常用的半抗原与蛋白偶联方法简介
蛋白交联(参考资料)
蛋白质交联方法及其应用蛋白质交联系指将小分子物质（如药物、半抗原等）或大分子物质(如酶、蛋白毒素等)以共价键的方式连接于蛋白质分子，以制备人工抗原、酶标抗体、载体释放药物、抗体导向药物和免疫毒素等。
随着放射免疫分析法、酶标免疫技术、载体药物学和导向物学的发展，蛋白质交联技术的方法和手段也不断改进和完善，并且在生物学和医学领域得到愈来愈广泛的应用。
蛋白质交联方法首先发展于人工抗原的制备研究。
自70年前Landsteiner第一次合成人工抗原以来，人们将许多没有抗原性的小分子物质(半抗原)如化学药物、神经递质和激素等与蛋白质或多糖等载体大分子共价结台；使其具备抗原性，以诱发动物产生特异性抗体，用于放射免疫分析等。
为了使放射免疫分析达到灵敏度高、特异性强的要求，前人对半抗原和蛋白质连接的方法进行了大量的研究，建立了重氮化法、戊二醛法、混合酸酐法、二异氰酸酯法及卤代硝基苯法等交联技术。
近10多年来发展起来的酶标免疫检测技术，要求制备保持酶的生物活性和抗体的免疫结合活性的酶—抗体偶合物。
常用的交联方法如戊二醛法、碳二亚胺法和混合酸酐法不可避免地要产生酶或抗体的自身交联产物或多聚物，致使交联效率降低、结合物活性减弱。
为了克服这一不足，人们发展了异型双功能交联试剂，如N—羟基琥珀酰亚胺—3—(2吡啶基二硫)—丙酸酯，以实现控制交联，提高交联反应的选择性和交联产物的均一性。
将药物与大分子载体连接，制备药物一载体结合物，以改善和控制药物在体内的转运和代谢，实现缓释给药和定向给药，提高生物利用度和治疗指数。
这是现代药物研究领域一个崭新的分支。
载体药物必须能够在体内定量、定位释放原型药物，因此要求设计pH敏感或特定酶敏感的偶联键。
导向药物的发展对蛋白质交联方法提出了更高的要求。
早在1906年，Ehrlich就提出了靶向给药的设想。
随着生物医学的发展，这一设想不断得到具体的实现。
单克隆抗体作为导向载体的出现，更使导向药物的研究成为当代药物研究中最活跃和最引人注目的领域之一，而其中研究得最广泛的是肿瘤治疗的抗体导向研究。
关于半抗原偶联载体的方案
关于半抗原偶联载体的方案人工抗原的合成是化学免疫的重要问题，化学免疫研究的对象，除上面提及的药物、毒物、激素外，还有多糖类、神经递质、肽类、核酸及生物体内其它小分子活性物质，总起来说，它们大多都是无免疫原性的半抗原，在对其进行免疫学及其它相关研究时，一方面要通过化学合成的手段，即蛋白质连接技术，经与载体蛋白交联合成制备人工抗原，继而用其免疫动物制备相应的抗体或单克隆抗体，作为研究用的探针；另一方面还必须将此探针用各种标记物进行标记，如本文论及的酶标记，以便用作研究工具；在分子生物学研究中，包括核酸或基因探针的研究及应用，多种类型探针的标记也都将涉及蛋白质连接技术。
半抗原分子量一般较小，其结构及化学功能团的性质多种多样，数量各不相同，在与酶蛋白或载体蛋白进行交联时，必须考虑交联双方的性质、交联剂、交联方法和载体.2．混合酸酐法制备G6PDH(葡糖—6—磷酸脱氢酶)标记利多卡因(Lidocaine．Li)结合物[29] (1)Li—混合酸酐的制备首先将Li经化学修饰(琥珀酸酐法，略)，在其分子中引入羟基(一COOH)，制成Li—COOH(Li一琥珀酸半酯)；然后，将此Li—COOHl0mg(0．0285mm0l)溶于375ul的DMF中，用电磁搅拌混溶。
在一10℃条件下，边搅动边滴入21ul的三乙胺，再缓慢滴入14ul的卡必醇氯甲酸酯，于一10。
C继续搅拌反应1．5小时，此全部过程应保持无水，即获得Li—混合酸酐(Li—MA)。
3．(2)酶——底物溶液的制备在冰浴中，将G6FDH(L．m)lmg用50mmol／LpH8．1Tris—HCl 溶解，同时加入G6P—Na(葡糖—6一磷·酸钠盐)10mg及NADH 3mg(底物一辅酶系统，用于保护酶活性)，使其溶解，随后缓慢加入300ul卡必醇，用2m0l／LNaOH调pH至9．0。
4．(3)G6PDH—Li的交联将酶—底物溶液置于冰浴中，在搅拌条件下，每隔10~15分钟向此酶液中缓慢加入一定量(25ul，50ul，100ul……)的Li—MA溶液，反应10~15分钟后，分别取出反应液5u1测定酶活性及Li半抗原的抗体对标记酶活性的抑制率.直至加入Li—MA的量所引起酶活性的下降程度最低，而抗体对酶活性的抑制率又最高时，此标记过程即完成(表2—8)5．表2—8 G6PDH—Lidocaine交联反应中酶活性变化及抗体抑制率3.碳化二亚胺法(EDC)制备人工抗原4.最近几年，在对无免疫原性小分子物质的化学免疫研究中，采用碳化二亚胺作为交联剂制备合成人工抗原的工作愈来愈多，因为用这种试剂进行交联最为方便，除交联的一方作为载体的蛋白质，具有多个氨基或羧基外，不少小分于化合物也具有此反应基团，或通过化学修饰引入羧基。
蛋白质偶联技术
蛋白质交联技术蛋白质交联是指将小分子物质（如药物、半抗原等）或大分子物质（如酶、蛋白毒素等）一共价键的方式连接于蛋白质分子四大行，以制备人工抗原酶标抗体等。
但标志交联方法首先发展于人孔抗原的制备研究。
自70年前Landsteiner第一次合成人工抗原以来，人们将许多没有抗原性的小分子物质如化学药物，神经递质等与蛋白质或多糖等载体大分子物质共价结合，使其具有抗原性，以诱发动物产生特异性抗体，用于放射免疫分析等。
目前经常采用的的偶联方法主要有重氮法，戊二醛法，戊二酸酐法，碳化二亚胺法等。
现将我对上述方法的理解研究归结如下:重氮法（1）（2）芳香族伯胺在低温（0～5℃）和强酸（盐酸或硫酸）溶液中与亚硝酸钠作用，生成重氮盐的反应称为重氮化反应。
若环上具有-N02或-SO3H等的芳胺可以高一些（40~60℃）温度进行重氮化反应。
在芳香重氮正离子中，键呈线形结构，键中的一个π 轨道与苯环上的π 轨道形成共轭体系，电子离域，使重氮盐在低温、强酸介质中能稳定存在。
