原核蛋白可溶性表达策略及方案
可溶性GST-CRH蛋白原核表达条件的优化及纯化
可溶性GST-CRH 蛋白原核表达条件的优化及纯化郁硕1，陈锋2，刘英富3，霍景瑞2，李光宗2，张益2，丁辉2，樊毫军1△摘要：目的通过谷胱甘肽巯基转移酶（GST ）-促肾上腺皮质激素释放激素（CRH ）原核表达条件的优化及纯化，获得可溶性好、纯度高的重组GST-CRH 蛋白。
方法通过对GST-CRH 转化菌表达温度、菌液密度（OD 600）、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG ）浓度以及诱导时间的摸索，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE ）检测可溶性GST-CRH 蛋白的表达情况，GST 琼脂糖凝胶进行GST-CRH 的纯化，Western Blot 对表达的目的蛋白进一步鉴定。
结果起始OD 6000.8、IPTG 工作浓度0.1mmol/L 、30℃诱导8h 为GST-CRH 最优诱导条件；融合蛋白经Western Blot 鉴定为表达的GST-CRH ，纯化后纯度＞95%。
结论建立了GST-CRH 的原核表达及纯化方法，获得了高纯度的GST-CRH 可溶性蛋白。
关键词：促肾上腺皮质素释放激素；谷胱甘肽巯基转移酶；原核表达；纯化中图分类号：R392-33文献标志码：ADOI ：10.11958/20161302Optimization of prokaryotic expression condition and purification of soluble GST-CRH proteinYU Shuo 1,CHEN Feng 2,LIU Ying-fu 3,HUO Jing-rui 2,LI Guang-zong 2,ZHANG Yi 2,DING Hui 2,FAN Hao-jun 1△1Respiratory Department,the Affiliated Hospital of Xinxiang Medical University,Henan 453000,China;2Institute for Disaster and Emergency Rescue Medicine,the Affiliated Hospital of Logistics University of Chinese People ’s Armed PoliceForce;3Department of Cell Biology,Logistics University of Chinese People ’s Armed Police Force△Corresponding Author E-mail:fanhaojun999@Abstract:Objective To obtain the recombinant corticotropin releasing hormone (CRH)protein with soluble,highpurity protein through optimizing prokaryotic expression condition and purifying glutathione thiol transferase (GST)-CRH protein.MethodsTo detect the expression of soluble CRH protein through grope of the host strain GST-CRH temperatureof induction expression,the host strain concentration (OD 600),IPTG concentration and induction time,the purification of GST-CRH was performed by GST-CRH agarose gel.Western Blot assay was used for the expression identification of the target protein.ResultsThe optimal conditions for the induction of CRH protein were determined:temperature of 30℃,IPTG induced concentration 0.1mmol/L,bacteria density (OD 600)0.8,the induction time of 8hours,purified GST-CRH >95%fusion protein was obtained.ConclusionThe optimal expression conditions of GST-CRH are obtained,and thesoluble protein of high purity GST-CRH is also obtained.Key words:corticotropin-releasing hormone;glutathione s-transferase;prokaryotic expression;purification基金项目：天津市科技计划项目（14ZCDZSY00033）；全军重点实验室开放基金（JY1402）；武警后勤学院附属医院科研平台开放基金（WYFKFM201602、WYKFZ201603）作者单位：1河南新乡医学院附属医院呼吸内科（邮编453000）；2武警后勤学院附属医院救援医学研究所；3武警后勤学院细胞生物学教研室作者简介：郁硕（1988），男，硕士，住院医师，主要从事呼吸与危重症专业方面的研究△通讯作者E-mail ：fanhaojun999@促肾上腺皮质激素释放激素（corticotropinreleasing hormone ，CRH ）能够刺激垂体促肾上腺皮质激素的释放［1］，是下丘脑-垂体-肾上腺轴的主要调节者［2］，在应激反应中发挥着重要的调节作用。
蛋白质可溶性的调控与表达系统的选择
蛋白质可溶性的调控与表达系统的选择蛋白质是生命体中非常重要的一种分子，它们参与了细胞代谢的各个环节，并扮演着结构、信号传递、酶催化等多种重要角色。
