如何用碳二亚胺法将半抗原偶联到蛋白上

如何用碳二亚胺法将半抗原偶联到

【摘要】用碳二亚胺（EDC）法将14位羟基修饰的雷公藤内酯醇(TP)和不同的蛋白载体（阳离子化牛血清白蛋白、鸡卵清蛋白）偶联合成TP的人工免疫抗原和检测抗原，紫外光谱鉴定偶联效果，计算偶联率。利用免疫抗原免疫小鼠，制备小鼠多克隆抗体，用检测抗原分析血清抗体效价，利用抗原竞争ELISA分析抗体特异性，为进一步研究TP的分子作用机理以及制备TP的单克隆抗体奠定基础。

【关键词】雷公藤内酯醇；14位羟基修饰；人工抗原；多克隆抗体

雷公藤内酯醇（triptolide，TP）分子式C20H24O6，分子结构如图1，相对分子质量360.41，为二萜类三环氧内酯化合物，是从植物雷公藤（Tripterygium Wilfordii Hook.f.）中提取的有效成分里活性最强的部分，具有消炎散结、清热解毒、抗菌、免疫抑制以及抗生育等功效。长期以来，TP作为临床上公认的免疫抑制剂，主要用于各种自身免疫性疾病，如类风湿性关节炎以及器官移植排斥反应的治疗。近年来研究发现，该药对多种肿瘤细胞有诱导凋亡的作用，与化疗药物联合应用能协同杀伤肿瘤细胞或逆转肿瘤耐药，说明它具有抗肿瘤效果，因此在肿瘤治疗方面的应用也日益受到人们的关注。除此以外，它还对细胞发育增殖、细胞周期等有调控作用。近年来，国内外对TP具有如此广泛作用的分子机理产生了越来越浓厚的兴趣，从多个不同的角度进行了研究。但是，由于缺少方便快捷的TP检测手段，长期以来对TP直接作用位点的研究一直十分困难，对TP作用的靶蛋白和作用途径知之甚少。细胞免疫化学是追踪分子在细胞内作用过程的有力工具，如果能够得到TP的抗体，就为利用细胞免疫化学研究TP的作用靶点和在细胞内的定位等提供了分子探针，为最终研究TP作用机制和寻找其靶蛋白提供了可能。作为小分子半抗原，TP需要和大分子蛋白载体偶联才能成为能够诱导产生抗体的免疫原。为了不影响小分子的生物活性，提高偶联效率，我们需要选择合适的反应基团。已有的TP结构 活性研究显示，TP的不同生物效应依赖于不同的功能基团。研究证实，对于12，13位环氧进行开环反应所获得的稳定的衍生物雷公藤内酯三醇（triptriolide）会丧失免疫抑制和抗炎的生物活性。14位羟基是TP最容易被改造修饰的基团，研究表明，14位羟基被改造为水溶性的基团作为前药能极大改善小分子的水溶性，促进体内代谢，降低毒性，甚至能改善TP在体内的免疫抑制活性和抗肿瘤活性［1 2］。

综合考虑，TP的14位羟基是最合适的偶联基团。TP的水溶性不理想，且14位羟基不容易在温和条件下和蛋白载体反应，我们首先对14位羟基进行结构修饰，改造为水溶性的羧基，利用缩合反应偶联阳离子化牛血清白蛋白（cationized BSA，cBSA）和鸡卵清蛋白（OVA），合成TP的免疫抗原TP cBSA和检测抗原TP OVA。用免疫抗原免疫小鼠，顺利得到了TP的多抗。

1 实验部分

1.1 试剂和仪器

TP（购自SIGMA公司），cBSA（购自PIERCE公司），OVA，1 乙基 （3 二甲基氨

基丙基）碳二亚胺盐酸盐（EDC·HCl），福氏完全佐剂（FCA）和福氏不完全佐剂(FIA)，6～8周龄BALB/c小鼠（购自扬州大学比较医学中心）,Sephadex凝胶柱（购自PIERCE）。TP、OVA、1 乙基 （3 二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（EDC·HCl）、福氏完全佐剂（FCA）和福氏不完全佐剂（FIA）均购自Sigma公司，cBSA、Sephadex凝胶柱均购自PIERCE公司，6～8周龄BALB/c小鼠购自扬州大学比较医学中心。

岛津UV 2550紫外可见分光光度计，Eppendorf Centrifuge 5415R离心机，TECAN SAFIRE自动酶标仪。

1.2 TP 14位羟基的修饰以及修饰产物的质谱鉴定

将TP的14位羟基进行衍生化修饰，在弱碱性条件下和丁二酸酐进行酰化反应，反应式如图2所示，得到水溶性分子triptolide 14 succinate（mTP），用质谱鉴定反应产物。