苯环上有吸电子基团的重氮盐较为稳定，这是由于强化了与苯环的共轭，重氮盐在弱酸、中性或碱溶液中与芳胺或酚类作用，由偶氮基(－N=N－)将两个分子偶联起来，生成偶氮化合物的反应，称为偶联反应。
可合成偶氮染料。
偶联反应是亲电取代反应，重氮阳离子是弱的亲电试剂，它进攻苯环上电子出现几率密度比较大的碳原子。
重氮盐与酚在微碱性溶液中很快发生偶联反应。
这是由于：带负电的氧原子比中性的羟基更能使苯环活化。
但溶液PH>10:所以在进行偶联反应时，可考虑到多种因素，既考虑到的活性，又要考虑到和酚的活性，选择最适宜的反应条件，才能收到预期的效果。
戊二醛法戊二醛是带有两个活性基团双功能的连结剂，它借助两端的醛基与载体和半抗原的氨基以共价键连接，其反应如下：反应机制脂肪族醛、酮与氨、伯胺的反应可生成亚胺，也称为西佛碱（Schiff base)：脂肪族醛、酮生成的亚胺中含的C=N双键在反应条件下不是很稳定的，它易于发生进一步的聚合反应。
常用的半抗原与蛋白偶联方法简介
常用的半抗原与蛋白偶联方法简介公司标准化编码 [QQX96QT-XQQB89Q8-NQQJ6Q8-MQM9N]常用的半抗原与蛋白偶联方法简介（一）分子中含有羧基或可羧化的半抗原的偶联）1、混合酸酐法，也称氯甲酸异丁酯法（isobutyl chloroformate method）偶联时，半抗原分子中的羧基可与氯甲酸异丁酯在有机溶剂中形成混合酸酐(mixed acid anhydride),然后与蛋白分子中的氨基形成肽键。
氨甲喋呤（MIT）与β-半乳糖苷酶偶联的混合酐法1、5．8mg MIT用二甲基甲酰胺溶解，冷却至10度，加2ul氯甲酸异丁酯，10度搅拌反应30分钟。
2、酶用2ml 50 m mol/L Na2CO3溶解。
3、10度反应4小时（必要时加NaOH,以维持溶液的pH为，q然后4度过夜。
4、过sephadex G-25层析柱，柱用含NaCl 100m mol/L、MgCl2 10 m mol/L、2-巯基乙醇10 m mol/L的50m mol/L Tris-醋酸缓冲液平衡和洗脱，合并含酶的洗脱管内液体，进一步纯化后，保存于含BSA ％（w/v）、NaN3 %(w/v)的缓冲液中。
碳化二亚胺法制备3,3`,5-三碘甲腺氨酸-血蓝蛋白免疫原的操作步骤1、??取EDC 100mg , 用的10 m mol/L PBS液使之充分溶解（I液）2、??取3，3`,5-三碘甲腺原氨酸 25mg , 用L NaOH 溶液2ml 溶解(II液)3、??取血蓝蛋白(lemocyanin) 25mg, 溶于10mmol/L PBS （）液中（III 液）4、??将II液与III液混合，在磁力搅拌下逐滴加入I液（余下）5、??室温下避光搅拌1小时，逐滴加入余下的I液6、??4度搅拌12小时7、??静置10小时（4度）8、??有蒸馏水使之充分透析（约48小时），得免疫原。
孕酮与与β-半乳糖苷酶偶联的N-羟琥珀酰亚胺酯法1、??用二垩烷(dioxane)溶解孕酮-11-半琥珀酸酯，配成浓度为100m mol/L 的溶液。
半抗原与蛋白质偶联技术课件
录
• 半抗原的介绍 • 蛋白质偶联技术的介绍 • 半抗原与蛋白质偶联的方法 • 偶联效果的评估 • 实例展示
01
半抗原的介绍
半抗原的定义
半抗原
是指那些能够与抗体结合，但没 有免疫原性的小分子物质。
半抗原的特点
具有反应原性，即能够与抗体结 合的特性，但本身不具有免疫原 性，不能诱导机体产生免疫应答 。
蛋白质偶联技术的应用
蛋白质偶联技术在免疫分析、 生物传感器、抗体药物等领域 具有广泛的应用。
通过将半抗原与蛋白质载体进 行偶联，可以制备出具有特定 功能的免疫分析试剂，用于检 测生物样品中的目标物质。
此外，蛋白质偶联技术还可以 用于制备抗体药物和生物传感 器，以治疗疾病和监测环境中 的有害物质。
03
荧光标记法
利用荧光标记技术检测偶联产物的荧光强度，通过与标准品比较，判断偶联产 物的活性。
偶联产物的稳定性检测
热稳定性检测
通过加热处理偶联产物，观察其稳定性和热失活情况，以评 估偶联产物的热稳定性。
储存稳定性检测
将偶联产物在不同温度和湿度条件下储存，定期检测其活性 变化，以评估偶联产物的储存稳定性。
偶联产物的活性检测
通过生物学实验验证偶联产物是否保 持了原有蛋白质的生物学活性，如细 胞增殖、信号转导等。
实际应用中的实例
肿瘤免疫治疗
利用半抗原与蛋白质的偶联技术制备肿瘤免疫治疗药物，通过激活患者自身的免疫系统 来攻击肿瘤细胞。
疫苗研发
将半抗原与病毒或细菌的蛋白质结合，制备出具有免疫原性的疫苗，用于预防传染病。
碳二亚胺法
总结词
一种高选择性的偶联方法，通过形成稳 定的酰胺键将半抗原偶联到蛋白质上。
VS
半抗原偶联
• 对氨基苯胺的衍生物的半抗原与抗体反应
• 抗苯胺、邻氨基苯甲酸、间氨基苯甲酸、 对氨基苯甲酸的抗血清。
• 旋光异构体（右旋酒石酸、左旋酒石酸、 内消旋酒石酸）
半抗原与载体偶联时，思考问题 •
1）半抗原的溶解度和稳定性：在结合反应中应不导致半抗原活性 的改变，同时也不能使载体变性至不溶解的程度。 2）偶联的位置：抗体对远离蛋白质联接点的半抗原部分有最好的 特异性，故联接时应使联接键远离半抗原的决定簇。 3）选择适合的偶联试 剂：不同的半抗原在偶联时，应根据半抗 原的化学结构，以及反应方式选择适当的偶联试剂。如小分子肽 类有一定的三级结构，在溶液中依靠氨基酸残基来维持其结 构的 稳定。因此，用双功能的亚氨酸酯不但对氨基酸有选择，而且能 代替被取代的每一个ε-氨基的正电荷。蛋白质与偶联剂接触后， 使不同蛋白质分子的功能基团 交联并凝聚。广泛交联的蛋白质， 其溶解度常降低，而这种溶解度差的蛋白质却是有效的免疫源。 • 4)载体蛋白的选择,异源性以及不干扰未来的检测对象 .