在生物制药、基因工程等领域，大量需要生产蛋白质的需求，因此如何实现高效、高产、高纯度的蛋白质制备成为了很多人关注的话题。
蛋白质的可溶性是影响表达量的重要因素之一。
在表达载体中，蛋白质的可溶性受到多种因素的影响，包括蛋白质序列特性、温度、离子强度、pH、氧气含量、分泌效率等等。
若蛋白质处于不可溶性状态，不能在细胞内成功表达，无法用于下游纯化的需求，因此如何实现蛋白质的高度可溶性成为了一项非常有挑战性的任务。
为了提高蛋白质的表达效率及可溶性，人们进行了多种策略的研究。
其中如何选择适合的表达系统成为了一个重要的问题。
在基因工程领域，常用的表达系统包括大肠杆菌、酵母菌、哺乳动物细胞等等。
大肠杆菌是最常被使用的表达系统之一，因为其生长速度快、培养条件容易掌控、生产成本低、存储条件简单等优点。
不过，大肠杆菌的表达质量常常受到多种因素的影响。
一方面，由于培养条件不可避免地会造成蛋白质聚集和沉淀，因此大肠杆菌表达的蛋白质的可溶性常常较低。
为了解决这个问题，人们通常会选择使用特殊的大肠杆菌突变体，在其内部表达具有较高可溶性标签的蛋白质。
或者也可以在大肠杆菌表达完毕后使用特殊的离子交换介质等来进行可溶性的提升。
另一方面，传统的大肠杆菌表达系统往往难以表达复杂的蛋白质。
复杂蛋白质序列含有大量的游离硫酸氨基酸、脱氨基酸较多等特殊结构，使得其表达难度很高。
因此，一些新的大肠杆菌表达系统如T7表达系统、双RNA多样性补体表达载体等的诞生大大缓解了这个问题。
酵母菌在表达可溶性蛋白质方面也表现出了很高的潜力。
酵母菌表达系统包括酿酒酵母和毕赤酵母。
其中毕赤酵母表达系统因为能耐高温、高pH、高盐等多种恶劣环境而受到人们的青睐。
另外，毕赤酵母表达谷氨酰胺合成酶、重组十六烷酰体素生合成酶、融合菌糖神经酰胺合成酶等多种复杂重要酶的记录表现出出色的表达效果。
原核蛋白表达流程
原核蛋白表达是一种常用的蛋白质生产方法，可以通过大肠杆菌等原核细菌表达目标蛋白。
以下是一个典型的原核蛋白表达流程：1. 选择表达系统和载体：选择适合的原核表达系统和载体。
常用的原核表达系统包括大肠杆菌系统（如E.coli），常用的载体包括pET、pGEX等。
2. 构建重组质粒：将目标基因克隆到选定的表达载体上，通常采用限制性内切酶切割和连接方法，确保目标基因正确插入载体。
3. 转化宿主菌：将构建好的重组质粒转化入宿主菌中，一般选择适当的大肠杆菌菌株，如BL21(DE3)等。
4. 培养菌液：将含有重组质粒的宿主菌接种到适当的培养基中，进行菌液的培养。
培养条件可根据所选的菌株和载体进行优化，包括温度、培养时间、培养基成分等。
5. 诱导表达：在适当的生长阶段，向培养基中加入适量的诱导剂，常用的诱导剂包括异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）。
6. 细胞破碎：经过一定时间的表达后，收集培养菌液并将细菌进行破碎，释放目标蛋白。
破碎方法可以选择超声波破碎、高压破碎等。
同时添加适量的蛋白酶抑制剂，避免蛋白质的降解。
7. 蛋白纯化：通过一系列的蛋白纯化步骤，如亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层析等，分离纯化目标蛋白。
此步骤可以根据目标蛋白的特性和需求进行优化。
8. 鉴定和确认：对纯化得到的蛋白进行鉴定和确认，如SDS-PAGE凝胶电泳、Western blot等。
确保表达的目标蛋白符合预期。
9. 储存和应用：将纯化好的目标蛋白进行适当的保存和储存，确保其稳定性和活性。
根据需要，可以进行后续的功能研究、结构分析、制备抗体等应用。
需要注意的是，原核蛋白表达流程可以根据实验目的和具体要求进行调整和优化。
不同的表达系统和载体可能需要适应性调整。
此外，对特定蛋白的表达可能需要进一步优化培养条件和蛋白纯化步骤。
原核表达(原理、材料与实验方案)
原核表达（原理、材料与实验方案）一、原理1、E . coli表达系统E . coli是重要的原核表达体系。
在重组基因转化入E . coli 菌株以后，通过温度的控制，诱导其在宿主菌内表达目的蛋白质，将表达样品进行SDS-PAGE 以检测表达蛋白质。
2、外源基因的诱导表达提高外源基因表达水平的基本手段之一，就是将宿主菌的生长与外源基因的表达分成两个阶段，以减轻宿主菌的负荷。
常用的有温度诱导和药物诱导。
本实验采用异丙基硫代-β-D-半乳糖昔（IPTG）诱导外源基因表达。
不同的表达质粒表达方法并不完全相同，因启动子不同，诱导表达要根据具体情况而定。
二、材料1、诱导表达材料( 1 ) LB （Luria—Bertani）)培养基酵母膏(Yeast extract) 5g 蛋白胨(Peptone) 10gNaCl 10g 琼脂(Agar) 1-2%蒸馏水(Distilled water) 1000ml pH 7.0适用范围：大肠杆菌( 2 ) IPTG 贮备液：2 g IPTG溶于10 mL 蒸馏水中，0 . 22 μm 滤膜过滤除菌，分装成1 mL /份，－20 ℃保存。
( 3 ) l×凝胶电泳加样缓冲液：50 mmol / L Tris -CI ( pH 6 . 8 )50 mmol / L DTT2 % SDS （电泳级）0.1 ％溴酚蓝10 ％甘油2、大肠杆菌包涵体的分离与蛋白纯化材料1 ）酶溶法（1）裂解缓冲液：50 mmol / L Tris-CI ( pH 8 . 0 )1 mmol / L EDTA100 mmol / LNaCI（2）50 mmol / L 苯甲基磺酰氟（PMSF ）。
（3）10 mg / mL 溶菌酶。
（4）脱氧胆酸。
（5）1 mg / mL DNase I。
2 ）超声破碎法( 1 ) TE 缓冲液。
( 2 ) 2×SDS -PAGE 凝胶电泳加样缓冲液：100 mmol / L Tris-HCI ( pH 8 . 0 )100 mmol / L DTT4 %SDS0.2 ％溴酚蓝20 ％甘油三、实验方案1、外源基因的诱导表达( 1 ）用适当的限制性内切核酸酶消化载体DNA 和目的基因。
原核表达策略(200710)
