦联的微球
protein a 耦联的微球
蛋白质A耦联的微球是一种具有特定结构和功能的生物材料，其制备方法包括以下几个步骤：
1. 选择合适的蛋白质A：蛋白质A是一种常见的免疫球蛋白，具有与IgG 结合的能力。
在制备蛋白质A耦联的微球时，需要选择具有高亲和力和高特异性的蛋白质A。
2. 制备微球：采用物理或化学方法制备微球，微球的大小和形状可以根据需要进行调节。
常用的制备方法包括乳化法、溶剂挥发法、喷雾干燥法等。
3. 活化微球表面：通过物理或化学方法活化微球表面，使其具有与蛋白质A结合的能力。
常用的活化方法包括氧化法、辐射法、化学偶联法等。
4. 耦联蛋白质A：将活化后的微球与蛋白质A进行耦联，使蛋白质A与微球表面结合。
常用的耦联方法包括共价耦联、非共价耦联等。
5. 纯化和干燥：对耦联后的蛋白质A耦联的微球进行纯化和干燥，去除未结合的蛋白质A和其他杂质。
蛋白质A耦联的微球在生物医学领域具有广泛的应用价值，如药物传递、组织工程、免疫检测等。
由于蛋白质A具有与IgG结合的能力，因此可以将药物或抗原与蛋白质A耦联，进而与微球表面结合。
这种药物传递系统可以实现对药物的精准控制和靶向传递，提高药物的疗效和降低副作用。
同时，蛋白质A 耦联的微球还可以用于免疫检测和组织工程等领域，为生物医学研究和临床应用提供新的工具和手段。
环丙沙星人工抗原的合成与鉴定(英文)
环丙沙星人工抗原的合成与鉴定(英文)
周玉;李岩松;王哲;谭建华;柳增善
【期刊名称】《中国兽医学报》
【年(卷),期】2006(26)2
【摘要】采用碳二亚胺法将半抗原环丙沙星与卵清蛋白和牛血清白蛋白进行偶联。
采用非变性凝胶电泳法和紫外分光光度法对偶联物中环丙沙星与载体蛋白的分子结合比进行分析。
紫外分光光度法表明,环丙沙星与卵清蛋白和牛血清白蛋白的分子
结合比分别为6∶1和13∶1。
非变性凝胶电泳显示,即使只有6个环丙沙星分子与载体蛋白偶联,偶联物在凝胶中的迁移轨迹与载体蛋白和偶联剂处理的载体蛋白对
照样品均有明显不同。
结果表明,非变性凝胶电泳法和紫外分光光度法可用于环丙
沙星与卵清蛋白和牛血清白蛋白分子结合比的定性分析和定量分析。
【总页数】4页(P200-203)
【关键词】环丙沙星;半抗原;载体蛋白;分子结合比;非变性凝胶电泳
【作者】周玉;李岩松;王哲;谭建华;柳增善
【作者单位】吉林大学畜牧兽医学院;军事医学科学院军事兽医研究所
【正文语种】中文
【中图分类】S852.43
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抗原与蛋白偶联方法常用的半抗原与蛋白偶联方法EDAC：EDC是一种羧基和氨基反应零长度交联剂。
EDC和与羧基反应形成氨基活化的O酰基异脲中间体，他可以迅速与氨基反应形成酰胺键，释放异脲副产物。
该媒介在水中不稳定，因此两步共轭反应依赖N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)稳定结构。
和氨基失败的反应导致媒介水解，羧基再生，释放N 代尿素。
副反应形成N酰基脲，这通常限制羧基定位蛋白的疏水区。
EDC用于偶联半抗原到载体蛋白原料：1.载体蛋白：2mg牛血清白蛋白BSA，卵白蛋白OV A或血蓝蛋白Keyhole limpet hemocyanin KLH2.偶联缓冲液：0.1M MES，pH4.5-53.EDC：10mg4.Hapten：1-2mg5.脱盐柱或凝胶过滤柱5-6KD阻隔。
操作步骤：1.平衡EDC到室温，加入2mg的BSA、OVA或KLH到200ul偶联缓冲液，如果用热电的载体蛋白用无菌水溶解。
2.溶解2mg多肽或半抗原到500ul偶联缓冲液加入200ul载体蛋白中。
3.对BSA或OVA结合，溶解10mg EDC到1ml超纯水立即加100ul(1mg EDC)该溶液到载体-多肽溶液中。
对KLH结合溶解10mg EDC到1ml超纯水立即加50ul(0.5mgEDC)该溶液到载体-多肽溶液中，如果发生沉淀进一步减少EDC用量。
4.室温反应2小时。
用脱盐柱纯化偶联蛋白，如果存储免疫原数天，无菌过滤储存在无菌容器中4或-20度保存。
用EDC和NHS或Sulfo-NHS两步法偶联偶联蛋白用EDC和Sulfo-NHS活化反应在pH4.5-7.2有效，然而NHS激活或Sulfo-NHS激活的分子具有伯胺在pH7-8时有效。