• （1） 琥珀酸酐法：本法用于带有羟基的半抗 原的改造。琥珀酸酐加水转变成琥珀酸。如将 带有羟基的半抗原和琥珀酸酐在无水吡啶中反 应，即可得到带有羧基的半抗原琥珀酸的衍生 物。
四、通过巯基偶联
• 将半抗原中的巯基，通过交联剂马来酰亚胺活 化的载体蛋白与含SH-的半抗原的交联
含巯基半抗原偶联反应图
七、通过酚基与载体蛋白偶联 • 一氯醋酸钠：本法适于带有酚基半抗原的改造。 将带有酚基的药物与一氯醋酸钠反应即可得到 带有羧基的半抗原衍生物
将酚基与对氨基苯甲酸反应 • 将酚基与对氨基苯甲酸反应导入羧基，再进一 步通过EDC等方法，实现半抗原与载体蛋白质 的偶联
八、通过糖基的过碘酸氧化法
关于半抗原偶联载体的方案 人工抗原的合成是化学免疫的重要问题
关于半抗原偶联载体的方案人工抗原的合成是化学免疫的重要问题，化学免疫研究的对象，除上面提及的药物、毒物、激素外，还有多糖类、神经递质、肽类、核酸及生物体内其它小分子活性物质，总起来说，它们大多都是无免疫原性的半抗原，在对其进行免疫学及其它相关研究时，一方面要通过化学合成的手段，即蛋白质连接技术，经与载体蛋白交联合成制备人工抗原，继而用其免疫动物制备相应的抗体或单克隆抗体，作为研究用的探针；另一方面还必须将此探针用各种标记物进行标记，如本文论及的酶标记，以便用作研究工具；在分子生物学研究中，包括核酸或基因探针的研究及应用，多种类型探针的标记也都将涉及蛋白质连接技术。
半抗原分子量一般较小，其结构及化学功能团的性质多种多样，数量各不相同，在与酶蛋白或载体蛋白进行交联时，必须考虑交联双方的性质、交联剂、交联方法和载体. 2．混合酸酐法制备G6PDH(葡糖—6—磷酸脱氢酶)标记利多卡因(Lidocaine．Li)结合物[29] (1)Li—混合酸酐的制备首先将Li经化学修饰(琥珀酸酐法，略)，在其分子中引入羟基(一COOH)，制成Li—COOH(Li一琥珀酸半酯)；然后，将此Li—COOHl0mg(0．0285mm0l)溶于375ul的DMF中，用电磁搅拌混溶。
在一10℃条件下，边搅动边滴入21ul的三乙胺，再缓慢滴入14ul的卡必醇氯甲酸酯，于一10。
C继续搅拌反应1．5小时，此全部过程应保持无水，即获得Li—混合酸酐(Li—MA)。
3．(2)酶——底物溶液的制备在冰浴中，将G6FDH(L．m)lmg用50mmol／LpH8．1Tris—HCl溶解，同时加入G6P—Na(葡糖—6一磷·酸钠盐)10mg及NADH 3mg(底物一辅酶系统，用于保护酶活性)，使其溶解，随后缓慢加入300ul卡必醇，用2m0l／LNaOH调pH至9．0。
4．(3)G6PDH —Li的交联将酶—底物溶液置于冰浴中，在搅拌条件下，每隔10~15分钟向此酶液中缓慢加入一定量(25ul，50ul，100ul……)的Li—MA溶液，反应10~15分钟后，分别取出反应液5u1测定酶活性及Li半抗原的抗体对标记酶活性的抑制率.直至加入Li—MA的量所引起酶活性的下降程度最低，而抗体对酶活性的抑制率又最高时，此标记过程即完成(表2—8) 5．表2—8 G6PDH—Lidocaine交联反应中酶活性变化及抗体抑制率3.碳化二亚胺法(EDC)制备人工抗原 4.最近几年，在对无免疫原性小分子物质的化学免疫研究中，采用碳化二亚胺作为交联剂制备合成人工抗原的工作愈来愈多，因为用这种试剂进行交联最为方便，除交联的一方作为载体的蛋白质，具有多个氨基或羧基外，不少小分于化合物也具有此反应基团，或通过化学修饰引入羧基。
半抗原和蛋白质偶联技术课件
1、完全抗原 : 既有免疫原性又有抗原性的 物质，如多数蛋白质分子。
2、半抗原:又称不完全抗原，单独存在时只 具有抗原性而无免疫原性的物质，如二硝 基酚、青霉素。
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完全抗原
半抗原与载体结合后可使其具有免疫原性。
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人工抗原
人工结合抗原 ——将无免疫原性的简单化学基团与
蛋白质载体偶联，或将无免疫原性的有机 分子与蛋白质载体结合，形成载体-半抗原 结合物，均属人工结合抗原。
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包含583个氨基酸残基， 分子量为66.43kDa， 等电点为4.7。
BSA结构
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常见的偶联蛋白
卵清蛋ovalbvmin
是一种糖蛋白。 含有微量的磷。
是卵清中蛋白质 的主要成分，约 占65％。
鸡的卵清蛋白分 子量约45kDa。
常见的偶联蛋白
ε-多聚赖氨酸是 目前天然防腐剂中 具有优良防腐性能 的微生物类食品防 腐剂。它是由25～ 30赖氨酸残基聚合 而成，具有强烈的 抑菌能力，可以作 为防腐剂用于食品 的保鲜。
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偶联蛋白的性质
载体表面应首先应具有化学活性基团， 这些基团可以直接与抗生素或农药分子偶 联，这是化学偶联制备抗原的前提；
其次，载体应具备一定的容量，可以 偶联足够的分子；
关于半抗原偶联载体的方案
关于半抗原偶联载体的方案早上起来，一杯咖啡，看着窗外的阳光，心情大好。
今天要写的方案是关于半抗原偶联载体的，这个课题我已经研究了10年，是时候把我的思考整理出来了。