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Solubility tags
Secretion signal
– pelB leader (22 amino acids) – ompT leader (20 amino acids)
Fusion to enzyme which promotes disulfide bonds
Part 1: Choosing a vector and cloning strategy Part 2: Selection of host and optimization of expression Part 3: Maximizing target protein recovery
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Bacterial Protein Expression
Vector
Host
Growth conditions
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Choices for Expression Plasmids
Level of control and expression Antibiotic selection Tag Solubility Protease recognition site Copy number
inNovations 15: 2(2002)
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expression of 8 proteins
1 2 3 4
Lanes: 1 pRSFDuet-1, pACYCDuet-1, pETDuet-1, pCDFDuet-1 combination 2 pCOLADuet-1, pACYCDuet-1, pETDuet-1, pCDFDuet-1 combination 3 Uninduced control 4 Perfect Protein™ Markers
原核表达操作步骤及注意事项
原核表达操作步骤及注意事项时间：2010-03-03 14:05:01 来源：作者：点击：1046次将克隆化基因插入合适载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质的方法一般称为原核表达。
这种方法在蛋白纯化、定位及功能分析等方面都有应用。
大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下特点：易于生长和控制；用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞系统的材料昂贵；有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒可供选择。
但是，在大肠杆菌中表达的蛋白由于缺少修饰和糖基化、磷酸化等翻译后加工，常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性及构象。
表达载体在基因工程中具有十分重要的作用，原核表达载体通常为质粒，典型的表达载体应具有以下几种元件：（1）选择标志的编码序列；（2）可控转录的启动子；（3）转录调控序列(转录终止子，核糖体结合位点)；（4）一个多限制酶切位点接头；（5）宿主体内自主复制的序列。
原核表达一般程序如下：获得目的基因－准备表达载体－将目的基因插入表达载体中（测序验证）－转化表达宿主菌－诱导靶蛋白的表达－表达蛋白的分析－扩增、纯化、进一步检测一、试剂准备1、LB培养基。
2、100mM IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：2.38g IPTG溶于100ml ddH2O中，0.22μm滤膜抽滤，-20℃保存。
二、操作步骤（一）获得目的基因1、通过PCR方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PCR循环获得所需基因片段。
2、通过RT-PCR方法：用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA，以mRNA为模板，逆转录形成cDNA 第一链，以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。
（二）构建重组表达载体1、载体酶切：将表达质粒用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。
2、PCR产物双酶切后回收，在T4DNA连接酶作用下连接入载体。
大规模可溶性蛋白原核表达与纯化步骤
大规模可溶性蛋白纯化实验操作Hao Lab in SII1. 取20 µL E.coli BL21目的菌种加入装有10 ml LB培养基的50 ml离心管中，加入氨苄青霉素(Biobasic inc, #AB0028) 至终浓度为100 µg/ml或硫酸卡那霉素(生工，#0408) 至终浓度为50 µg/ml，37°C, 250 rpm, 摇菌过夜。
2. 取过夜培养的菌液8 ml加入400 ml (1:50) 含有相同浓度抗生素的LB中培养，间断检测菌液OD600值，37°C, 250 rpm, 摇菌大约60~120 min，待其OD600值达到0.6~0.8之间，加入0.4 mM IPTG (碧云天，#ST098), 30°C, 220 rpm, 诱导表达3 h。
3. 收集菌液至50 ml离心管中，7,000 × g, 4°C离心3 min, 弃上清收集沉淀，进行下步实验或置于-80°C冰箱保存。
摇菌用的锥形瓶用84消毒液浸泡或高压灭菌。
4. 将收集到的菌体重悬于20 ml 冰冷的Lysis buffer中，震荡混匀。
以下步骤均置于冰上。
5. 向菌体重悬液加入甘油至终浓度为10%，加入EDTA 至终浓度为0.5 mM，充分混匀。
6. 冰上超声：功率为仪器最大功率的60%，脉冲时间为1 s，间隔时间为1 s，总时间7~15 min。
