细胞损伤模型

细胞损伤模型
一、体外肝细胞损伤模型建立（CCl4和H2O2）
1大鼠肝细胞的分离和培养大鼠4％戊巴比妥麻醉，门静脉插管，先以无钙灌流液灌流，继以37℃通入O2的Ⅳ型胶原酶灌流液继续循环灌流15 min。

将肝脏移至一平皿内，轻轻撕去肝包膜后，加入含5％小牛血清的清洗液，用吸管吹打成单个肝细胞悬液，200目尼龙网过滤，低速离心（500 r·min-1，1 min，4℃）弃上清，同法用清洗液反复洗3次。

然后用完全1640培养液（内含10％小牛血清，105 U·L-1青霉素，100 mg·L-1链霉素和10 mg·L-1胰岛素）制成1×109个·L-1肝细胞悬液。

分离的肝细胞经0.6％台盼蓝拒染法测得细胞活力大于90％，高碘酸雪夫反应显示糖原法鉴定99％为肝实质细胞。

将上述肝细胞悬液分别加入24孔（每孔1 ml）和96孔（每孔0.1 ml）培养板中，置37℃，5％CO2培养箱中培养。

12～16 h后可见肝细胞贴壁于培养板孔底上生长。

2CCl4诱导肝细胞坏死性损伤模型的建立肝细胞培养12 h后，吸弃上清，更换培养液并加入不同浓度的CCl4〔（1～16 mmol·L-1），以少量的二甲亚砜助溶，二甲亚砜终浓度为0.1％（体积分数）〕，作用不同时间（1～12 h）后，收集24孔板中培养上清检测AST，以及肝细胞的MDA含量和GSHpx活性；同步测定96孔板中培养肝细胞的MTT反应。

根据检测结果制备CCl4诱导肝细胞损伤的量效和时效曲线。

选择最造损伤浓度和损伤时间制备肝细胞的损伤模型，同时设溶媒对照组，每组至少设3个复孔。

3H2O2诱导肝细胞坏死性损伤模型的建立同法更换培养液，加入不同浓度的H2O2（0.2～3.2 mmol·L-1），作用不同时间（0.5～4 h）后，收集24孔板中培养上清检测ALT，测定肝细胞的MDA含量；同步测定96孔板中培养肝细胞的MTT反应。

根据检测结果制备H2O2诱导肝细胞损伤的量效和时效曲线，选择最适损伤浓度和损伤时间制备肝细胞的损伤模型，同时设溶媒对照组，每组至少设3
个复孔。

4检测指标
（1）AST、ALT的测定培养的肝细胞经离心（1 800 r·min-1，10 min）后收集上清，按试剂盒说明书步骤测定上清液中AST和(或)ALT活性，结果以U·(106 cell)-1表示。

（2）肝细胞增殖试验采用MTT比色法。

（3）肝细胞谷胱甘肽过氧化物酶（GSHpx）活性的测定先制备GSH标准曲线。

弃肝细胞培养上清，加入0.2％Triton-100水溶液0.5 ml，混匀，2 min后，离心（2 500 r·min-1，10 min），取上清液（肝细胞样品）0.4 ml，另设样品空白管，非酶反应管和试剂空白管，加入各种试剂。

混匀后立即计时，静置12 min后，以样品空白管调零点，于423 nm 波长处读得吸光度（A）值。

在GSH标准曲线上查出对应的GSH波度。

GSHpx酶活力单位是在37℃，pH6.5条件下，每106个肝细胞、
每分钟使GSH浓度下降1 μmol为1个酶活力单位。

计算公式为：GSHpx活力单位=（［GSH］非酶管-［GSH］样品管-［GSH］试剂空白管）/3。

结果以U·(106 cell)-1表示。

（4 ）肝细胞丙二醛（MDA）含量的测定先制备MDA标准曲线。

弃肝细胞培养上清，加入生理盐水1 ml，混匀，移入离心管中，离心（2 500 r·min-1，10 min），弃上清，加15％TCA 2 ml，破坏细胞并沉淀蛋白质，加入0.67％TBA 2 ml，于沸水浴中加热30 min。