我们得明确半抗原偶联载体的概念。
简单来说，就是将半抗原和载体结合起来，形成一种新的免疫原，用于制备抗体或疫苗。
这个过程涉及到生物化学、分子生物学和免疫学等多个领域，所以方案要尽量全面，又要突出重点。
一、方案背景1.1半抗原概述半抗原，顾名思义，就是只有抗原性而没有免疫原性的物质。
它不能单独引起免疫反应，但可以与载体结合，形成免疫原。
常见的半抗原包括药物、糖类、多肽等。
1.2载体概述载体是具有免疫原性的物质，能够与半抗原结合，形成免疫原。
常见的载体有蛋白质、多聚糖、脂质等。
1.3半抗原偶联载体研究意义半抗原偶联载体在疫苗研发、抗体制备等领域具有广泛的应用前景。
通过半抗原偶联载体，我们可以提高抗原的免疫原性，降低副作用，提高疫苗的疗效。
二、方案目标2.1筛选合适的半抗原和载体2.2优化偶联方法，提高偶联效率2.3评估偶联载体的免疫原性2.4探索偶联载体在疫苗研发和抗体制备中的应用三、方案实施3.1半抗原筛选3.1.1收集文献，整理半抗原候选物质3.1.2分析候选物质的抗原性和免疫原性3.1.3筛选出具有潜在应用价值的半抗原3.2载体筛选3.2.1收集文献，整理载体候选物质3.2.2分析候选物质的免疫原性和生物相容性3.2.3筛选出具有潜在应用价值的载体3.3偶联方法优化3.3.1分析现有偶联方法的优缺点3.3.2设计新型偶联方法，提高偶联效率3.3.3对比实验，验证新型偶联方法的优越性3.4免疫原性评估3.4.1制备偶联载体3.4.2检测偶联载体的免疫原性3.4.3分析免疫原性结果，优化偶联载体3.5应用研究3.5.1疫苗研发3.5.2抗体制备3.5.3产业化推广四、方案进度安排4.1第一阶段：半抗原和载体筛选（1-3个月）4.2第二阶段：偶联方法优化（4-6个月）4.3第三阶段：免疫原性评估（7-9个月）4.4第四阶段：应用研究（10-12个月）五、预期成果5.1筛选出具有潜在应用价值的半抗原和载体5.2优化偶联方法，提高偶联效率5.3成功制备具有免疫原性的偶联载体5.4探索偶联载体在疫苗研发和抗体制备中的应用前景这个方案的实施需要团队的共同努力，大家一起加油，争取早日取得突破性成果！注意事项一：半抗原筛选的准确性解决办法：筛选半抗原时，一定要仔细分析文献，避免遗漏任何可能的候选物质。
如何用碳二亚胺法将半抗原偶联到蛋白上
如何用碳二亚胺法将半抗原偶联到【摘要】用碳二亚胺（EDC）法将14位羟基修饰的雷公藤内酯醇(TP)和不同的蛋白载体（阳离子化牛血清白蛋白、鸡卵清蛋白）偶联合成TP的人工免疫抗原和检测抗原，紫外光谱鉴定偶联效果，计算偶联率。
利用免疫抗原免疫小鼠，制备小鼠多克隆抗体，用检测抗原分析血清抗体效价，利用抗原竞争ELISA分析抗体特异性，为进一步研究TP的分子作用机理以及制备TP的单克隆抗体奠定基础。
【关键词】雷公藤内酯醇；14位羟基修饰；人工抗原；多克隆抗体雷公藤内酯醇（triptolide，TP）分子式C20H24O6，分子结构如图1，相对分子质量360.41，为二萜类三环氧内酯化合物，是从植物雷公藤（Tripterygium Wilfordii Hook.f.）中提取的有效成分里活性最强的部分，具有消炎散结、清热解毒、抗菌、免疫抑制以及抗生育等功效。
长期以来，TP作为临床上公认的免疫抑制剂，主要用于各种自身免疫性疾病，如类风湿性关节炎以及器官移植排斥反应的治疗。
近年来研究发现，该药对多种肿瘤细胞有诱导凋亡的作用，与化疗药物联合应用能协同杀伤肿瘤细胞或逆转肿瘤耐药，说明它具有抗肿瘤效果，因此在肿瘤治疗方面的应用也日益受到人们的关注。
除此以外，它还对细胞发育增殖、细胞周期等有调控作用。
近年来，国内外对TP具有如此广泛作用的分子机理产生了越来越浓厚的兴趣，从多个不同的角度进行了研究。
但是，由于缺少方便快捷的TP检测手段，长期以来对TP直接作用位点的研究一直十分困难，对TP作用的靶蛋白和作用途径知之甚少。
细胞免疫化学是追踪分子在细胞内作用过程的有力工具，如果能够得到TP的抗体，就为利用细胞免疫化学研究TP的作用靶点和在细胞内的定位等提供了分子探针，为最终研究TP作用机制和寻找其靶蛋白提供了可能。
作为小分子半抗原，TP需要和大分子蛋白载体偶联才能成为能够诱导产生抗体的免疫原。
为了不影响小分子的生物活性，提高偶联效率，我们需要选择合适的反应基团。
半抗原与蛋白质偶联技术56页PPT
71、既然我已经踏上这条道路，那么，任何东西都不应妨碍我沿着这条路走下去。——康德 72、家庭成为快乐的种子在外也不致成为障碍物但在旅行之际却是夜间的伴侣。——西塞罗 73、坚持意志伟大的事业需要始终不渝的精神。——伏尔泰 74、路漫漫其修道远，吾将上下而求索。——屈原 75、内外相应，言行相称。——韩非
半抗原与蛋白质偶联技术
36、如果我们国家的法律中只有某种 神灵， 而不是 殚精竭 虑将神 灵揉进 宪法， 总体上 来说， 法律就 会更好 。—— 马克·吐 温 37、纲纪废弃之日，便是暴政兴起之 时。— —威·皮 物特
38、若是没有公众舆论的支持，法律 是丝毫 没有力 量的。 ——菲 力普斯 39、一个判例造出另一个判例，它们 迅速累 聚，进 而变成 法律。 ——朱 尼厄斯
蛋白质交联方法及其应用
蛋白质交联方法及其应用蛋白质交联系指将小分子物质（如药物、半抗原等）或大分子物质(如酶、蛋白毒素等)以共价键的方式连接于蛋白质分子，以制备人工抗原、酶标抗体、载体释放药物、抗体导向药物和免疫毒素等。
