抗原与蛋白偶联方法

抗原与蛋白偶联方法
常用的半抗原与蛋白偶联方法
EDAC：EDC是一种羧基和氨基反应零长度交联剂。

EDC和与羧基反应形成氨基活化的O酰基异脲中间体，他可以迅速与氨基反应形成酰胺键，释放异脲副产物。

该媒介在水中不稳定，因此两步共轭反应依赖N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)稳定结构。

和氨基失败的反应导致媒介水解，羧基再生，释放N 代尿素。

副反应形成N酰基脲，这通常限制羧基定位蛋白的疏水区。

EDC用于偶联半抗原到载体蛋白
原料：
1.载体蛋白：2mg牛血清白蛋白BSA，卵白蛋白OV A或血蓝蛋白Keyhole limpet hemocyanin KLH
2.偶联缓冲液：0.1M MES，pH4.5-5
3.EDC：10mg
4.Hapten：1-2mg
5.脱盐柱或凝胶过滤柱5-6KD阻隔。

操作步骤：
1.平衡EDC到室温，加入2mg的BSA、OVA或KLH到200ul偶联缓冲液，如果用热电的载体蛋白用
无菌水溶解。

2.溶解2mg多肽或半抗原到500ul偶联缓冲液加入200ul载体蛋白中。

3.对BSA或OVA结合，溶解10mg EDC到1ml超纯水立即加100ul(1mg EDC)该溶液到载体-多肽溶液
中。

对KLH结合溶解10mg EDC到1ml超纯水立即加50ul(0.5mgEDC)该溶液到载体-多肽溶液中，如果发生沉淀进一步减少EDC用量。

4.室温反应2小时。

用脱盐柱纯化偶联蛋白，如果存储免疫原数天，无菌过滤储存在无菌容器中4
或-20度保存。

用EDC和NHS或Sulfo-NHS两步法偶联偶联蛋白
用EDC和Sulfo-NHS活化反应在pH4.5-7.2有效，然而NHS激活或Sulfo-NHS激活的分子具有伯胺在pH7-8时有效。

最好的结果是最初第一步反应在MES缓冲液中(或其他无氨基无羧基缓冲液pH5-6)，接着用磷酸盐缓冲液提高pH7.2-7.5(或其他无氨基无羧基缓冲液)立即与含氨基分子反应。

为了淬灭第一个反应用2巯基乙醇或其他可以容易去除的试剂，用脱盐柱换液。

原料：
1.活化缓冲液：0.1M MES，0.5M NaCl，pH6.0
2.结合缓冲液：
3. 2
4.蛋白1：准备溶解到活化缓冲液中1mg/ml。

5.蛋白2：准备溶解到结合缓冲液中
6.NHS或Sulfo-NHS
7.2-巯基乙醇
8.脱盐柱
9.羟胺-盐酸
操作步骤：
1.开盖前平衡EDC和NHS到室温。

2.加0.4mg EDC(2mM)和0.6mg NHS或1.1mg Sulfo-NHS(5mM)到1ml蛋白1溶液中室温反应15min。

3.加1.4ul的2-巯基乙醇(终浓度20mM)淬灭EDC。

4.可选步骤：用PBS平衡的脱盐柱从超量试剂和灭活的交联剂中分离蛋白。

5.按相同摩尔比加蛋白2到活化蛋白1，室温反应2小时。

6.淬灭反应加入羟胺到终浓度10mM，该方法水解蛋白1上未反应的NHS生成异羟肟酸。

其他淬灭
方法包括加20-50mM Tris，赖氨酸，甘氨酸或乙醇胺，然而这些伯胺包含修饰蛋白1的化合物。

7.通过脱盐柱去除多余的淬灭试剂。

（一）分子中含有羧基或可羧化的半抗原的偶联）
1、混合酸酐法，也称氯甲酸异丁酯法（isobutyl chloroformate method）
偶联时，半抗原分子中的羧基可与氯甲酸异丁酯在有机溶剂中形成混合酸酐(mixed acid anhydride),然后与蛋白分子中的氨基形成肽键。

氨甲喋呤（MIT）与β-半乳糖苷酶偶联的混合酐法
(1)5．8mg MIT用0.1ml二甲基甲酰胺溶解，冷却至10度，加2ul氯甲酸异丁酯，10度搅拌反应30分钟。

(2)1.5mg酶用2ml 50 m mol/L Na2CO3溶解。

(3)10度反应4小时（必要时加NaOH,以维持溶液的pH为9.0，q然后4度过夜。

(4)过sephadex G-25层析柱，柱用含NaCl 100m mol/L、MgCl2 10 m mol/L、2-巯基乙醇10 m mol/L的50m mol/L Tris-醋酸缓冲液(pH7.5)平衡和洗脱，合并含酶的洗脱管内液体，进一步纯化后，保存于含BSA 0.1％（w/v）、NaN3 0.02%(w/v)的缓冲液中。

