分子生物学实验教案详细教案PPT课件
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【实验原理】
2020/9/30
三峡大学李晓玲编写与制作
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LB培养基
是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基，有时又称为普通培养 基。它含有酵母提取物、蛋白胨和NaCl。其中酵母提取物为微生 物提供碳源和能源，磷酸盐、蛋白胨主要提供氮源，而NaCl提供 无机盐。在配制固体培养基时还要加入一定量琼脂作凝固剂。
分子生物学实验
湖北省生物学实验教学示范中心 2010年10月
2020/9/30
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实 验 内 容
实验一 实验准备及培养基的制备与灭菌 实验二 质粒DNA的提取 实验三 质粒DNA的酶切和检测 实验四 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化 实验五 DNA重组（连接反应） 实验六 植物DNA的提取及琼脂糖凝胶电泳检测 实验七 PCR基因扩增
③加盖，并将盖上的排气软管插入内层锅的排气槽内。再以两两对称 的方式同时旋紧相对的两个螺栓，使螺旋松紧一致，务使漏气。
202Hale Waihona Puke Baidu/9/30
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④ 用电加热，并同时打开排气阀，使水沸腾以排除锅内的空气。待冷空 气完全排尽后，关上排气阀，让锅内的温度随蒸气压力增加而逐渐上 升。当锅内压力升到所需压力时，控制热源，维持压力至所需时间。 本实验用0.11MPa,121.5℃,20min灭菌。
琼脂在常用浓度下96℃时溶化，一般实际应用时在沸水浴中或下 面垫以石棉网煮沸溶化，以免琼脂烧焦。琼脂在40℃时凝固，通 常不被微生物分解利用。固体培养基中琼脂的含量根据琼脂的质 量和气温的不同而有所不同。
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⑥将取出的灭菌培养基放入37℃温箱培养24小时，经检查若无杂 菌生长，即可待用。
5. 实验室安全与卫生 6. 分组：5人一大组，2～3人一小组，一个实验桌1套移液枪 7.准备：
每组蓝枪头和黄枪头各1盒，全班另加2包，EP管1盒或1包，30ml离心 管12个，培养皿10个，全班1000ml的LB培养基 8. 实验报告与成绩评定 平时成绩50％：考勤，实验操作，实验结果，预习报告 考核成绩50％ ：实验报告
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实验一 实验准备及培养基制备与灭菌
【实验目的】
主要掌握离心机、微量移液器及高压灭菌锅的使用 机及实验操作注意事项
【实验准备内容】
1.实验准备： 器皿清洗、试剂配制、灭菌分装、取用保存 2. 离心机的使用 ①打开离心机电源开关，进入待机状态。 ②选择合适的转头 ③离心管平衡误差应在0.1克以内。 ④选择离心参数：
灭菌的主要因素是温度而不是压力。因此锅内冷空气必须完全排尽，才 能关上排气阀，维持所需压力。
⑤灭菌所需时间到后，切断电源，让灭菌锅内温度自然下降，当压力表 的压力降至“0”时，打开排气阀，旋松螺栓。打开盖子，取出灭菌 物品。
压力一定要降到“0”时，才能打开排气阀，开盖取物。否则就会因 锅内压力突然下降，使容器内的培养基由于内外压力不平衡而冲出瓶 口，造成棉塞沾染培养基而发生污染，甚至灼伤使用者。
⑧然后按吸嘴弹射器除去吸嘴。
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量液操作注意事项
a. 连续可调移液器的取用体积调节要轻缓，严禁超过最大或最小量程； b. 在移液器吸头中含有液体时禁止将移液器水平放置，平时不用时置
移液器于架上； c. 吸取液体时，动作应轻缓，防止液体随气流进入移液器的上部； d. 在吸取不同的液体时，要更换吸头； e. 移液器要进行定期校准，一般由专业人员来进行。
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【思考题】
1.高压蒸气灭菌之前，为什么要将锅内冷空气 排尽？灭菌完毕后，为什么待压力降低到 “0”时才能打开排气阀，开盖取物？
2.移液操作应注意哪些事项？
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【LB培养基的制备及灭菌】