7. 超声后的蛋白溶液于8,000 × g，4°C离心30 min。
15,000 × g, 4°C离心15 min可省略步骤10。
8. 在步骤7离心的同时。
取下20 ml新层析柱(Qiagen, #34964)的帽子并剪掉底部尖端再盖上帽子，加入混匀的50% NI-NTA beads (Qiagen, #S13-26-36-46; GST beads, GE, #17-0756-01) 悬液2 ml。
蛋白质可溶性问题及其在表达系统中的解决策略
蛋白质可溶性问题及其在表达系统中的解决策略蛋白质是细胞中最重要的生物大分子之一，它们在细胞内发挥着关键的生物学功能。
然而，许多表达系统经常遇到蛋白质可溶性问题，即蛋白质在表达过程中失去了其正常的可溶性结构。
这一问题严重影响了蛋白质功能的研究和应用。
本文将探讨蛋白质可溶性问题的原因以及解决策略。
一、蛋白质可溶性问题的原因1.1 蛋白质序列蛋白质序列在很大程度上决定了其可溶性。
一些蛋白质序列中含有高比例的疏水性氨基酸，这使得蛋白质容易聚集形成不可溶性沉淀。
此外，蛋白质序列中可能存在折叠障碍，导致蛋白质无法正确折叠形成可溶性结构。
1.2 表达条件表达温度、pH值等表达条件的选择也会影响蛋白质的可溶性。
不适当的表达条件可能导致蛋白质的不正常折叠、聚集或失去稳定性，进而降低其可溶性。
二、蛋白质可溶性问题的解决策略2.1 优化蛋白质序列通过对蛋白质序列进行合理的修改和调整，可以提高其可溶性。
一种常用的策略是引入疏水性氨基酸的替代，使蛋白质序列中的疏水性氨基酸比例降低，从而减少其聚集倾向。
此外，可以通过在蛋白质序列中插入构象稳定的序列或结构域，促进蛋白质的正确折叠和稳定。
2.2 调节表达条件合适的表达条件对于蛋白质的可溶性至关重要。
通过调节表达温度、pH值、培养基成分等参数，可以有效提高蛋白质的可溶性。
例如，降低表达温度有助于减缓蛋白质的聚集速度，同时增加蛋白质的折叠时间，有利于蛋白质正确折叠和可溶性的保持。
2.3 使用辅助蛋白质辅助蛋白质在表达系统中的应用可以通过促进蛋白质正确折叠和增强其可溶性来解决可溶性问题。
例如，分子伴侣蛋白可以与目标蛋白结合，提供适当的环境，促进其正常折叠和稳定。
此外，某些蛋白质互作可以通过与其他互补的亚单位结合来增加其可溶性。
2.4 优化翻译后修饰蛋白质的可溶性还受到其翻译后修饰的影响。
通过优化翻译后修饰酶的表达和调节，可以增强蛋白质的可溶性。
例如，合适的糖基化修饰可以提高蛋白质的稳定性和可溶性。
原核表达步骤总结
原核表达步骤总结原核表达步骤原核表达先要将基因克隆到原核表达载体上，然后通过转化到JM109或BL21等菌株中，诱导表达蛋⽩，然后进⾏蛋⽩纯化。
本实验⽅案的前提是，⽬的基因已克隆到载体，并已转进⼊JM109菌株中。
1．鉴定⽬的蛋⽩是否在⼤肠杆菌JM109或BL21中⼤量表达（1）制样1 . 挑取经过双酶切鉴定的单克隆菌落于700ul LB培养基，加⼊0.7ul Amp（100mg/mL），37o C200r/min摇床培养，过夜活化。
2. 以1：50⽐例（200ul），将活化的过夜培养物加⼊10mL LB液体培养基中，加⼊10uLAmp（100mg/ml），37o C200r/min 摇床扩⼤培养2h-3h，期间取样监控菌液的OD值，控制菌液OD600在0.6-1.0之间，以使⼤肠杆菌处于最适合表达外源蛋⽩的⽣长状态。
(⼀般3h时，菌液浓度及达到标准，但是不同的基因对菌的影响不同，所以第⼀次实验时需要确定这个最佳时间)3. 从10ml扩⼤培养物中取3ml菌液作为不加IPTG的空⽩对照（CK），其余7ml菌液加⼊7ul IPTG（储存浓度为0.5mol/l），使IPTG 终浓度达到0.5mmol/l。
以200r/min的转速，37o C摇床培养3h。
4. 以5000r/min离⼼2min收集菌体，倾倒上清，每个离⼼管收集3ml培养物。
5. 加⼊1ml dH2O，将管底沉淀⽤振荡器打散以充分洗涤，8000r/min 离⼼2min，倾倒上清。
6. 重复步骤5。
将离⼼管中的⽔倒⼲净。
（⼆）菌落SDS-PAGE1. 在收集的菌体中加⼊200ul 1×SDS PAGE loading buffer(可根据沉淀的量增加或减少loading buffer的量，⼀般200ul⽐较合适)。
⽤漩涡器剧烈震荡，确保将管底沉淀震散。
2. 将样品于100℃恒温加热器上开盖加热10min（Marker也要加热）。
样品凉后，12000r/min离⼼3min，取每管的上清点样。
(原核)可溶蛋白表达实验服务
（原核）可溶蛋白表达实验服务实验技术服务：原核蛋白表达是指通过基因克隆技术，将外源目的基因，通过构建表达载体并导入表达菌株的方法，使其在特定原核生物或细胞内表达。
这种方法在蛋白纯化、定位及功能分析等方面都有应用。
目前，用于原核表达的主要宿主菌是大肠杆菌。
大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下优点：易于培养，易于生长和控制；可选择多种大肠杆菌菌株及与之匹配的各种表达载体。
【晶莱生物】原核表达系统是迄今为止最为成熟可靠的蛋白表达系统，但是某些特殊的表达载体与宿主菌不相容，也可能会导致目的蛋白无法表达。
或者有时表达出的目的蛋白不可溶。
晶莱生物拥有丰富的蛋白表达经验，能够解决原核蛋白表达过程中的各种困难，在最短的时间内满足客户的蛋白表达需求。
实验描述载体特色：1、携带cspA低温诱导启动子，11度低温诱导，促进蛋白溶解，增加可溶性蛋白几率2、携带SD序列，增加蛋白起始密码子翻译效率3、构建TEE序列，转录增强，增加蛋白表达水平4、AMP抗性筛选载体特色：1、携带cspA低温诱导启动子，11度低温诱导，促进蛋白溶解，增加可溶性蛋白几率2、携带SUMO融合蛋白，形成三级空间结构，有助于蛋白形成正确折叠3、SUMO酶特异性切割融合蛋白，重组蛋白N端无氨基酸残留4、Kan抗性筛选原核蛋白表达纯化服务内容1、靶基因序列设计，密码子优化2、靶蛋白cDNA阅读框的设计和全长基因的合成3、表达载体的构建4、质粒的转化和高表达菌株的筛选5、摇瓶培养，诱导表达6、蛋白的纯化7、蛋白浓度与纯度检测实验流程1、根据实验要求，进行人工合成全基因或克隆靶基因，并亚克隆到原核表达载体中。
