常用的半抗原与蛋白偶联方法简介

常用的半抗原与蛋白偶联方法简介

（一）分子中含有羧基或可羧化的半抗原的偶联）

1、混合酸酐法，也称氯甲酸异丁酯法（isobutyl chloroformate method）

偶联时，半抗原分子中的羧基可与氯甲酸异丁酯在有机溶剂中形成混合酸酐(mixed acid anhydride),然后与蛋白分子中的氨基形成肽键。

氨甲喋呤（MIT）与β-半乳糖苷酶偶联的混合酐法

1、5．8mg MIT用0.1ml二甲基甲酰胺溶解，冷却至10度，加2ul氯甲酸异丁酯，10度搅拌反应30分钟。

2、1.5mg酶用2ml 50 m mol/L Na2CO3溶解。

3、10度反应4小时（必要时加NaOH,以维持溶液的pH为9.0，q然后4度过夜。

4、过sephadex G-25层析柱，柱用含NaCl 100m mol/L、MgCl2 10 m mol/L、2-巯基乙醇10 m mol/L的50m mol/L Tris-醋酸缓冲液(pH7.5)平衡和洗脱，合并含酶的洗脱管内液体，进一步纯化后，保存于含BSA 0.1％（w/v）、NaN3 0.02%(w/v)的缓冲液中。

碳化二亚胺法制备3,3`,5-三碘甲腺氨酸-血蓝蛋白免疫原的操作步骤

1、取EDC 100mg , 用pH8.0的10 m mol/L PBS液2.5ml使之充分溶解（I液）

2、取3，3`,5-三碘甲腺原氨酸25mg , 用0.2mol/L NaOH 溶液2ml 溶解(II液)

3、取血蓝蛋白(lemocyanin) 25mg, 溶于10mmol/L PBS （pH8.0）液中（III液）

4、将II液与III液混合，在磁力搅拌下逐滴加入I液（余下0.5ml）

5、室温下避光搅拌1小时，逐滴加入余下的I液

6、 4度搅拌12小时

7、静置10小时（4度）

8、有蒸馏水使之充分透析（约48小时），得免疫原。

孕酮与与β-半乳糖苷酶偶联的N-羟琥珀酰亚胺酯法

1、用二垩烷(dioxane)溶解孕酮-11-半琥珀酸酯，配成浓度为100m mol/L的溶液。

2、加羟琥珀酰亚胺(N-hydroxysuccinimide) 100 m mol/L 和DCC（二环已基碳化二亚胺），200 m mol/L, 4度反应16小时。

3、用簿层扫描方法纯化(氯仿：水=9：1)

4、按孕酮/酶摩尔浓度比约为10的比例，将上述溶液加入到酶液（用pH7.4，浓度50 m mol/L 的磷酸缓冲液溶解）中。

5、

（二）含有氨基或可还原硝基半抗原的偶联

芳香胺类半抗原与蛋白质重氮化偶联的操作步骤

1、用0.1 mol/L HCl溶液配制4 m mol/L浓度的半抗原。

2、滴加1％NaNO2(过量)，4度持续搅拌。NaNO2的加入量可用淀粉-碘化物试纸或在白色磁砖上加1％淀粉和50m mol/L KI进行监控。游离亚硝酸可将氧化物氧化成碘，碘再与淀粉反应变成蓝黑色。

3、溶液变成蓝黑色后，继续反应15分钟。

4、用pH9.0、浓度为200m mol/L的硼酸或碳酸缓冲液溶解蛋白。

5、边搅拌，边加入重氮化的半抗原（防止局部发生酸过量现象），调节pH到9.5。

6、冰箱中搅拌反应2小时，不断调节pH到9.0。

7、用PBS透析2天

8、 -20度保存（浓度为20mg/mL）

双功能的酰亚胺酯(imidate esters)可以氨基反应，形成脒。例如：用二甲基已二酰亚胺酯(dimethyladipimide)将去甲基三正喋呤(desmethylmortriptyline)与β-半乳糖苷酶偶联。

应用双功能酰亚胺酯（imidate esters）制备去甲基三正喋呤-与β-半乳糖苷酶标记特的操作步骤

1、用含5％（W/V）N-乙基吗啉的无水甲醇0.4ml,在室温下溶解570ug去甲基三正喋呤和488ug 二甲基已二酰亚胺酯(dimethyladipimide)(A液)

2、取与β-半乳糖苷酶100 ug, 溶于pH9.9的100 m mol/L碳酸缓冲液（含MgCl2 10m mol/L,2-巯基乙醇10 m mol/L 0.1ml(B液)

3、将A液倒入B液。

4、 20度反应90分钟后，加含NaCl 100 m mol/L, MgCl2 10 m mol/L和2-巯基乙醇10 m mol/L、pH7.5的Tris-醋酸缓冲液(50m mol/L) 1ml, 终止反应。

5、过sephadex G-25, 去除小分子物质，得酶标记物（约75％的酶与半抗原结合，但用三正喋呤代替去甲三正喋呤(demethylmortriptyline )进行偶联，则只有15％的酶与之结合。

（三）含巯基半抗原的偶联

可用马来酰亚胺方法与蛋白偶联。此外，将载体蛋白用溴乙酰胺(bromoacetamide)激活。或将载体蛋白与半抗原在pH4.0的醋酸缓冲液中，通过过氧化氢的作用形成二硫键，也可以将半抗原连接到蛋白质分子上。

（四）含羟基的半抗原偶联

醇类羟基通过形成半琥珀酸酯转化为羧基的操作步骤

1、 15g 2,2,2-三氯乙醇（2,2,2-trichloroethanol）,12g 琥珀酸酐(succinic anhydride)和8.7ml 三乙基胺(triethylamime)用100 ml乙酰乙酯溶解。

2、加热回流1小时。

3、减压蒸馏去溶剂，,残余物用5% NaHCO3水溶液溶解。

4、用乙醚洗涤两次，然后用H2SO4进行s酸化（pH到2.0）.

5、用水洗涤固形物（为三氯乙基半琥珀酸酯）两次，用氯仿-已烷使其结晶（产量约75％，熔点88-89度）

6、取2.5g 半琥珀酸酯溶于6.5ml 亚硫酰氯(thionyl chloride)中，65度加热30分钟。

7、减压蒸发，干燥1小时（高度真空条件下）。

8、将上述产生（2，2，2-三氯忆基琥珀酰氯）溶于15ml N,N-二甲基-乙酸乙酰胺(N,N-dimethylethylacetamide)中，室温搅拌反应2小时。

9、 65度真空蒸发后，用异丙醇使结晶析出来（得盐酸化的结晶---5`-酯约84％，熔点160度）。

10、用溶于二甲基甲酰胺中的锌和醋酸解离三氯乙酯，得f半抗原-半琥珀酸酯，这样引和的羧基可与蛋白质偶联（如用碳化二亚胺化）。

半抗原用NaIO4氧化其中的糖苷醇后再与蛋白质偶联的操作步骤

1、 20mg 腺苷溶于1ml 100m mol/L NaIO4溶液中，4度避光反应30分钟。

2、加1滴乙二醇(得A液)