最好的结果是最初第一步反应在MES缓冲液中(或其他无氨基无羧基缓冲液pH5-6)，接着用磷酸盐缓冲液提高pH7.2-7.5(或其他无氨基无羧基缓冲液)立即与含氨基分子反应。
为了淬灭第一个反应用2巯基乙醇或其他可以容易去除的试剂，用脱盐柱换液。
原料：1.活化缓冲液：0.1M MES，0.5M NaCl，pH6.02.结合缓冲液：3. 24.蛋白1：准备溶解到活化缓冲液中1mg/ml。
5.蛋白2：准备溶解到结合缓冲液中6.NHS或Sulfo-NHS7.2-巯基乙醇8.脱盐柱9.羟胺-盐酸操作步骤：1.开盖前平衡EDC和NHS到室温。
2.加0.4mg EDC(2mM)和0.6mg NHS或1.1mg Sulfo-NHS(5mM)到1ml蛋白1溶液中室温反应15min。
3.加1.4ul的2-巯基乙醇(终浓度20mM)淬灭EDC。
4.可选步骤：用PBS平衡的脱盐柱从超量试剂和灭活的交联剂中分离蛋白。
5.按相同摩尔比加蛋白2到活化蛋白1，室温反应2小时。
6.淬灭反应加入羟胺到终浓度10mM，该方法水解蛋白1上未反应的NHS生成异羟肟酸。
其他淬灭方法包括加20-50mM Tris，赖氨酸，甘氨酸或乙醇胺，然而这些伯胺包含修饰蛋白1的化合物。
7.通过脱盐柱去除多余的淬灭试剂。
（一）分子中含有羧基或可羧化的半抗原的偶联）1、混合酸酐法，也称氯甲酸异丁酯法（isobutyl chloroformate method）偶联时，半抗原分子中的羧基可与氯甲酸异丁酯在有机溶剂中形成混合酸酐(mixed acid anhydride),然后与蛋白分子中的氨基形成肽键。
氨甲喋呤（MIT）与β-半乳糖苷酶偶联的混合酐法(1)5．8mg MIT用0.1ml二甲基甲酰胺溶解，冷却至10度，加2ul氯甲酸异丁酯，10度搅拌反应30分钟。
(2)1.5mg酶用2ml 50 m mol/L Na2CO3溶解。
(3)10度反应4小时（必要时加NaOH,以维持溶液的pH为9.0，q然后4度过夜。
(4)过sephadex G-25层析柱，柱用含NaCl 100m mol/L、MgCl2 10 m mol/L、2-巯基乙醇10 m mol/L的50m mol/L Tris-醋酸缓冲液(pH7.5)平衡和洗脱，合并含酶的洗脱管内液体，进一步纯化后，保存于含BSA 0.1％（w/v）、NaN3 0.02%(w/v)的缓冲液中。
2、碳化二亚胺法制备3,3`,5-三碘甲腺氨酸-血蓝蛋白免疫原的操作步骤(1) 取EDC 100mg , 用pH8.0的10 m mol/L PBS液2.5ml使之充分溶解（I液）(2) 取3，3`,5-三碘甲腺原氨酸25mg , 用0.2mol/L NaOH 溶液2ml 溶解(II液)(3) 取血蓝蛋白(lemocyanin) 25mg, 溶于10mmol/L PBS （pH8.0）液中（III液）(4) 将II液与III液混合，在磁力搅拌下逐滴加入I液（余下0.5ml）(5) 室温下避光搅拌1小时，逐滴加入余下的I液(6) 4度搅拌12小时(7) 静置10小时（4度）(8)有蒸馏水使之充分透析（约48小时），得免疫原。
3、孕酮与与β-半乳糖苷酶偶联的N-羟琥珀酰亚胺酯法(1) 用二垩烷(dioxane)溶解孕酮-11-半琥珀酸酯，配成浓度为100m mol/L的溶液。
(2) 加羟琥珀酰亚胺(N-hydroxysuccinimide) 100 m mol/L 和DCC（二环已基碳化二亚胺），200 m mol/L, 4度反应16小时。
(3) 用簿层扫描方法纯化(氯仿：水=9：1)(4) 按孕酮/酶摩尔浓度比约为10的比例，将上述溶液加入到酶液（用pH7.4，浓度50 m mol/L的磷酸缓冲液溶解）中。
（二）含有氨基或可还原硝基半抗原的偶联1、芳香胺类半抗原与蛋白质重氮化偶联的操作步骤(1) 用0.1 mol/L HCl溶液配制4 m mol/L浓度的半抗原。
(2) 滴加1％NaNO2(过量)，4度持续搅拌。
NaNO2的加入量可用淀粉-碘化物试纸或在白色磁砖上加1％淀粉和50m mol/L KI进行监控。
游离亚硝酸可将氧化物氧化成碘，碘再与淀粉反应变成蓝黑色。
(3) 溶液变成蓝黑色后，继续反应15分钟。
(4) 用pH9.0、浓度为200m mol/L的硼酸或碳酸缓冲液溶解蛋白。
(5) 边搅拌，边加入重氮化的半抗原（防止局部发生酸过量现象），调节pH到9.5。
(6) 冰箱中搅拌反应2小时，不断调节pH到9.0。