根据样本的吸光度值在标准曲线上查出对应的浓度，结果以nmol·(106 cell)-1表示。

（5）数据处理数据以±s表示，计量资料组间比较采用t检验。

两变量间相互关系，采用直线相关和回归分析。

二、体内肝损伤模型（酒精）
1、材料纯系SD雄性大鼠，体重180g～200
g，由浙江大学医学院实验动物中心提供。

食用酒精选用北京酿酒总厂出品的56度红星二锅头。

2、方法将大鼠随机分成5组，饲养在23℃～25℃室内，自由进食、进水；根据大鼠体重，A、B、C、D组每日用56°红星二锅头白酒以10ml/1Kg分别灌胃0、4周、8周和12周；E组于酒精灌胃12周后，停止灌胃4周。

大鼠通过股动脉采血处死，收集血浆和肝脏标本。

3、主要指标检测
（1）肝功能：应用日立7170自动生化分析仪测定总蛋白（TP）、白蛋白（Alb）、球蛋白（Glb）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天冬氨酸氨基转移酶（AST）等。

（2）氧化抗氧化物质测定：采用南京建成生物工程研究所提供的试剂盒分别检测丙二醛（MDA）、谷胱甘肽过氧化酶(GSH-Px)、谷胱甘肽（GSH）、超氧化物歧化酶(SOD)和谷
胱甘肽-S-转移酶（GST）。

（3）大鼠肝脏病理检查：大鼠处死后立即取出肝脏，称重后一部分以10%的福尔马林液固定作病理，作常规石蜡切块并HE染色，在光学显微镜下进行观察，用半定量法分别判定脂肪变性、及酒精性肝炎炎症活动度
三、四氯化碳体外损伤肝细胞模型
原代培养的正常大鼠肝细胞培养24h（贴壁良好）后，置培养皿于一密闭的塑料盒，内置四氯化碳0.4M容积，37度90min，造成肝细胞损伤的模型，后转入正常培养，进行下一步实验。

(即熏蒸法)
肝细胞培养12h后，吸弃上清，更换培养液并加入CCL4 8mM（事先用DMSO溶解，DMSO终浓度1％），作用6h后收集24孔板中培养上清检测AST以及肝细胞MDA含量盒GSHpx活性，评价损伤程度。

（常用方法）
四、醋氨酚体外损伤肝细胞模型
肝细胞培养24h后，用清洗液洗2次，培养液洗1次，然后换以20mM醋氨酚的培养液，继续培养12h，取培养液，进行下一步实验。

五、过氧化氢体外损伤肝细胞模型
肝细胞培养24h后，吸弃上清液，更换培养液并加入H2O2 0.6mM，作用1h后，收集24孔板中的培养上清液检测AST活性和MDA含量。

六、氰化钾缺氧肝细胞损伤模型
肝细胞培养24h后，贴壁生长良好的肝细胞中加入氰化钾2.5mM，继续培养2h，定量检测培养液上清中LDH活性，以及酶的活性反应肝细胞损伤程度。

本模型可以更好的模拟缺氧损伤。

七、硫代乙酰胺（TTA）体外肝细胞损伤模型
肝细胞预培养24h后，贴壁生长良好的肝细胞中加入TTA0.18mM，继续培养48h，肝细胞大量损伤和坏死，上清液中乳酸脱氢酶（LDH）活性升高，造成体外损伤肝细胞模型。

八、内毒素体外损伤肝细胞模型
贴壁生长良好的肝细胞中加入内毒素70uL/mL，置37度，5％CO2培养此时上清LDH活性升高造成肝细胞损伤模型，造成体外肝细胞损伤模型。

九、半乳糖胺（GalN）体外损伤模型
分离肝细胞，预培养12-24h后，待细胞贴壁生长均匀后，加入5mMGalN的肝细胞培养液，继续培养1.5h，测定培养上清液中ALT，ALT 显著升高时，肝细胞造模成功。

十、帕金森体外模型
体外培养的中脑多巴胺能神经元MPTP损伤模型
l实验操作：实验采用胚胎龄14一16天的大鼠，剖子宫取胎，取胎鼠中脑腹侧区。

可将多个胚胎来源的组织收集在一起，置Fl2培养基（Gibco）至35mm的培养皿中，以细剪刀剪碎。

将2ml含0.125％的胰酶的F12加入到组织中，该混合物于37℃孵育10分钟后，加入DNase I（Sigma）至终浓度80ng／m1，继续于37oC孵育10分钟。