随着放射免疫分析法、酶标免疫技术、载体药物学和导向物学的发展，蛋白质交联技术的方法和手段也不断改进和完善，并且在生物学和医学领域得到愈来愈广泛的应用。
蛋白质交联方法首先发展于人工抗原的制备研究。
自70年前Landsteiner第一次合成人工抗原以来，人们将许多没有抗原性的小分子物质(半抗原)如化学药物、神经递质和激素等与蛋白质或多糖等载体大分子共价结台；使其具备抗原性，以诱发动物产生特异性抗体，用于放射免疫分析等。
为了使放射免疫分析达到灵敏度高、特异性强的要求，前人对半抗原和蛋白质连接的方法进行了大量的研究，建立了重氮化法、戊二醛法、混合酸酐法、二异氰酸酯法及卤代硝基苯法等交联技术。
近10多年来发展起来的酶标免疫检测技术，要求制备保持酶的生物活性和抗体的免疫结合活性的酶—抗体偶合物。
常用的交联方法如戊二醛法、碳二亚胺法和混合酸酐法不可避免地要产生酶或抗体的自身交联产物或多聚物，致使交联效率降低、结合物活性减弱。
为了克服这一不足，人们发展了异型双功能交联试剂，如N—羟基琥珀酰亚胺—3—(2吡啶基二硫)—丙酸酯，以实现控制交联，提高交联反应的选择性和交联产物的均一性。
将药物与大分子载体连接，制备药物一载体结合物，以改善和控制药物在体内的转运和代谢，实现缓释给药和定向给药，提高生物利用度和治疗指数。
这是现代药物研究领域一个崭新的分支。
载体药物必须能够在体内定量、定位释放原型药物，因此要求设计pH敏感或特定酶敏感的偶联键。
导向药物的发展对蛋白质交联方法提出了更高的要求。
早在1906年，Ehrlich就提出了靶向给药的设想。
随着生物医学的发展，这一设想不断得到具体的实现。
单克隆抗体作为导向载体的出现，更使导向药物的研究成为当代药物研究中最活跃和最引人注目的领域之一，而其中研究得最广泛的是肿瘤治疗的抗体导向研究。
常用的半抗原与蛋白偶联方法简介
常用的半抗原与蛋白偶联方法简介（一）分子中含有羧基或可羧化的半抗原的偶联）1、混合酸酐法，也称氯甲酸异丁酯法（isobutyl chloroformate method）偶联时，半抗原分子中的羧基可与氯甲酸异丁酯在有机溶剂中形成混合酸酐(mixed acid anhydride),然后与蛋白分子中的氨基形成肽键。
氨甲喋呤（MIT）与β-半乳糖苷酶偶联的混合酐法1、5．8mg MIT用二甲基甲酰胺溶解，冷却至10度，加2ul氯甲酸异丁酯，10度搅拌反应30分钟。
2、酶用2ml 50 m mol/L Na2CO3溶解。
3、10度反应4小时（必要时加NaOH,以维持溶液的pH为，q然后4度过夜。
4、过sephadex G-25层析柱，柱用含NaCl 100m mol/L、MgCl2 10 m mol/L、2-巯基乙醇10 m mol/L的50m mol/L Tris-醋酸缓冲液平衡和洗脱，合并含酶的洗脱管内液体，进一步纯化后，保存于含BSA ％（w/v）、NaN3 %(w/v)的缓冲液中。
碳化二亚胺法制备3,3`,5-三碘甲腺氨酸-血蓝蛋白免疫原的操作步骤1、??取EDC 100mg , 用的10 m mol/L PBS液使之充分溶解（I液）2、??取3，3`,5-三碘甲腺原氨酸25mg , 用L NaOH 溶液2ml 溶解(II液)3、??取血蓝蛋白(lemocyanin) 25mg, 溶于10mmol/L PBS （）液中（III液）4、??将II液与III液混合，在磁力搅拌下逐滴加入I液（余下）5、??室温下避光搅拌1小时，逐滴加入余下的I液6、??4度搅拌12小时7、??静置10小时（4度）8、??有蒸馏水使之充分透析（约48小时），得免疫原。
孕酮与与β-半乳糖苷酶偶联的N-羟琥珀酰亚胺酯法1、??用二垩烷(dioxane)溶解孕酮-11-半琥珀酸酯，配成浓度为100m mol/L的溶液。
2、??加羟琥珀酰亚胺(N-hydroxysuccinimide) 100 m mol/L 和DCC（二环已基碳化二亚胺），200 m mol/L, 4度反应16小时。
半抗原与蛋白质偶联技术优秀课件
常见的偶联蛋白
ε-多聚赖氨酸是 目前天然防腐剂中 具有优良防腐性能 的微生物类食品防 腐剂。它是由25～ 30赖氨酸残基聚合 而成，具有强烈的 抑菌能力，可以作 为防腐剂用于食品 的保鲜。
偶联蛋白的性质
载体表面应首先应具有化学活性基团， 这些基团可以直接与抗生素或农药分子偶 联，这是化学偶联制备抗原的前提；
BSA结构
常见的偶联蛋白
卵清蛋ovalbvmin 是一种糖蛋白。 含有微量的磷。 是卵清中蛋白质 的主要成分，约 占65％。 鸡的卵清蛋白分 子量约45kDa。
a.牛血清白蛋白 b.磷酸酪氨酸血清白蛋白 c.卵清蛋白 d.磷酸酪氨酸卵清蛋白
常见的偶联蛋白
钥孔血蓝蛋白(KLH) 由于KLH质量大，
如：目的基因（编码抗原）+ 载体（质粒等） 重组DNA 细胞（真核或原核） 表 达 纯化 基因工程疫苗
抗原的性质
1.免疫原性： 抗原刺激机体产生特异性免疫应答，外与相应的抗体/效应 淋巴细胞发生特异性结合，产生免疫应答 的特性。
半抗原与蛋白质偶联技术优秀课件
抗原与半抗原
抗原
抗原 ——能与淋巴细胞抗原受体（TCR/BCR） 特异性结合，刺激机体产生特异性免疫应 答，并与相应免疫应答产物（指抗体或致 敏淋巴细胞）在体内、外发生特异性结合 反应的物质。
抗原的分类
天然抗原 如：细菌、病毒、真菌、寄生虫等。
人工抗原 如：人工结合抗原、人工合成抗原、 基因工程抗原
B
BT T
抗体
常见的偶联蛋白
常见的偶联蛋白