最后向客户提供质粒及测序报告。
2、质粒的转化和高表达菌株的筛选，通过SDS-PAGE蛋白电泳结果或者WB检测目的条带3、采用较合理的纯化方案，纯化获得1-3mg左右蛋白4、对蛋白纯度，浓度等检测，按照客户要求进行分装或冻干5、提供实验数据报告1、无污染的含表达载体的重组质粒，最小量不得低于100ng2、原始质粒图谱及序列文件3、插入基因后质粒的商业测序报告4、目标蛋白质相关信息5、其他具体细节要求。
原核表达系统的选择和高效表达策略
大肠杆菌表达系统的几种表达方式
• 融合表达：表达载体的多克隆位点上有一段融合表达标签（Tag）， 表达产物为融合蛋白（有分N端或者C端融合表达），方便后继的纯化 步骤或者检测。对于特别小的分子建议用较大的Tag（如GST）以获 得稳定表达；而一般的基因多选择小Tag以减少对目的蛋白的影响。 His-Tag是最广泛采用的Tag。
• 缺点：
• 大肠杆菌表达体系与其他表达体系相比, 也具有一些缺 • 点: ①高效表达易形成包涵体。②不能进行翻译后的加工
修饰, 如糖基化、磷酸化及酰基化等。
大肠杆菌表达系统的操作流程
大肠杆菌表达系统操作的一般程序如下： 获得目的基因－准备表达载体－将目的
基因插入表达载体中（测序验证）－转化 表达宿主菌－诱导靶蛋白的表达－表达蛋 白的分析－扩增、纯化、进一步检测。
合倾向的中间体的浓度； （4）选择中等强度或低强度的启动子代替强启动子，降低重组蛋白的合
成速度； （5）选择适合的宿主菌株； （6）表达含可溶性多肽或信号肽的重组蛋白，提高可溶性； （7）蛋白质的可溶性往往与自身的氨基酸序列有关，因此可利用诱突
技术改变其氨基酸序列，提高目的蛋白的可溶性； （8）诱导过程中加入化学物质，以增加渗透压或改变培养基的pH值。
大肠杆菌表达系统的基本概念
• 对于做表达来说，如果不是要研究启动子的强弱，通常比较 少关心或者用到报告基因吧。绿色荧光蛋白是最常用的报告 基因了（注意选择适用原核表达版本的GFP），其他还有半 乳糖苷酶，荧光素酶等等。一些融合表达Tag也有报告基因 的功能。 启动子、终止子和核糖体结合位点： 启动子：启动子的强弱是对表达量有决定性影响的因素之 一。从转录模式上看有组成型表达和诱导调控型表达。lac 和Tac，PL和PR，T7是最常用的启动子。
原核蛋白表达上清表达案例
原核蛋白表达（上清表达）案例原核蛋白表达（上清表达）案例1.实验目的以客户提供的目的蛋白基因构建表达载体，通过原核蛋白表达体系获得目的蛋白A。
2.实验设计（1）分析客户提供的目的蛋白序列，设计蛋白表达方案；（2）选择钟鼎特色载体pCzn1，构建表达质粒pCzn1-A；（3）IPTG诱导进行目的蛋白表达，并且优化表达条件，将诱导条件调整至37℃，经分析目标蛋白主要呈可溶形式表达，通过Western Blot检测蛋白A是否表达；（4）通过上清纯化方式，Ni柱亲和纯化获得目的蛋白A，SDS-PAGE检测纯化蛋白纯度，BSA方法测定蛋白浓度。
3.蛋白分析（1）经EditSeq翻译目的蛋白A序列：m.w.=10.66kd，pI=6.64（2）经UniProt匹配，蛋白A物种来源：拟南芥（3）目的基因稀有密码子分析及蛋白结构分析蛋白亲疏水分析蛋白跨膜结构域分析蛋白信号肽预测分析结果：目的蛋白整体呈亲水性、无跨膜结构域、无信号肽序列，可尝试全长表达。
结论：将目的基因构建在钟鼎特色载体pCzn1上，可用于原核表达上清表达，利用载体自带信号肽分泌表达，并在目的蛋白N端添加His标签便于纯化。
4.表达载体构建4.1pCzn1-A质粒酶切验证：4.2 pCzn1-A 质粒测序验证：部分序列比对结果图5.蛋白表达及纯化钟鼎特色载体pCzn1酶切鉴定Marker: 200,500,800,1200,2000,3000,4500 Line1: 酶切前质粒 Line2: 酶切后质粒基因名称：A （OD260/OD280:1.82） 酶切位点：NdeI/XbaI5.实验结论目的蛋白A在IPTG诱导下进行可溶形式表达，蛋白表达成功。
原核表达目的蛋白的方法
原核表达目的蛋白的方法原核表达目的蛋白的方法1. 引言原核表达是一种常用的表达蛋白质的方法，其主要基于原核细胞（如大肠杆菌）的天然表达系统。
通过使用不同的表达载体和相关技术，研究人员可以将目的蛋白质在原核细胞中高效表达，并借此进行产量大、成本低的蛋白质生产。
2. 选择合适的表达载体在原核表达中，选择合适的表达载体是非常重要的。
常见的表达载体有质粒和噬菌体。
质粒表达系统依赖于质粒DNA在细胞内的复制和转录作用，噬菌体表达系统则是通过感染细胞引起的溶菌作用来释放表达产物。
根据需求和实验目的，可以选择适当的表达载体。
3. 选择适当的表达宿主常用的原核表达宿主是大肠杆菌，因其具有较强的表达能力和简单的培养条件。
其他一些菌株如酵母、双歧杆菌等也可以用于原核表达。
根据目的蛋白的特性和表达要求，选择合适的表达宿主。
4. 优化基因序列在进行原核表达之前，需要对目的蛋白的基因序列进行优化。
合成较高优化的核酸序列，包括优化翻译起始子和优化密码子使用。
这样可以提高蛋白质的表达水平和折叠状态。
5. 转化目的蛋白质转化是指将目的蛋白质基因导入表达宿主中的过程。
最常用的方法是通过化学转化或电转化将表达载体导入细胞。
还可以利用病毒、质粒导弹等方法进行转化，具体选择方法取决于实验需求和表达系统。
6. 诱导表达转化后，需要选择适当的诱导方法来激活表达载体中的目的蛋白基因。
常用的诱导剂有异丙基β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）、丝氨酸酶等。
根据表达宿主和表达载体的不同，可选择不同的诱导浓度和诱导时间。
7. 提取和纯化目的蛋白经过表达和诱导后，目的蛋白质可在细胞内或细胞外表达。
具体提取和纯化方法可以根据蛋白质的特性和需求选择，常用的方法包括离心法、柱层析法、亲和层析法等。
8. 评估表达蛋白质的性质和功能通过一系列生化、免疫学、生物学等实验方法，可以对表达蛋白质的性质和功能进行评估。
可以利用SDS-PAGE检测蛋白质的表达水平和相对分子质量。
原核蛋白包涵体表达案例
原核蛋白（包涵体）表达案例
原核蛋白（包涵体）表达案例
1.实验目的