【实验目的】 通过对LB培养基的配制，掌握配制培养 基的一般方法和步骤。
微量移液器的操作步骤： ①将微量移液器装上吸头（不同规格的移液器用不同的吸头） ②将微量移液器按钮轻轻压至第一停点；
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③垂直握持微量移液器，使吸嘴浸入液样面下几毫米，千万不要将吸嘴 直接插到液体底部； ④缓慢、平稳地松开控制按钮，吸上样液。否则液体进入吸嘴太快，导 致液体倒吸入移液器内部，或吸入体积减少； ⑤等一秒钟后将吸嘴提离液面 ⑥平稳地把按钮压到第一停点，再把按钮压至第二停点以排出剩余液体； ⑦提起微量移液器，使吸嘴在容器壁擦过；
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4.手提式高压蒸气灭菌锅的使用及注意事项
①首先将内层锅取出，再向外层锅内加入适量的水，使水面与三角搁 架相平为宜。切物忘记加水，同时加水量不可过少，以防灭菌锅 烧干而引起炸裂事故。
②放入内层锅，并装入待灭菌物品。注意不要装得太挤，以免妨碍蒸 气流通而影响灭菌效果。三角瓶与试管口端均不要与桶壁接触， 以免冷凝水淋湿包口的纸而透入棉塞。
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⑤将平衡好的离心管对称放入转头内。盖好转头盖子拧紧螺丝。 ⑥按下离心机盖门，如盖门未盖牢，离心机将不能启动。 ⑦按START键，开始离心。离心开始后（特别是高速离心时）应等离心
速度达到所设的速度时才能离开，一旦发现离心机有异常（如不平 衡而导致机器明显震动，或噪音很大），应立即按STOP键，必要时 直接按电源开关切断电源，停止继续离心，并找出原因。 ⑧机器如发现故障，请及时与有关人员联系。 ⑨使用结束后请清洁转头和离心机腔，不要关闭离心机盖，利于湿气蒸 发。 ⑩使用结束后必须登记，注明使用情况。
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离心机的摆放位置
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3. 移液器的使用
移液器是生化与分子生物学实验室常用的小件精密设备，移液器 能否正确是用，直接关系到实验的准确性与重复性，同时关系到 移液器的使用寿命。
移液器由联系可调的机械装置和可替换的吸头组成，不同型号的 移液器吸头有所不同，实验室常用的移液器根据最大吸用量有 20ul, 200ul, 1ml等规格。
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LB培养基
是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基，有时又称为普通培养 基。它含有酵母提取物、蛋白胨和NaCl。其中酵母提取物为微生 物提供碳源和能源，磷酸盐、蛋白胨主要提供氮源，而NaCl提供 无机盐。在配制固体培养基时还要加入一定量琼脂作凝固剂。
分子生物学实验
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实 验 内 容
实验一 实验准备及培养基的制备与灭菌 实验二 质粒DNA的提取 实验三 质粒DNA的酶切和检测 实验四 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化 实验五 DNA重组（连接反应） 实验六 植物DNA的提取及琼脂糖凝胶电泳检测 实验七 PCR基因扩增
③加盖，并将盖上的排气软管插入内层锅的排气槽内。再以两两对称 的方式同时旋紧相对的两个螺栓，使螺旋松紧一致，务使漏气。
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④ 用电加热，并同时打开排气阀，使水沸腾以排除锅内的空气。待冷空 气完全排尽后，关上排气阀，让锅内的温度随蒸气压力增加而逐渐上 升。当锅内压力升到所需压力时，控制热源，维持压力至所需时间。 本实验用0.11MPa,121.5℃,20min灭菌。
琼脂在常用浓度下96℃时溶化，一般实际应用时在沸水浴中或下 面垫以石棉网煮沸溶化，以免琼脂烧焦。琼脂在40℃时凝固，通 常不被微生物分解利用。固体培养基中琼脂的含量根据琼脂的质 量和气温的不同而有所不同。
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⑥将取出的灭菌培养基放入37℃温箱培养24小时，经检查若无杂 菌生长，即可待用。
5. 实验室安全与卫生 6. 分组：5人一大组，2～3人一小组，一个实验桌1套移液枪 7.准备：