常用来作为合成人工抗原的载体蛋白质有： 牛血清白蛋白(BSA)、 卵清蛋白(OA)、 钥孔血蓝蛋白(KLH)、 人血清白蛋白(HSA) 人工合成的多聚赖氨酸(PLL)等。
半抗原与蛋白质偶联技术
纯度鉴定 利用吸附与分配层析和电泳技术可鉴定人工抗原的偶联的纯度。如果电泳图谱上只出现一条电泳带，则表明人工抗原达到电泳纯，否则说明人工抗原中含有未偶联的物质。
利用电泳技术鉴定人工抗原偶联的纯度
偶联比的测定
分光光度法 如果半抗原的紫外最大吸收大于220nm(蛋白质在220nm以下会产生肽的强紫外吸收，如果半抗原的紫外最大吸收少于220nm，则与蛋白质肽的吸收发生重叠)，则可根据蛋白质及其半抗原特定的吸收峰的光密度值和各自的摩尔消光系数，计算出结合到每个蛋白质分子上的半抗原分子数
3
人工抗原
4
如：人工结合抗原、人工合成抗原、
5
基因工程抗原
6
常见的天然抗原-细菌
链球菌 痢疾杆菌 霍乱弧菌 伤寒杆菌
常见的天然抗原-病毒
狂犬病病毒 腺病毒 口蹄疫病毒 流感病毒
常见的其他天然抗原
真菌 白色念珠菌 (1,000X oil) 疟原虫
01
异种动物血清
02
异嗜性抗原
03
血型抗原
研究发现各种载体的分子量不论是否接近，最佳结合比都不尽相同，并建议为了取得最佳免疫效果，应逐个确定各种载体的最佳结合比。
影响人工抗原质量的因素
有研究者认为，一定长度的手臂的介入，有助于半抗原暴露在外面，利于所产生抗体专一性的增强．但也有一些研究者发现，手臂结构对免疫检测经常有不利的影响，有时产生的抗体对手臂结构亲和力特别强，对待测小分子亲和力却很弱，因此造成对特异性抗体检测的干扰。
抗原性:
抗原的性质
抗原（按照免疫原性及免疫反应性）分类
01
完全抗原 : 既有免疫原性又有抗原性的物质，如多数蛋白质分子。 半抗原:又称不完全抗原，单独存在时只具有抗原性而无免疫原性的物质，如二硝基酚、青霉素。
一种蛋白偶联方法
一种蛋白偶联方法
一种常见的蛋白偶联方法是使用化学交联剂或生物分子间的相互作用结合蛋白质，然后通过这些交联剂或相互作用点将两个蛋白质连接在一起。
1. 化学交联：化学交联剂例如二亚硫酰氯（DSS）、二氧化胺（EDC）等可以用于将两个蛋白质中的氨基酸残基（例如赖氨酸和半胱氨酸）连接在一起。
这些交联剂通过形成共价键使蛋白质紧密地结合在一起。
2. 生物分子相互作用：一些生物分子的相互作用也可以被用作蛋白质偶联的方法。
例如，抗体可以与蛋白质结合，并通过抗体的Fc区域与其他抗体或蛋白质连接在一起。
此外，糖基化酶和底物之间的特异性结合也可以用于蛋白质偶联。
以上方法均可以用于构建蛋白质复合物、蛋白质修饰等研究。
然而，需要注意的是，选择合适的方法要根据实验需要和研究对象的特点进行优化，并考虑可能引入的额外结构或相互作用对结构和功能的影响。
半抗原免疫原的制备概述
2mlN-N’二甲基甲酰胺(DMF)
40µl氯甲酸异丁酯 磁
力搅拌８分钟
２ 210mgBSA
形成IAA混合酸酐
11mmol/lNaOH
搅拌
• 实验步骤：
３ 将IAA混合酸酐逐滴加入到BSA溶液中 200µl1mol/lNaOH
不断搅拌
继续搅拌1h ４
实验一
• 实验目的:
半抗原免疫原的制备
• 1 了解半抗原免疫原的合成方法及基本原理； • 2 将半抗原吲哚乙酸用混合酸酐法与载体蛋白牛 血清白蛋白偶联。
分子量: 175.18
吲哚乙酸
实验原理：
半抗原-载体连接方法3
Cl-COO-CH2CH(CH3)2
半抗原-COOH 半抗原-COO-COO-CH2CH(CH3)2
载体蛋白-NH2
半抗原-CO-NH-载体蛋白 ＋ HO-CH2CH(CH3)2
氯甲酸异丁脂法
• 试剂和仪器：
• 试剂：吲哚乙酸(IAA)，牛血清白蛋白(BSA)，三 正丁胺，N-N’二甲基甲酰胺(DMF)，氯甲酸异丁
酯，NaOH；
• 仪器：反应器，磁力搅拌器，微量加样器，滴管
等。
• 实验步骤：
１ 52.3mgIAA
搅拌5h
反应物装入透析袋
４℃对10%DMF透析１d
对蒸馏水透析4d ５ 取出反应物 分装 -20 ℃保存
• 思考题：
１ ２ ３ 小分子半抗原为什么要与载体蛋白先偶联才能 载体蛋白的选择原则。 半抗原与载体偶联时，因其所带基团的不同需 作为免疫原？
不同连接方法，试加以简述。
抗原偶联选择方法
载体的选择：1.载体表面应首先应具有化学活性基团，这些基团可以直接与抗生素或农药分子偶联，这是化学偶联制备抗原的前提；2.其次,载体应具备一定的容量,可以偶联足够的分子；3.载体还应该是惰性的,不应干扰偶联分子的功能；4.而且载体应具有足够的稳定性,且应该是廉价易得的.载体蛋白质有牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OA)、钥孔血蓝蛋白(KLH)、人血清白蛋白(HSA)及人工合成的多聚赖氨酸(PLL)等这些蛋白质分子中的α和ε-氨基（等电点8和10）、苯酚基、巯基（等电点为9）、咪唑基（等电点为7）、羧基（等电点2～4,大部分来自天冬氨酸或谷氨酸的β-和γ-羧基）等在等电点pH条件下,一部分成为质子,另一部分未质子化的亲核基团则具有反应活性,可与半抗原中的对应基团结合.当然,这些基团的反应性也取决于蛋白质各种氨基酸残基的微环境.牛血清白蛋白（BSA）和人血清白蛋白（HAS）分子中含有大量的赖氨酸,故有许多自由氨基存在,且在不同pH和离子强度下能保持较大的溶解度.此外,这些蛋白质在用有机溶剂（如吡啶、二甲基甲酰胺）溶解时,其活性基团仍呈可溶状态,因此,这两种蛋白质是最常用的载体蛋白质.近年来,有研究报道用人工合成的多聚肽(最常用的是多聚赖氨酸)作载体,表现出能增加半抗原的免疫原性,从而使产生征对半抗原的特异性抗体可能性增加,被广泛应用。