2、碳化二亚胺法制备3,3`,5-三碘甲腺氨酸-血蓝蛋白免疫原的操作步骤
(1) 取EDC 100mg , 用pH8.0的10 m mol/L PBS液2.5ml使之充分溶解（I液）
(2) 取3，3`,5-三碘甲腺原氨酸25mg , 用0.2mol/L NaOH 溶液2ml 溶解(II液)
(3) 取血蓝蛋白(lemocyanin) 25mg, 溶于10mmol/L PBS （pH8.0）液中（III液）
(4) 将II液与III液混合，在磁力搅拌下逐滴加入I液（余下0.5ml）
(5) 室温下避光搅拌1小时，逐滴加入余下的I液
(6) 4度搅拌12小时
(7) 静置10小时（4度）
(8)有蒸馏水使之充分透析（约48小时），得免疫原。

3、孕酮与与β-半乳糖苷酶偶联的N-羟琥珀酰亚胺酯法
(1) 用二垩烷(dioxane)溶解孕酮-11-半琥珀酸酯，配成浓度为100m mol/L的溶液。

(2) 加羟琥珀酰亚胺(N-hydroxysuccinimide) 100 m mol/L 和DCC（二环已基碳化二亚胺），200 m mol/L, 4度反应16小时。

(3) 用簿层扫描方法纯化(氯仿：水=9：1)
(4) 按孕酮/酶摩尔浓度比约为10的比例，将上述溶液加入到酶液（用pH7.4，浓度50 m mol/L的磷酸缓冲液溶解）中。

（二）含有氨基或可还原硝基半抗原的偶联
1、芳香胺类半抗原与蛋白质重氮化偶联的操作步骤
(1) 用0.1 mol/L HCl溶液配制4 m mol/L浓度的半抗原。

(2) 滴加1％NaNO2(过量)，4度持续搅拌。

NaNO2的加入量可用淀粉-碘化物试纸或在白色磁砖上加1％淀粉和50m mol/L KI进行监控。

游离亚硝酸可将氧化物氧化成碘，碘再与淀粉反应变成蓝黑色。

(3) 溶液变成蓝黑色后，继续反应15分钟。

(4) 用pH9.0、浓度为200m mol/L的硼酸或碳酸缓冲液溶解蛋白。

(5) 边搅拌，边加入重氮化的半抗原（防止局部发生酸过量现象），调节pH到9.5。

(6) 冰箱中搅拌反应2小时，不断调节pH到9.0。

(7) 用PBS透析2天
(8) -20度保存（浓度为20mg/mL）
双功能的酰亚胺酯(imidate esters)可以氨基反应，形成脒。

例如：用二甲基已二酰亚胺酯(dimethyladipimide)将去甲基三正喋呤(desmethylmortriptyline)与β-半乳糖苷酶偶联。

2、、应用双功能酰亚胺酯（imidate esters）制备去甲基三正喋呤-与β-半乳糖苷酶标记特的操作步骤(1) 用含5％（W/V）N-乙基吗啉的无水甲醇0.4ml,在室温下溶解570ug去甲基三正喋呤和488ug 二甲基已二酰亚胺酯(dimethyladipimide)(A液)
(2) 取与β-半乳糖苷酶100 ug, 溶于pH9.9的100 m mol/L碳酸缓冲液（含MgCl2 10m mol/L,2-巯基乙醇10 m mol/L 0.1ml(B液)
(3) 将A液倒入B液。

(4)20度反应90分钟后，加含NaCl 100 m mol/L, MgCl2 10 m mol/L和2-巯基乙醇10 m mol/L、pH7.5的Tris-醋酸缓冲液(50m mol/L) 1ml, 终止反应。

(5)过sephadex G-25, 去除小分子物质，得酶标记物（约75％的酶与半抗原结合，但用三正喋呤代替去甲三正喋呤(demethylmortriptyline )进行偶联，则只有15％的酶与之结合。

（三）含巯基半抗原的偶联
可用马来酰亚胺方法与蛋白偶联。

此外，将载体蛋白用溴乙酰胺(bromoacetamide)激活。

或将载体蛋白与半抗原在pH4.0的醋酸缓冲液中，通过过氧化氢的作用形成二硫键，也可以将半抗原连接到蛋白质分子上。

（四）含羟基的半抗原偶联
醇类羟基通过形成半琥珀酸酯转化为羧基的操作步骤
1、 15g 2,2,2-三氯乙醇（2,2,2-trichloroethanol）,12g 琥珀酸酐(succinic anhydride)和8.7ml 三乙基胺(triethylamime)用100 ml乙酰乙酯溶解。

2、加热回流1小时。

3、减压蒸馏去溶剂，,残余物用5% NaHCO3水溶液溶解。

4、用乙醚洗涤两次，然后用H2SO4进行s酸化（pH到2.0）.
5、用水洗涤固形物（为三氯乙基半琥珀酸酯）两次，用氯仿-已烷使其结晶（产量约75％，熔点88-89度）
6、取2.5g 半琥珀酸酯溶于6.5ml 亚硫酰氯(thionyl chloride)中，65度加热30分钟。

7、减压蒸发，干燥1小时（高度真空条件下）。

8、将上述产生（2，2，2-三氯忆基琥珀酰氯）溶于15ml N,N-二甲基-乙酸乙酰胺(N,N-dimethylethylacetamide)中，室温搅拌反应2小时。