以客户提供的目的蛋白基因构建表达载体，通过原核蛋白表达体系获得目的蛋白A。
2.实验设计
（1）分析客户提供的目的蛋白序列，设计蛋白表达方案；
（2）选择钟鼎特色载体pCzn1，构建表达质粒pCzn1-A；
（3）IPTG诱导进行目的蛋白表达，并且优化表达条件，将诱导条件调整至37℃，经分析目标蛋白主要呈包涵体形式，通过Western Blot检测蛋白A是否表达；（4）通过Ni柱纯化获得目的蛋白A，SDS-PAGE检测纯化蛋白纯度，BSA方法测定蛋白浓度。
3.蛋白分析
（1）经EditSeq翻译目的蛋白A序列：m.w.=23.25kd，pI=5.22
（2）经UniProt匹配，蛋白A物种来源：人类
（3）蛋白性质分析
蛋白亲疏水分析
蛋白跨膜结构域分析
蛋白信号肽预测
分析结果：
目的蛋白整体呈亲水性、无跨膜结构域、无信号肽序列，可尝试全长表达。
结论：将目的基因构建在钟鼎特色载体pCzn1上，利用载体自带信号肽分泌表达。
4.表达载体构建
4.1pCzn1-A质粒酶切验证：
4.2 pCzn1-A 质粒测序验证：
部分序列比对结果图
5. 蛋白表达及纯化
钟鼎特色载体pCzn1 酶切鉴定
Marker: 200,500,800,1200,2000,3000,4500
Line1: 酶切前质粒 Line2: 酶切后质粒
基因名称：A （OD260/OD280:1.82） 酶切位点：NdeI /XhoI
6.实验结论
目的蛋白A在IPTG诱导下进行包涵体形式表达，蛋白表达成功。
StuDl蛋白原核可溶性表达及其IgG抗体检测应用
凝血酶原活化的能 力 为 血 浆 中 的 ３ 对血小板活 ０万 倍。因 而， 力认为是增强的 ， 并有 血 小 板 凝 集 率 增 强 ， 即血小板功能增强 有促凝活性 ） 。Ｈ 及血小板活化 （ Ｓ Ｐ急性期患儿与治疗后的儿 提示治疗 后 血 小 板 凝 聚 力 的 的 童比较出现 ＭＡ 减低 ， Ｃ ｌ减低 ， 改变 。 出现 Ｅ Ｈ Ｓ Ｐ 急性发作 期 患 儿 与 缓 解 组 患 儿 比 较 ， Ｐ Ｌ（ ％） 和Ｌ （ ） 增 大 （ ） ， 提 示 患 儿 存 在 抗 凝 作 用 减 ３ ０％ 犘＜０． ０ ５ Ｈ Ｓ Ｐ ｙ 弱， 认为跟凝血因子消耗有关 ． Ｈ Ｓ Ｐ患儿广泛的微血管内皮损 释放大量组织血小 板 凝 血 致 活 酶 ， 凝血酶能与血栓调节蛋 伤， 结合成 １∶１ 的 复 合 物 后 ， 引起凝血酶大分子特异性 白（ ＴＭ） 进而将蛋白 Ｃ（ 大量激活成 Ａ 改变， Ｐ Ｃ） Ｐ Ｃ， Ａ Ｐ Ｃ 与被凝血酶活 化的凝血因子 Ｖ（ ） 及 Ⅷ（ ） 产生 蛋 白 溶 解 性 降 解 ， 进而 Ｆ Ｖ ａ ＦⅧａ 因而导致 Ｐ 发挥其抗凝作用 ， Ｃ 大 量 消 耗。而 且 Ａ Ｐ Ｃ 还能促 ９］ 进纤维蛋白溶解 ， 以有利于血栓形成部位的血管疏通 ［ 。据 临 常以皮肤 爆 床研究报道 ， Ｐ Ｃ 缺陷患者有明显的血栓形成趋向 ， 发性紫癜为 体 征 ， 表 现 为 皮 下 微 血 管 内 凝 血 现 象， 用浓缩 Ｐ Ｃ １ ０］ 制剂可得到有 效 治 疗 ［ 。在 Ｈ Ｓ Ｐ 中 因 子 Ⅷ 和 因 子 ＦⅧ 是 下 降的 ， 因子 Ⅷ 在钙离子和磷脂的 参 与 下 促 进 Ｘ 因 子 活 化 ， 在形 而因 子 ＦⅧ 随 病 情 变 成内源性凝血活酶过程中被消耗而减少 ， 化而变化 ， 在发病后期 ， 随着受损的血管内皮细胞逐渐修复 ， 因
原核蛋白表达纯化条件优化方案
原核蛋白表达纯化条件优化方案1，收菌每10ml一EP管，弃上清后-40度冻存。
（一）缓冲液PH的确定：2，处理镍柱：（流速控制在30d/min, 5ml注射器）1）用3-5ml去离子水洗柱；2）1ml硫酸镍挂柱；3）3-5ml去离子水洗去余镍；3，取出菌体20管，每4管（40ml）为一组，分为5组。
菌体沉淀置于冰浴中解冻，分别用1ml PH6.0,6.5,7.0,7.5,8.0的PBS重悬，分别超声至澄清。
离心15000rpm,10min，弃沉淀。
4，纯化：4）binding buffer 3ml平衡柱子；5）上样，保留穿透液；6）洗脱，使用100（or200 mM）咪唑洗2个柱体积；7）3-5ml去离子水洗柱，再用另一PH缓冲液重复步骤4）-6）洗柱：先用去离子水洗3-5个柱体积，用EDTA（50mM）洗去NI 3个柱体积，用去离子水洗3-5个柱体积；用NaOH（1M）洗5个柱体积，用去离子水洗3-5个柱体积，用20%乙醇洗3-5个柱体积，封柱于20%乙醇，4度保存；5，结果用SDS-PAGE检测（配小孔15%胶），变性/非变性对比。
找到Trimer含量最高的缓冲液PH，并进行后面的优化。
对照/全菌/各PH穿透/各PH样品。
6，该步骤中选定的缓冲PH固化用于以下纯化、透析、ELISA包被、筛选等各个步骤。
（二）咪唑浓度的选择8，取出新1组，选用上一步骤确定的缓冲液超声；9，上样后分别使用60/80/100/150/200mM咪唑洗脱，每次2个柱体积，10，结果用SDS-PAGE检测（配小孔15%胶），变性电泳，选用含量最高的咪唑浓度作为洗脱条件。
顺序：对照/全菌/穿透/各浓度咪唑洗脱样品；（三）疏水抑制剂的选择11，选用第一步确定PH值的缓冲液，取12组；12，分别在体系中加入咪唑（10/20/40/50mM/L）/脲（<4M/L:1/2/4M/L）/吐温（<1%）/甘油(5%,10%,15%)/tritonX-100(0.1%)/不加；13，重复步骤重复步骤4）-6），使用第二步选定的咪唑浓度洗脱；14，结果用SDS-PAGE检测（配小孔15%胶），非变性电泳。
原核表达及蛋白纯化方法
蛋白原核表达预实验：摸索最适的诱导浓度、诱导温度1. 构建所需要的重组质粒，转化相应的表达菌株（如BL21，Rossetta），挑斑菌液PCR验证。
2. 分别挑取含有重组质粒和空载体的大肠杆菌Rossetta（或BL21）单菌落至5 mL 新鲜的2×YT液体培养基（含100 μg / mL Amp, 50 μg / mL Kan, 34 μg / mL Cm）中，37 ℃摇床，180 rpm 培养过夜，即种子菌。