消化后的组织以尖端被火抛光的移液管轻轻吹打8次。

该细胞悬液以种植培养基稀释（种植培养基：MEM，补充以2mm谷氨酰胺，6mg/ml葡萄糖，1mg／ml谷胱甘肽，10 units／ml青霉素，10ul/ml链霉素和7.5％胎牛血清）。

细胞然后种植于35mm的预先以10ug／m1 po1y1ysine （Sigma）和 2.5ug／ml merosin（Chemicon）铺底的培养皿中，种植密度为50,000细胞／cm2。

培养16小时后，培养基换为无血清培养基。

该培养基为F12和basa1Eag1e’s medium，补充以33mM
葡萄糖，2mM谷氨酰胺，15 mM碳酸氢钠，10mM HEPES（pH7.0），1ug／ml谷胱甘肽，20ug/ml胰岛素，100ug/ml转铁蛋白，60uM腐胺，20nM孕酮，20nM亚硒酸钠（NaSe），30nM三碘甲状腺原氨酸，0.5 unit/ml青霉素和0.5mg/ml链霉素。

毒物处理：于第4天以1uMMP+处理48小时。

然后进行分析。

模型评价：倒置显微镜下观察细胞形态、细胞计数、免疫组化检测TH阳性细胞的数目和形态。

体外培养的中脑多巴胺能神经元6-OHDA损伤模型
采用上述方法选择胎鼠，分离中脑腹侧部，解剖显微镜下仔细剔除脑膜和血管，用高糖T-BSS 反复冲洗涤之七遍。

并将组织剪碎，移入0.25％胰蛋白酶溶液中，37oC振荡消化30分钟，后加入血清数滴终止消化，用吸管轻轻吹打后，加入不含血清的DMEM培养液混匀，
1000rpm，10min离心收集细胞，反复2次，后加入含血清的完全DMEM培养液悬浮细胞，过220目不锈钢筛网使成单细胞悬液，计数后将约3×106个细胞接种人事先涂有多聚赖氨酸的35mm的六孔培养板中，置37oC、5％CO2培养箱中培养。

24小时后待细胞完全贴壁时，置换旧培养液，以后每隔2天更换一次培养液。

培养至第六天时加入100uM的6-OHDA处理3小时后吸出。

在相应备孔中加入完全DMEM培养液洗涤2遍，再加入完全DMEM培养液继续置5％CO2培养箱中培养24小时，采用与上述相同的方法做免疫细胞化学染色，计数TH阳性细胞，确立6-OHDA对体外培养的多已胺能神经元的损伤作用。

十一、Ａβ损伤模型
取出生1-2d的乳鼠，用麻醉剂处死。

在D-hanks液中取大脑并分离海马组织，胰蛋白酶消化，获得细胞悬液，胎盘蓝染色进行死活细胞记数，将细胞以5×105/ml的密度接种于预先经L-多聚赖氨酸处理的96孔和24孔培
养板,其中24孔板中预先放置有盖玻片。

细胞维持在培养液中，置入5%CO2，饱和湿度的培养箱中培养，24h后全换液，接种当天为第一天,每3d半量更换培养液一次，培养第3天时加入阿糖胞苷,终浓度为10μmol/Ｌ,以抑制神经胶质细胞的过度增殖,24ｈ后更换全部培养液继续培养,第10天进行细胞造模，开始实验。

也可以用PC12细胞株,常规培养
Ａβ产物诱导海马神经细胞，建立细胞模型：
选择Ａβ25-35片段,用三蒸水配制成100μmol??Ｌ-1,过滤,分装,-20℃冻存;使用前老化处理并配制成所需浓度。