每组蓝枪头和黄枪头各1盒，全班另加2包，EP管1盒或1包，30ml离心 管12个，培养皿10个，全班1000ml的LB培养基 8. 实验报告与成绩评定 平时成绩50％：考勤，实验操作，实验结果，预习报告 考核成绩50％ ：实验报告
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实验一 实验准备及培养基制备与灭菌
【实验目的】
主要掌握离心机、微量移液器及高压灭菌锅的使用 机及实验操作注意事项
【实验准备内容】
1.实验准备： 器皿清洗、试剂配制、灭菌分装、取用保存 2. 离心机的使用 ①打开离心机电源开关，进入待机状态。 ②选择合适的转头 ③离心管平衡误差应在0.1克以内。 ④选择离心参数：
灭菌的主要因素是温度而不是压力。因此锅内冷空气必须完全排尽，才 能关上排气阀，维持所需压力。
⑤灭菌所需时间到后，切断电源，让灭菌锅内温度自然下降，当压力表 的压力降至“0”时，打开排气阀，旋松螺栓。打开盖子，取出灭菌 物品。
压力一定要降到“0”时，才能打开排气阀，开盖取物。否则就会因 锅内压力突然下降，使容器内的培养基由于内外压力不平衡而冲出瓶 口，造成棉塞沾染培养基而发生污染，甚至灼伤使用者。
⑧然后按吸嘴弹射器除去吸嘴。
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a. 连续可调移液器的取用体积调节要轻缓，严禁超过最大或最小量程； b. 在移液器吸头中含有液体时禁止将移液器水平放置，平时不用时置
移液器于架上； c. 吸取液体时，动作应轻缓，防止液体随气流进入移液器的上部； d. 在吸取不同的液体时，要更换吸头； e. 移液器要进行定期校准，一般由专业人员来进行。
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【思考题】
1.高压蒸气灭菌之前，为什么要将锅内冷空气 排尽？灭菌完毕后，为什么待压力降低到 “0”时才能打开排气阀，开盖取物？
2.移液操作应注意哪些事项？
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【LB培养基的制备及灭菌】
【实验目的】 通过对LB培养基的配制，掌握配制培养 基的一般方法和步骤。
微量移液器的操作步骤： ①将微量移液器装上吸头（不同规格的移液器用不同的吸头） ②将微量移液器按钮轻轻压至第一停点；
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③垂直握持微量移液器，使吸嘴浸入液样面下几毫米，千万不要将吸嘴 直接插到液体底部； ④缓慢、平稳地松开控制按钮，吸上样液。否则液体进入吸嘴太快，导 致液体倒吸入移液器内部，或吸入体积减少； ⑤等一秒钟后将吸嘴提离液面 ⑥平稳地把按钮压到第一停点，再把按钮压至第二停点以排出剩余液体； ⑦提起微量移液器，使吸嘴在容器壁擦过；
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4.手提式高压蒸气灭菌锅的使用及注意事项
①首先将内层锅取出，再向外层锅内加入适量的水，使水面与三角搁 架相平为宜。切物忘记加水，同时加水量不可过少，以防灭菌锅 烧干而引起炸裂事故。
②放入内层锅，并装入待灭菌物品。注意不要装得太挤，以免妨碍蒸 气流通而影响灭菌效果。三角瓶与试管口端均不要与桶壁接触， 以免冷凝水淋湿包口的纸而透入棉塞。
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3
⑤将平衡好的离心管对称放入转头内。盖好转头盖子拧紧螺丝。 ⑥按下离心机盖门，如盖门未盖牢，离心机将不能启动。 ⑦按START键，开始离心。离心开始后（特别是高速离心时）应等离心
速度达到所设的速度时才能离开，一旦发现离心机有异常（如不平 衡而导致机器明显震动，或噪音很大），应立即按STOP键，必要时 直接按电源开关切断电源，停止继续离心，并找出原因。 ⑧机器如发现故障，请及时与有关人员联系。 ⑨使用结束后请清洁转头和离心机腔，不要关闭离心机盖，利于湿气蒸 发。 ⑩使用结束后必须登记，注明使用情况。
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4
离心机的摆放位置
2020/9/30
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5
3. 移液器的使用
移液器是生化与分子生物学实验室常用的小件精密设备，移液器 能否正确是用，直接关系到实验的准确性与重复性，同时关系到 移液器的使用寿命。
移液器由联系可调的机械装置和可替换的吸头组成，不同型号的 移液器吸头有所不同，实验室常用的移液器根据最大吸用量有 20ul, 200ul, 1ml等规格。