3. 将过夜种子菌按照1﹕100的比例转接到20 mL 新鲜的2×YT液体培养基（含100 μg / mL Amp, 50 μg / mL Kan, 34 μg / mL Cm）中，37 ℃摇床，180 rpm 培养。
4. 待菌液浓度达到OD600为0.6~0.8时（约3 h），加入IPTG至终浓度为1 mM，37 ℃摇床，180 rpm 培养4~6 h。
（最适的诱导浓度、诱导温度，需要多次实验摸索再确定，不同的表达载体所需的IPTG浓度及温度是不同的）5. 取100 μL菌液，12，000 g 离心2 min，弃上清，用40 μL PBS 悬浮菌体，加入10 μL 5×SDS Loading Buffer，95 ℃变性5 min，记为样品A（总蛋白）。
6. 将剩下的20 mL 菌液离心弃上清，加入2 mL PBS悬浮菌液，其中1 mL 菌液备用，另1 mL 菌液转入1.5 mL 离心管中，12，000 g 离心2 min，弃上清，加入800 μL 超声波反应缓冲液，15% ，超声1 s ，间隔2 s ，反应5 min ，4 ℃，12，000 g 离心2 min，取500 μL 上清，在上清样品中取40 μL 上清加入10 μL 5×SDS Loading Buffer，95 ℃变性5 min，记为样品B（可溶性蛋白）。
7. 沉淀用PBS洗4-5次，以除去沉淀中的可溶性蛋白，用500 μL 裂解缓冲液悬浮沉淀，取40 μL 沉淀，加入10 μL 5×SDS Loading Buffer，95 ℃变性5 min，记为样品C（不可溶蛋白，即包涵体）。
原核蛋白表达方法
原核蛋白表达方法简介：蛋白质是生物体内最基本的分子组成单位，对于生命体的正常功能起着至关重要的作用。
在研究和应用中，为了获得特定的蛋白质产物，科学家们常常需要对目标蛋白进行大量表达。
原核蛋白表达方法是一种常用的蛋白质表达方法，通过利用原核生物体的表达系统，使目标基因在细菌或古细菌中高效表达，从而获得大量目标蛋白。
原核蛋白表达方法的基本流程：1. 选择适当的表达载体：表达载体是原核蛋白表达的基础，一般包括启动子、转录终止子、选择标记等。
常用的表达载体有质粒、噬菌体等。
根据实验需求，选择合适的表达载体进行目标基因的克隆。
2. 转化宿主细胞：将经过重组的表达载体转化至宿主细胞。
常用的宿主细胞有大肠杆菌(E.coli)、酵母菌等。
转化方法可以是热激转化、电转化等。
3. 优化表达条件：调控表达载体的启动子、温度、培养基等条件，以提高目标蛋白的表达水平。
此外，还可以通过添加诱导剂、调整培养时间等方式来优化表达条件。
4. 提取目标蛋白：待细菌或古细菌在培养基中生长一定时间后，收取菌液。
通过离心、破碎细胞壁等方式，将目标蛋白从细菌或古细菌中提取出来。
提取方法可以是化学提取、超声波破碎等。
5. 纯化目标蛋白：通过蛋白质纯化技术，将提取得到的目标蛋白从混合物中分离出来。
纯化方法可以是亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层析等。
6. 验证目标蛋白：通过蛋白质电泳、Western blot等方法对目标蛋白进行验证，确认其纯度和活性。
原核蛋白表达方法的优势：1. 原核生物体生长速度快，表达周期短，可以快速获得目标蛋白。
2. 表达水平高，可以得到较高产量的目标蛋白。
3. 表达系统相对简单，易于操作。
原核蛋白表达方法的应用：1. 科学研究：用于获得特定的蛋白质，以研究其结构、功能和相互作用等。
2. 药物研发：用于大规模合成蛋白药物，如重组蛋白、抗体等。
3. 工业应用：用于生产酶制剂、饲料添加剂等。
原核蛋白表达方法的改进和发展：为了进一步提高原核蛋白表达方法的效率和产量，科学家们不断进行改进和发展。
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原核蛋白可溶性表达策略及实验方案
可溶性表达策略
大肠杆菌根据表达部位的不同可将蛋白表达的形式分为3种：第1种为胞外分泌，即目的蛋白被分泌到培养基中。
这种方式表达的蛋白容易纯化，不易降解，但通常只有少量的蛋白质可以分泌到细胞外；第2种为周质空间表达，这种方式表达的蛋白存在于周质间隙中，外周质的氧化环境有利于蛋白质的正确折叠，在向外周质转移的过程中，信号肽在细胞内剪切，更有可能产生目的蛋白的天然N末端；第3种为胞内表达，这种表达易形成无活性的包涵体，需要经过繁琐的变性、复性过程才能得到有活性的蛋白。
因为多数蛋白不能够进行分泌表达，且表达量较少，所以分泌蛋白表达方法很少被使用；现阶段实验科研中常用的方法是融合型蛋白表达，包括蛋白上清表达和包涵体复性，以上俩种方法均可获得大量的可溶性蛋白。
有关通过蛋白复性获得可溶性蛋白请参见《包涵体蛋白复性的方法操作》，这里主要从条件优化的角度讨论第一种方法。
降低重组蛋白合成的速率
可溶性蛋白的产率取决于蛋白的合成速率，蛋白的折叠速率，以及聚集的速率。
高水平表达时，肽链聚集的速率一旦超过折叠速率，就会形成包涵体。
因此，降低重组蛋白合成的速率有利于提高重组蛋白的可溶性表达。
常用的方法有培养温度的优化、挑选合适的启动子、诱导剂和诱导条件的优化等。
密码子优化
密码子的使用对外源基因的表达水平有重要的影响。
密码子优化就是根据表达系统对密码子的偏好性进行优化筛选。
经过优化的基因序列往往能提高mRNA二级结构的稳定性，有利于新生肽段的正确折叠，提高外源活性蛋白的表达。
值得注意的是，稀有密码子存在通常会对蛋白表达产生负面影响，在转录过程中稀有密码子的位置以及转录的速率都会影响密码子的翻译，但在某些基因中使用稀有密码子则能显著降低肽链的延伸速率。
启动子的选择需要从启动子强度、漏表达程度、诱导性及经济因素等方面考虑。
在胞内表达中，常采用T7、PL等强启动子，表达水平可达菌体总蛋白的70%。
若重组蛋白多以包涵体形式存在，可采用强度较弱的lac等启动子以达到一个与表达能力相匹配的翻译速率。
表达温度的选择
大肠杆菌的最适生长温度在37～39℃之间，但此温度下极易生成包涵体蛋白，降低可溶性蛋白的表达，而低温培养条件下表达外源蛋白能有效地增加可溶蛋白的比例。
由表可知：不同的外源蛋白低温表达时，可溶性蛋白的表达水平有明显提高。
但培养温度有一定下限（8～10℃），在此温度以下，蛋白基本上停止表达。