（将Ａβ25-35溶解在DMSO中，在用DMEM稀释，置于37℃下孵育7-14天，即为老化状态）。

细胞模型建立:加入浓度为20??mol/L的Ａβ25-35,接触24h,诱导建立AD细胞模型.
检测指标:MTT LDH 凋亡细胞内钙离子以及SOD等
十二、抑郁症的体外模型
抑郁等精神疾患的发生可能与过量GC对海马的选择性损伤有关,但机理不明,Heuser和Cosi等报道可能是由于高浓度GC导致神经营养因子表达水平降低造成的,而抗抑郁剂不仅使GC受体上调,HPA轴反馈恢复正常,而且使神经营养因子表达升高,达到治疗目的.PC12细胞株为大鼠嗜铬细胞克隆化细胞株,分化的PC12细胞有典型的神经细胞特征,其胞膜上GC受体表达丰富[6].本文根据文献方法以高浓度皮质酮(corticosterone)模拟抑郁及焦虑症神经细胞损伤状态
实验操作(MTT法测定细胞存活力)
嗜铬细胞瘤株PC12细胞.用含5%胎牛血清及5%马血清的DMEM培养基(含青霉素钠200kU.L-1,链霉素100mg.L-1pH7.4)调
细胞密度为2x108L-1接种于预先用多聚赖氨酸(0.1g.L-1)处理过的96孔培养板,每孔10LL,放入CO2孵箱,培养3~4d,待细胞长满孔底后即可用于实验.参照文献方法,稍加修改,吸去细胞液换上含有相应浓度药物及0.2mmol.L-1皮质酮的无血清DMEM(对照组不含任何药品),培养48h,吸去培养液,用D2Hanks液洗2遍,每孔加入含0.5g#L-1MTT的无血清DMEM培养4h后吸去培养液,每孔加入10%十二烷基硫酸钠100LL,待蓝色颗粒完全溶解(约12~16h),用多孔扫描分光光度计测定标本在570nm波长处的吸光度(A570nm)值,用于定量反映活细胞数.
十三、125I-UdR致C6胶质瘤细胞损伤的模型
1、材料：125I-UdR购自中科院北京原子能所，放化纯度>95%。

脱氧腺苷（AdR）、脱氧鸟苷（GdR）、脱氧胞苷（CdR）、脱氧尿苷（UdR）均为Sigma公司产品。

2、方法
（1）细胞培养：当癌细胞贴壁生长超过瓶壁的70%，用胰蛋白酶消化30-40s，传代培养。

肿瘤细胞每3-4d传代1次。

在50ml培养瓶中，细胞数达2×106个细胞后，取处于对数生长期的细胞进行细胞存活实验。

（2）细胞存活实验：将制备好的细胞按1×105个/ml细胞接种于25ml的培养瓶中，培养20小时，实验组加入125I-UdR74KBq/ml及不同浓度的AUCG（10μM、20μM、30μM、50μM、80μM）再共同孵育24h后，100倍的倒置显微镜下观察细胞形态，收集细胞，制成单细胞悬液，调整细胞密度，接种于25ml的培养瓶中，2-3d后换液，8-9d后细胞集落形成，每个剂量点设复瓶4瓶，同时设对照组未加AUCG，另设空白组，均为4个复瓶。

计算细胞存活分数，绘制细胞存活曲线。

3、检测方法
（1）采用TEM技术观察凋亡细胞超微结构：上述细胞用3%戊二醛固定后，PBS漂洗，1%锇酸固定1h，经包埋处理，超薄切片，在透射电镜（TEM）下观察细胞超微结构。

（2）琼脂糖凝胶电泳成像：收集加入125I-UdR74KBq/ml+AUCG30μM后培养24h的C6细胞2×105个，2500rpm离心5min，去上清，加入裂解液，重悬细胞后，再加蛋白酶K消化30min，用等体积的平衡酚抽提两次，加入2倍体积的冰乙醇置-20℃2h，离心去上清，以75%的冰乙醇洗涤两次后，加双蒸水溶解DNA，取8μl DNA溶液及上样缓冲液2μl上样稀释，用1.5%的琼脂糖凝胶，电泳40min，将凝胶板在紫外光下，观察照相。

（3）流式细胞分析
十四、内皮细胞损伤模型
1、细胞因子损伤模型
将内皮细胞铺板后待即将单层融合时，换无血清或低血清培养基，加入细胞因子如IL－2，TNF －alpha、IFN等，共同孵育一段时间，或者加入药物与之共孵育，或者加细胞因子之前先加入药物孵育后，再加细胞因子，结束后测一些指标如MTT、LDH、NO、等等看药物对细胞因子损伤的保护作用。

也可采用不同的时间、不同的浓度来观察。

2、缺氧－再供氧损伤模型
也是先将内皮细胞铺板后待即将单层融合时，换无血清或低血清培养基，先将细胞置于95％N2和5％的CO2的混合气的缺氧槽环境中注意保持37度的温度，用耗氧仪持续监测缺氧槽中的氧分压，使之保持在0.5 KP左右，细胞在低氧环境中培养一段时间后在移入正常的培养环境，可观察不同的缺氧时间、不同的给氧时间对内皮细胞形态功能的影响，也可结合药物观察，入上所述。