人工抗原合成方法：小分子半抗原与载体蛋白偶联效果会到偶联物的浓度及其相对比例、偶联剂的有效浓度及其相对量、缓冲液成分及其纯度和离子强度、pH以及半抗原的稳定性、可溶性和理化特性等因素的影响.通常是在条件温和的水溶液中将半抗原与载体蛋白共价结合,不宜在高温、低温、强碱、强酸条件下进行.一般是由半抗原上的活性基团决定偶联合成的方法,常用的方法如下：分子中含有羧基或者可羧化的半抗原的偶联1）混合酸酐法（mixed anhydride method）：也称氯甲酸异丁酯法。
偶联时，半抗原分子中的羧基可与氯甲酸异丁酯在有机溶剂中形成混合酸酐(mixed acid anhydride)，然后与蛋白分子中的氨基形成肽键。
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常用的半抗原与蛋白偶联方法简介（一）分子中含有羧基或可羧化的半抗原的偶联）1、混合酸酐法，也称氯甲酸异丁酯法（isobutyl chloroformate method）偶联时，半抗原分子中的羧基可与氯甲酸异丁酯在有机溶剂中形成混合酸酐(mixed acid anhydride),然后与蛋白分子中的氨基形成肽键。
氨甲喋呤（MIT）与β-半乳糖苷酶偶联的混合酐法1、5．8mg MIT用0.1ml二甲基甲酰胺溶解，冷却至10度，加2ul氯甲酸异丁酯，10度搅拌反应30分钟。
2、1.5mg酶用2ml 50 m mol/L Na2CO3溶解。
3、10度反应4小时（必要时加NaOH,以维持溶液的pH为9.0，q然后4度过夜。
4、过sephadex G-25层析柱，柱用含NaCl 100m mol/L、MgCl2 10 m mol/L、2-巯基乙醇10 m mol/L的50m mol/L Tris-醋酸缓冲液(pH7.5)平衡和洗脱，合并含酶的洗脱管内液体，进一步纯化后，保存于含BSA 0.1％（w/v）、NaN3 0.02%(w/v)的缓冲液中。
碳化二亚胺法制备3,3`,5-三碘甲腺氨酸-血蓝蛋白免疫原的操作步骤1、取EDC 100mg , 用pH8.0的10 m mol/L PBS液2.5ml使之充分溶解（I液）2、取3，3`,5-三碘甲腺原氨酸25mg , 用0.2mol/L NaOH 溶液2ml 溶解(II液)3、取血蓝蛋白(lemocyanin) 25mg, 溶于10mmol/L PBS （pH8.0）液中（III液）4、将II液与III液混合，在磁力搅拌下逐滴加入I液（余下0.5ml）5、室温下避光搅拌1小时，逐滴加入余下的I液6、 4度搅拌12小时7、静置10小时（4度）8、有蒸馏水使之充分透析（约48小时），得免疫原。
孕酮与与β-半乳糖苷酶偶联的N-羟琥珀酰亚胺酯法1、用二垩烷(dioxane)溶解孕酮-11-半琥珀酸酯，配成浓度为100m mol/L的溶液。
2、加羟琥珀酰亚胺(N-hydroxysuccinimide) 100 m mol/L 和DCC（二环已基碳化二亚胺），200 m mol/L, 4度反应16小时。
3、用簿层扫描方法纯化(氯仿：水=9：1)4、按孕酮/酶摩尔浓度比约为10的比例，将上述溶液加入到酶液（用pH7.4，浓度50 m mol/L 的磷酸缓冲液溶解）中。
5、（二）含有氨基或可还原硝基半抗原的偶联芳香胺类半抗原与蛋白质重氮化偶联的操作步骤1、用0.1 mol/L HCl溶液配制4 m mol/L浓度的半抗原。
2、滴加1％NaNO2(过量)，4度持续搅拌。
NaNO2的加入量可用淀粉-碘化物试纸或在白色磁砖上加1％淀粉和50m mol/L KI进行监控。
游离亚硝酸可将氧化物氧化成碘，碘再与淀粉反应变成蓝黑色。
3、溶液变成蓝黑色后，继续反应15分钟。
4、用pH9.0、浓度为200m mol/L的硼酸或碳酸缓冲液溶解蛋白。
5、边搅拌，边加入重氮化的半抗原（防止局部发生酸过量现象），调节pH到9.5。
6、冰箱中搅拌反应2小时，不断调节pH到9.0。
7、用PBS透析2天8、 -20度保存（浓度为20mg/mL）双功能的酰亚胺酯(imidate esters)可以氨基反应，形成脒。
例如：用二甲基已二酰亚胺酯(dimethyladipimide)将去甲基三正喋呤(desmethylmortriptyline)与β-半乳糖苷酶偶联。
应用双功能酰亚胺酯（imidate esters）制备去甲基三正喋呤-与β-半乳糖苷酶标记特的操作步骤1、用含5％（W/V）N-乙基吗啉的无水甲醇0.4ml,在室温下溶解570ug去甲基三正喋呤和488ug 二甲基已二酰亚胺酯(dimethyladipimide)(A液)2、取与β-半乳糖苷酶100 ug, 溶于pH9.9的100 m mol/L碳酸缓冲液（含MgCl2 10m mol/L,2-巯基乙醇10 m mol/L 0.1ml(B液)3、将A液倒入B液。
4、 20度反应90分钟后，加含NaCl 100 m mol/L, MgCl2 10 m mol/L和2-巯基乙醇10 m mol/L、pH7.5的Tris-醋酸缓冲液(50m mol/L) 1ml, 终止反应。
5、过sephadex G-25, 去除小分子物质，得酶标记物（约75％的酶与半抗原结合，但用三正喋呤代替去甲三正喋呤(demethylmortriptyline )进行偶联，则只有15％的酶与之结合。