1.3 TP人工抗原的制备

碳二亚胺（EDC）法偶联mTP与蛋白载体（以cBSA为例，OVA合成的方法类似）：

取5 mg mTP和2.5 mg cBSA溶解在250 μl TE buffer（pH 8.0）中，充分震荡使其溶解，再取EDC·HCl 79 mg充分溶解于250 μl TE buffer（pH 8.0）中。将mTP和cBSA的混合溶液边震荡边逐滴加入EDC溶液，在37 ℃摇床中反应2 h以上。先用Sephadex柱分离偶联产物和未结合的mTP小分子，再透析纯化，将0.5 ml 溶液在PBS中透析3 d，每天换液两次，每次换液200 ml。透析产物小剂量分装，于－20 ℃保存备用。

1.4 人工合成抗原的紫外鉴定

用紫外分光光度法对cBSA标准品、偶联产物和mTP进行紫外扫描，根据偶联产物最大吸收峰的位移判断是否偶联成功。

1.5 人工合成抗原偶联率的计算

紫外扫描结果显示，蛋白载体最大吸收峰的位置在280 nm，mTP最大吸收峰在261 nm，偶联产物这两个波长的紫外吸收强度包括了蛋白载体和mTP的贡献。人工合成抗原的摩尔偶联率CmTP/CBSA可由以下公式计算得出：

CmTP/CBSA=(A280×KBSA，261－A261×KBSA，280)/(A261×KmTP，280－A280×KmTP，261)

其中A280、A261分别为偶联产物在波长为280 nm和261 nm时的紫外吸光度，KBSA，280、KBSA，261、KmTP，280、KmTP，261分别对应BSA和mTP在波长为280 nm 和261 nm的摩尔消光系数［3］。

1.6 TP人工抗原多抗血清的制备及鉴定

初次免疫：将100 μg 人工抗原与等体积FCA乳化完全，皮下分点注射4只BALB/c小鼠；2次免疫：初次免疫后两周将100 μg 人工抗原与等体积FIA乳化完全，皮下分点注射BALB/c小鼠；3次免疫：两周后将150 μg 人工抗原皮下分点注射BALB/c小鼠；第3次免疫两周后，以200 μg人工抗原经腹腔加强免疫血清效价较高的小鼠。尾部采血分离抗血清，以制备的检测抗原OVA mTP包被ELISA板，采用间接ELISA法检测血清抗体的效价。为了验证血清中TP抗体的特异性反应，我们用偶联好的OVA mTP包被酶标板，再用不同浓度的TP、雷公藤内酯三醇（图3）和冬凌草甲素（oridonin）间接竞争ELISA法检测血清中抗体特异性。以TP为例，竞争ELISA方法如下：取OVA mTP于37 ℃，2 h 包被酶标板（每孔100 μl），10 %羊血清封闭后PBST洗3次，每孔加入50 μl TP，浓度分别为1、2、5、8、10、30、50 ng·μl－1和50 μl稀释的血清，混匀后37 ℃反应1 h，PBST 洗3次，加入酶标二抗37 ℃反应1 h，洗3次，每孔加显色液150 μl，反应15 min，2 mol·L －1硫酸终止反应后，用酶标仪测450 nm吸收值，每孔测4次，取平均值，建立竞争抑制曲线。

2 结果和讨论

2.1 mTP的质谱鉴定

mTP质谱如图4，相对分子质量为440和540的峰分别对应TP和mTP各自与溶剂吡啶形成的离子

图3 雷公藤内酯三醇结构

Fig 3 Triptriolide structure峰。虽然产物mTP中还含有一部分反应原料TP，但是TP无法与蛋白载体在EDC存在条件下进行缩合反应，因此这部分TP并不会对人工抗原的合成造成干扰，我们无需对mTP进行提纯以除去TP。

2.2 TP人工抗原的紫外鉴定和偶联率

阳离子化的牛血清白蛋白载体cBSA的氨基数量远多于羧基，一方面能够提高偶联效率，另一方面提高了BSA的等电点，使得蛋白在反应体系的pH下溶解度大大改善。偶联产物的紫外光谱见图5，偶联产物的最大吸收峰相比蛋白载体向左明显偏移，由280 nm到了269 nm左右，显示偶联成功。偶联产物在280 nm和261 nm的紫外吸光值分别是3.029和3.058，由公式可计算得出mTP和蛋白载体cBSA的摩尔比为65∶1，偶联效率较高。

2.3 多抗血清的效价和抗体特异性反应

第3次免疫两周后，用间接ELISA法测定小鼠血清抗体效价为1∶102 400，TP、雷公藤内酯三醇和冬凌草甲素的间接竞争ELISA实验表明，TP及其衍生物雷公藤内酯三醇均能产生竞争作用，而冬凌草甲素不显示竞争关系，证明血清中多抗能在很大程度上与TP及其衍生物雷公藤内酯三醇反应，而完全不能与同为二萜类化合物的冬凌草甲素结合。与TP相比，雷公藤内酯三醇仅仅是12，13位的环氧基团打开，其它结构完全一致，能被多抗识别是可以理解的，但从竞争曲线上看来，TP的竞争饱和吸光值要低于雷公藤内酯三醇，从一定程度上证明多抗与TP的结合能力强于雷公藤内酯三醇，提示多抗中存在着识别TP 12，