9、 65度真空蒸发后，用异丙醇使结晶析出来（得盐酸化的结晶---5`-酯约84％，熔点160度）。

10、用溶于二甲基甲酰胺中的锌和醋酸解离三氯乙酯，得f半抗原-半琥珀酸酯，这样引和的羧基可与蛋白质偶联（如用碳化二亚胺化）。

半抗原用NaIO4氧化其中的糖苷醇后再与蛋白质偶联的操作步骤
1、 20mg 腺苷溶于1ml 100m mol/L NaIO4溶液中，4度避光反应30分钟。

2、加1滴乙二醇(得A液)
3、将A液加入到β-半乳糖苷酶液（20mg/ml,用150m mol/L NaCl,10m mol/L MgCl2水溶液溶解，用3％K2CO3调节pH至9.0）中
4、 4度反应2小时，期间不断调节pH9.0
5、加入临时配制的50 mg/ml NaBO4溶液，用量为反应体积的1/10。

4度反应过夜。

6、用含有MgCl2 10m mol/L,2-巯基乙醇10 m mol/L、NaCl 100 m mol/L的50 m mol/L磷酸缓冲液(pH7.4)透析(更换透析液数次)
（五）含酮基或酮基半抗原的偶联
是将酮基经羟胺类化合物处理变成肟类化合物，再进一步将肟类化合物中的羟基，衍变成羧基化合物，再进一步进行含羧基半抗原的偶联操作。

这类羟胺类化合物主要有：氨氧乙酸aminoxy acetic acid 或羧甲氧胺carboxymethoxyl amine 或者盐酸羟胺
酮基的类固醇分子中引入羧基的操作步骤
1、在200ml 乙醇中，加入O-(羧甲基)羟胺（O-(carboxyl)hydroxylamine）和酮基半抗原，使其浓度分别为10m mol/L 和4m mol/L
2、加热回流90分钟
3、旋转蒸发，减少容积，然后加水至40ml，用乙醚抽提
4、用水洗涤乙醚抽提物，用Na2SO4干燥成白色粉末。

（六）、其他半抗原的偶联
虽含有游离基团，但因这些基团对于维其生物活性十分重要，因些不能直接用来与载体蛋白偶联。

制备雌二醇-6-肟的操作步骤
a、雌二醇二醋酸盐的制备
1、 1g雌二醇溶于14ml 吡啶及3.5ml 醋酐中
2、加热回流1小时，冷却后倾入冰水中。

3、收集白色晶体，得产物约1.1g（熔点126到127度）
b、雌二醇-6-酮-二醋酸盐的制备
4、雌二醇二醋酸盐 1.1g，滴加冰醋酸 3.8ml 溶解后加含0.93g CrO3的含水冰醋酸 6.35ml (H2O:Hac=0.75:5.6)
5、室温搅拌1小时，静置24小时
6、用水稀释，用乙醚提取4次
7、用蒸馏水洗2次
8、减压蒸馏，得结晶油状渣物。

9、用90度烘干20分钟，得粗制品约500mg
10、用11ml 无水乙醇溶解粗制品，再加1.1ml 冰醋酸及1.5g吉纳你特T试剂(Girad T)，回流1小时。

11、冷却后，用冰致冷的蒸馏水稀释，用2.5mol/LNaOH调节pH至6.0-6.2.
12、用乙醚抽提3次，弃去乙醚。

13、水层用浓盐酸酸化（盐酸终浓度为1mol/L).
14、室温静置2小时。

15、用乙醚抽提3次。

16、合并乙醚抽提液，用0.125mol/L碳酸钠溶液洗1次，用蒸馏水洗3次。

17、用无水硫酸钠脱水，蒸干。

18、加7ml 醋酐，回流20分钟。

19、冷却后倾入用冰致冷的蒸馏水中，然后过滤、干燥得产物约176mg (熔点为162-166度)
c、二醇-6-酮的制备
20、用5.5ml 20％的氢氧化钾-甲醇溶液(W/V)溶解雌二醇-6-酮-二醋酸盐（176mg）,在室温下于氮气中水解24小时。

21、加蒸馏水稀释，用乙醚抽提3次。

22、在乙醚提取液中无水硫酸钠进行脱水，蒸发干燥，得产物约60mg(熔点为278-282度)
d、雌二醇-6-肟的制备
23、取雌二醇-6-酮50mg ,盐酸羧甲基羧胺50mg,溶于20％含水甲醇(V/V)7ml 和1mol/L醋酸钠4ml 中，回流1.5小时。

24、减压、蒸馏、浓缩后，加蒸馏水20ml
25、用2 mol/L NaOH调节pH至8.5。

26、用醋酸乙酯抽提4次
27、水层用1 mol/L盐酸酸化至pH2.5。

28、用醋酸乙酯抽提4次
29、合并抽提液，蒸干，得产物约100mg(结晶熔点约186-188度)
其他半抗原如：青霉素、生物素、地高辛、荧光素等半抗原交联。

过碘酸钠氧化反应原理：将糖基氧化为醛基活化后用于连接含氨基配体。

酰阱反应
NHS EDC偶联法。