降低培养温度有利于重组蛋白合成速率的降低，因为蛋白质的合成较慢，新合成的蛋白质会有更充分的时间折叠，增加蛋白的正确折叠率的同时降低重组蛋白的降解速率。
培养基的组成
培养基的组成对可溶外源蛋白的表达有显著影响。
一般情况下，蛋白表达采用合成培养基，但合成培养基往往又存在菌体生长较慢和菌体浓度较低的问题。
外源蛋白的表达显著地受葡萄糖浓度的影响，在诱导表达时期，需尽量保持低水平的葡萄糖，可以用甘油代替葡萄糖作为表达外源蛋白的碳源是解除葡萄糖效应的有效途径之一。
在诱导时期，流加营养物质也有可能显著提高可溶蛋白表达。
考虑以下几点也可以提高可溶性蛋白的表达量：
向培养基中添加蛋白抑制剂也能提高可溶蛋白量；
1.外源蛋白二硫键的形成是一个酶依赖性反应过程，向培养基中添加适量的金属离子，可能提高这些酶类的活性，
因此也能增加可溶蛋白的表达量；
2.某些外源蛋白的活性和稳定性与某些金属离子密切相关，因此向培养基中添加外源蛋白所需金属离子也可能提
高蛋白的可溶性和稳定性；
3.良好的通气能有效降低培养基中对菌体表达蛋白有重要影响的CO2和乙酸的浓度，也有可能获得高产量的活
性蛋白；
4.培养基的pH值也会对可溶蛋白的表达产生重要影响，需要根据菌体和目的蛋白的特点选择合适的pH值。
诱导条件优化
诱导时间和诱导剂的用量也是控制可溶性外源蛋白表达的重要因素。
诱导剂种类及其浓度都会对外源蛋白表达产生重要影响，应根据所采用的表达系统(比如启动子的强弱)和外源蛋白的特点优化选择。
摇瓶培养时，应选用低菌体浓度诱导，因为在低菌浓度下菌体处于对数生长期，生长活跃，有利于表达可溶性蛋白。
然而，如果能保证合理的补料与充分的通气，在较高菌浓度下诱导也同样可能获得可溶蛋白的高效表达。
在某些情况下，诱导剂的流加能显著提高可溶蛋白的表达水平。
与分子伴侣或折叠酶共表达
分子伴侣的功能主要是通过阻止或校正不合理的疏水结合来帮助肽链形成正确的三维结构。
大肠杆菌的分子伴侣是由2个类型的蛋白质构成的，分别是Hsp60蛋白和Hsp10蛋白，二者都包含疏水区域，这些区域可与未折叠或错误折叠的多肽链结合，经过一个依赖ATP的过程帮助蛋白正确折叠。
将几种分子伴侣同时表达,有可能获得比单独使用更好的效果。
需要注意的是，共表达分子伴侣应根据重组蛋白自身的特点进行选择。
还有一个需要考虑的是培养温度，温度可能会对共表达分子伴侣的效果产生重要的影响。
案例介绍——可溶性蛋白条件优化
一、目的蛋白是否表达
1.挑取一单菌落接种于含氨苄(Amp，终浓度为100g/mL)的3mL液体LB培养基中37℃，250rpm培养过夜；
2.将过夜培养菌液以1：100转接于含上述抗生素的100mL液体LB中，37℃，250rpm，
3.5h（大量培养至
OD600＝0.6左右）；
3.取出1mL菌液为未诱导的电泳对照，剩余培养液加入诱导物IPTG至终浓度为1mmol/L，继续振荡培养4h；
4.以未诱导菌液与IPTG诱导后菌液作对比，SDS-PAGE检测。
结果如下：
1：pET-32aA3未诱导
2：pET-32aA3未诱导
3：pET-32aA3诱导后
4：pET-32aA3诱导后
由图可知，目的蛋白经IPTG诱导后明显表达，分子量约为35kd。
二、表达的情况，是可溶还是沉淀
1.将上述的37℃诱导菌液离心（4℃，12000g，5min），弃上清（LB 培养液），沉淀重悬于0.9%NaCl 溶液
洗菌；
2.将重悬于0.9%NaCl 的菌体溶液离心（4℃，12000g，5min），弃
上清（0.9%NaCl 洗菌液），得菌体，称菌体重量，重悬于8mL PBS（pH 7.0）
缓冲液，缓冲液用量根据50~100mg/mL 的菌液终浓度；
3.超声破菌：冰浴条件下，超声波破碎大肠杆菌，超声设置如下功率：
400W，工作：15s，间隔：45s，全程时间：30min（30次左右）以菌液由白变透明，且不粘稠为依据；
4.将超声波破碎的菌液离心（4℃，12000g，15min），分别收集上清和沉淀，各取1mL，加入1mL 2×上样
缓冲液，沸水浴10min，SDS-PAGE 检测。
由上图可知，目标蛋白在上清也有表达，即存在可溶性的表达，但是量很少，大部分也包涵体的形式存在（沉淀中），而包涵体的存在也证明了蛋白表达量很高，上清可溶蛋白的可操作性等因素都优于对包涵体蛋白的分离纯化，所以可通过探索可溶表达条件，最终来加大上清蛋白的含量，以利于下一步实验的进行。
三、探索可溶表达条件
影响包涵体形成的因素有很多，如诱导温度，诱导时间，IPTG 诱导表达浓度，摇床转速等等，所以设定在低IPTG 浓度下（0.1mmol/L），在不同温度，诱导时间下的表达对照：
∙
37℃250rpm 5h ∙
30℃180rpm 10h ∙23℃90rpm 30h
过程：挑取一单菌落接种于含氨苄(Amp，终浓度为100g/mL)的3mL 液体LB 培养基中37℃，250rpm 培养过夜。
将过夜培养菌液以1：100转接于含上述抗生素的50mL+50mL+60mL 液体LB 中，37℃，250rpm，3.5h （大量培养至OD600＝0.6左右）。
从60mL 培养液中取10mL 作为未诱导对照，标记3个50mL LB 培养菌液：
∙
37℃250rpm 5h ∙30℃180rpm 10h
1：pET-32aA3诱导上清
2：pET-32aA3诱导沉淀
∙23℃90rpm30h
都分5次取样：
∙37℃每一小时取样一次（取10mL）编号为：371、372、373、374、375
∙30℃每二小时取样一次（取10mL）编号为：301、302、303、304、305
∙37℃每五小时取样一次（取10mL）编号为：231、232、233、234、235
诱导培养结束后，将上述样品分别破菌离心，得上清与沉淀，加2×上样缓冲液，沸水浴10min，SDS-PAGE检测。
通过实验测定，选取不同温度下的最优可溶表达做比较（234,303,373），结果如下：
1：234上清
2：234沉淀
3：303上清
4：303沉淀
5：373上清
6：373沉淀
最终经过比对，确定23℃条件下，明显的提高了上清目的蛋白的含量，并且存在可溶表达平衡。
20个小时后，蛋白表达将以包涵体的形式存在，即不论如何改变条件，可溶表达已经达到极限。
所以无需探索更低温度等条件。