（三）含巯基半抗原的偶联可用马来酰亚胺方法与蛋白偶联。
此外，将载体蛋白用溴乙酰胺(bromoacetamide)激活。
或将载体蛋白与半抗原在pH4.0的醋酸缓冲液中，通过过氧化氢的作用形成二硫键，也可以将半抗原连接到蛋白质分子上。
（四）含羟基的半抗原偶联醇类羟基通过形成半琥珀酸酯转化为羧基的操作步骤1、 15g 2,2,2-三氯乙醇（2,2,2-trichloroethanol）,12g 琥珀酸酐(succinic anhydride)和8.7ml 三乙基胺(triethylamime)用100 ml乙酰乙酯溶解。
2、加热回流1小时。
3、减压蒸馏去溶剂，,残余物用5% NaHCO3水溶液溶解。
4、用乙醚洗涤两次，然后用H2SO4进行s酸化（pH到2.0）.5、用水洗涤固形物（为三氯乙基半琥珀酸酯）两次，用氯仿-已烷使其结晶（产量约75％，熔点88-89度）6、取2.5g 半琥珀酸酯溶于6.5ml 亚硫酰氯(thionyl chloride)中，65度加热30分钟。
7、减压蒸发，干燥1小时（高度真空条件下）。
8、将上述产生（2，2，2-三氯忆基琥珀酰氯）溶于15ml N,N-二甲基-乙酸乙酰胺(N,N-dimethylethylacetamide)中，室温搅拌反应2小时。
9、 65度真空蒸发后，用异丙醇使结晶析出来（得盐酸化的结晶---5`-酯约84％，熔点160度）。
10、用溶于二甲基甲酰胺中的锌和醋酸解离三氯乙酯，得f半抗原-半琥珀酸酯，这样引和的羧基可与蛋白质偶联（如用碳化二亚胺化）。
半抗原用NaIO4氧化其中的糖苷醇后再与蛋白质偶联的操作步骤1、 20mg 腺苷溶于1ml 100m mol/L NaIO4溶液中，4度避光反应30分钟。
2、加1滴乙二醇(得A液)3、将A液加入到β-半乳糖苷酶液（20mg/ml,用150m mol/L NaCl,10m mol/L MgCl2水溶液溶解，用3％K2CO3调节pH至9.0）中4、 4度反应2小时，期间不断调节pH9.05、加入临时配制的50 mg/ml NaBO4溶液，用量为反应体积的1/10。
4度反应过夜。
6、用含有MgCl2 10m mol/L,2-巯基乙醇10 m mol/L、NaCl 100 m mol/L的50 m mol/L 磷酸缓冲液(pH7.4)透析(更换透析液数次)（五）含酮基或酮基半抗原的偶联是将酮基经羟胺类化合物处理变成肟类化合物，再进一步将肟类化合物中的羟基，衍变成羧基化合物，再进一步进行含羧基半抗原的偶联操作。
这类羟胺类化合物主要有：氨氧乙酸aminoxy acetic acid 或羧甲氧胺carboxymethoxyl amine 或者盐酸羟胺酮基的类固醇分子中引入羧基的操作步骤1、在200ml 乙醇中，加入O-(羧甲基)羟胺（O-(carboxyl)hydroxylamine）和酮基半抗原，使其浓度分别为10m mol/L 和4m mol/L2、加热回流90分钟3、旋转蒸发，减少容积，然后加水至40ml，用乙醚抽提4、用水洗涤乙醚抽提物，用Na2SO4干燥成白色粉末。
（六）、其他半抗原的偶联虽含有游离基团，但因这些基团对于维其生物活性十分重要，因些不能直接用来与载体蛋白偶联。
制备雌二醇-6-肟的操作步骤a、雌二醇二醋酸盐的制备1、 1g雌二醇溶于14ml 吡啶及3.5ml 醋酐中2、加热回流1小时，冷却后倾入冰水中。
3、收集白色晶体，得产物约1.1g（熔点126到127度）b、雌二醇-6-酮-二醋酸盐的制备4、雌二醇二醋酸盐1.1g，滴加冰醋酸3.8ml 溶解后加含0.93g CrO3的含水冰醋酸6.35ml (H2O:Hac=0.75:5.6)5、室温搅拌1小时，静置24小时6、用水稀释，用乙醚提取4次7、用蒸馏水洗2次8、减压蒸馏，得结晶油状渣物。
9、用90度烘干20分钟，得粗制品约500mg10、用11ml 无水乙醇溶解粗制品，再加1.1ml 冰醋酸及1.5g吉纳你特T试剂(Girad T)，回流1小时。
11、冷却后，用冰致冷的蒸馏水稀释，用2.5mol/LNaOH调节pH至6.0-6.2.12、用乙醚抽提3次，弃去乙醚。
13、水层用浓盐酸酸化（盐酸终浓度为1mol/L).14、室温静置2小时。
15、用乙醚抽提3次。
16、合并乙醚抽提液，用0.125mol/L碳酸钠溶液洗1次，用蒸馏水洗3次。
17、用无水硫酸钠脱水，蒸干。
18、加7ml 醋酐，回流20分钟。
19、冷却后倾入用冰致冷的蒸馏水中，然后过滤、干燥得产物约176mg (熔点为162-166度)c、二醇-6-酮的制备20、用5.5ml 20％的氢氧化钾-甲醇溶液(W/V)溶解雌二醇-6-酮-二醋酸盐（176mg）,在室温下于氮气中水解24小时。
21、加蒸馏水稀释，用乙醚抽提3次。
22、在乙醚提取液中无水硫酸钠进行脱水，蒸发干燥，得产物约60mg(熔点为278-282度)d、雌二醇-6-肟的制备23、取雌二醇-6-酮50mg ,盐酸羧甲基羧胺50mg,溶于20％含水甲醇(V/V)7ml 和1mol/L醋酸钠4ml中，回流1.5小时。
24、减压、蒸馏、浓缩后，加蒸馏水20ml25、用2 mol/L NaOH调节pH至8.5。
26、用醋酸乙酯抽提4次27、水层用1 mol/L盐酸酸化至pH2.5。
28、用醋酸乙酯抽提4次29、合并抽提液，蒸干，得产物约100mg(结晶熔点约186-188度)其他半抗原如：青霉素、生物素、地高辛、荧光素等半抗原交联。