此外，内皮细胞的损伤模型尚有双氧水损伤模型、氧自由基损伤模型、氧化型脂蛋白损伤模型、等等。

最后提及一点，楼上说的ox-LDL损伤模型的浓度不是很准确，因为从目前国内外的文献来看，oxLDL（10-50ug/ml）的浓度一般不会损伤内皮细胞尤其是内皮细胞系，如ECV304，恰恰相反，的浓度的ox-LDL会促进细胞的增值，国内有人报道，ox-LDL造成ECV304凋亡的浓度一般为150ug/ml~200ug/ml,也有用100g/ml 的。

十五、神经胶质细胞的制备和培养
1）取新生一周内大鼠，碘酒、酒精浸泡消毒后快速断头；
2）用眼科剪和镊剪除皮肤和颅骨，分离皮肤和颅骨时用不同的器具，弯剪剪取部分大脑皮层至60mm培养皿，培养皿内提前放置D-Hanks 溶液；
3）解剖镜下取出脑膜及血管，转移组织至另一盛有D-Hanks溶液的器皿，将组织剪碎为1mm3左右的小块，然后小心转移至带螺帽的离心管内；
4）0.125%胰酶消化15-30分钟，以含10%胎（小）牛血清的DMEM培养基终止消化，巴氏吸管吹打，100目筛网机械过滤，制备混合细胞悬液；
5）计数，调整细胞密度，根据需求按适当密度种植于培养瓶或皿内；
6）放置于含5%CO2的37℃恒温培养箱，2-3天后换液，去除死亡及未贴壁细胞，以后每3-4日换液一次；
7）约两周后当细胞基本铺满时可在培养液中加用二丁酸环腺苷（dBcAMP，0.25mmol/L），该物质被认为有促进细胞分化和抑制小胶质细胞生长等作用；
8）根据细胞生长状况对培养细胞进行传代，多数文献建议用传代3-5次的星形胶质细胞进行实验，但一般不在换液或传代的当天；
少突胶质细胞和小胶质细胞的培养尚需在星形胶质细胞培养基础上进一步纯化，具体可参阅McCarthy和Giulian等的方法。

十六、2型糖尿病大鼠动物模型
1. 高脂＋STZ法：
ＳＤ大鼠购进后,适应环境2周。

随机分为3组:正常对照组、高脂饮食组和高脂饮食+ＳＴＺ组,每组10只。

正常对照组:喂以普通饮食,其中碳水化合物60%,蛋白质22%,脂肪10%,其他8%。

高脂饮食组及糖尿病组:喂以高脂饮食,其中碳水化合物40%,蛋白质13%,脂肪40%,其他7%。

糖尿病组高脂饮食喂养4个月后,一次性腹腔注射ＳＴＺ15ｍｇ(ｋｇ·ｂｗ),其他两
组腹腔注射柠檬酸缓冲液,并继续高脂喂养。

注射ＳＴＺ前及注射后10ｄ,分别测体重(ＢＷ)、空腹血糖(ＦＢＧ)、甘油三脂(ＴＧ)、胆固醇(ＣＨ)、胰岛素(ＦＳＩ),注射前给予口服葡萄糖耐量及胰岛素释放试验:大鼠空腹10～12ｈ,尾静脉取血后(0ｈ),给予葡萄糖2ｇ(ｋｇ·ｂｗ)灌胃,然后0.5、1及2ｈ尾静脉取血,分别测血糖及胰岛素。

2. 脂肪乳＋四氧嘧啶法：
脂肪乳的制备猪油占20 g ,甲基硫氧嘧啶1
g ,胆固醇5 g ,谷氨酸钠1 g ,蔗糖5 g ,果糖
5 g ,吐温80 20 ml ,丙二醇30 ml ,加水定容至100 ml , 配成脂肪乳。

将灌胃脂肪乳10 d 的Wistar 大鼠,腹腔注射四氧嘧啶（两次给药法成模率较高,第一次腹腔注射四氧嘧啶120 mg·kg - 1 ,第二次腹腔注射四氧嘧啶100 mg·kg - 1）。

注射容积为0.2 ml·kg - 1 。