(7) 用PBS透析2天(8) -20度保存（浓度为20mg/mL）双功能的酰亚胺酯(imidate esters)可以氨基反应，形成脒。
例如：用二甲基已二酰亚胺酯(dimethyladipimide)将去甲基三正喋呤(desmethylmortriptyline)与β-半乳糖苷酶偶联。
2、、应用双功能酰亚胺酯（imidate esters）制备去甲基三正喋呤-与β-半乳糖苷酶标记特的操作步骤(1) 用含5％（W/V）N-乙基吗啉的无水甲醇0.4ml,在室温下溶解570ug去甲基三正喋呤和488ug 二甲基已二酰亚胺酯(dimethyladipimide)(A液)(2) 取与β-半乳糖苷酶100 ug, 溶于pH9.9的100 m mol/L碳酸缓冲液（含MgCl2 10m mol/L,2-巯基乙醇10 m mol/L 0.1ml(B液)(3) 将A液倒入B液。
(4)20度反应90分钟后，加含NaCl 100 m mol/L, MgCl2 10 m mol/L和2-巯基乙醇10 m mol/L、pH7.5的Tris-醋酸缓冲液(50m mol/L) 1ml, 终止反应。
(5)过sephadex G-25, 去除小分子物质，得酶标记物（约75％的酶与半抗原结合，但用三正喋呤代替去甲三正喋呤(demethylmortriptyline )进行偶联，则只有15％的酶与之结合。
（三）含巯基半抗原的偶联可用马来酰亚胺方法与蛋白偶联。
此外，将载体蛋白用溴乙酰胺(bromoacetamide)激活。
或将载体蛋白与半抗原在pH4.0的醋酸缓冲液中，通过过氧化氢的作用形成二硫键，也可以将半抗原连接到蛋白质分子上。
（四）含羟基的半抗原偶联醇类羟基通过形成半琥珀酸酯转化为羧基的操作步骤1、 15g 2,2,2-三氯乙醇（2,2,2-trichloroethanol）,12g 琥珀酸酐(succinic anhydride)和8.7ml 三乙基胺(triethylamime)用100 ml乙酰乙酯溶解。
2、加热回流1小时。
3、减压蒸馏去溶剂，,残余物用5% NaHCO3水溶液溶解。
4、用乙醚洗涤两次，然后用H2SO4进行s酸化（pH到2.0）.5、用水洗涤固形物（为三氯乙基半琥珀酸酯）两次，用氯仿-已烷使其结晶（产量约75％，熔点88-89度）6、取2.5g 半琥珀酸酯溶于6.5ml 亚硫酰氯(thionyl chloride)中，65度加热30分钟。
7、减压蒸发，干燥1小时（高度真空条件下）。
8、将上述产生（2，2，2-三氯忆基琥珀酰氯）溶于15ml N,N-二甲基-乙酸乙酰胺(N,N-dimethylethylacetamide)中，室温搅拌反应2小时。
9、 65度真空蒸发后，用异丙醇使结晶析出来（得盐酸化的结晶---5`-酯约84％，熔点160度）。
10、用溶于二甲基甲酰胺中的锌和醋酸解离三氯乙酯，得f半抗原-半琥珀酸酯，这样引和的羧基可与蛋白质偶联（如用碳化二亚胺化）。
半抗原用NaIO4氧化其中的糖苷醇后再与蛋白质偶联的操作步骤1、 20mg 腺苷溶于1ml 100m mol/L NaIO4溶液中，4度避光反应30分钟。
2、加1滴乙二醇(得A液)3、将A液加入到β-半乳糖苷酶液（20mg/ml,用150m mol/L NaCl,10m mol/L MgCl2水溶液溶解，用3％K2CO3调节pH至9.0）中4、 4度反应2小时，期间不断调节pH9.05、加入临时配制的50 mg/ml NaBO4溶液，用量为反应体积的1/10。
4度反应过夜。
6、用含有MgCl2 10m mol/L,2-巯基乙醇10 m mol/L、NaCl 100 m mol/L的50 m mol/L磷酸缓冲液(pH7.4)透析(更换透析液数次)（五）含酮基或酮基半抗原的偶联是将酮基经羟胺类化合物处理变成肟类化合物，再进一步将肟类化合物中的羟基，衍变成羧基化合物，再进一步进行含羧基半抗原的偶联操作。
这类羟胺类化合物主要有：氨氧乙酸aminoxy acetic acid 或羧甲氧胺carboxymethoxyl amine 或者盐酸羟胺酮基的类固醇分子中引入羧基的操作步骤1、在200ml 乙醇中，加入O-(羧甲基)羟胺（O-(carboxyl)hydroxylamine）和酮基半抗原，使其浓度分别为10m mol/L 和4m mol/L2、加热回流90分钟3、旋转蒸发，减少容积，然后加水至40ml，用乙醚抽提4、用水洗涤乙醚抽提物，用Na2SO4干燥成白色粉末。