3无菌检查法(薄膜过滤法)操作程序
无菌检验技术—供试品的无菌检查
• ②过滤 启动蠕动泵，过滤。如采用开放式过滤装置，打开滤器盖，在火 焰旁无菌操作立即将供试液倒入直径约为50m、孔径不大于0.45μm微孔滤膜 的薄膜过滤器中，关闭滤器盖，打开排液架阀门，启动真空泵进行减压抽滤 ，滤干。 • ③冲洗 用灭菌0.9%氯化钠溶液或其他适宜的溶剂照上述操作冲洗滤膜不 得少于3次，每次100ml。冲洗次数应由验证试验确定，至阳性对照菌正常生 长。 • 大容量非抗菌作用的供试品，薄膜过滤后，无须冲洗。 •
• (4)培养及观察 培养期间应逐日观察并记录是否有菌生长、填写检查记 录表，阳性对照管培养24后应有菌生长。如加入供试品后的培养基在培养过 程中出现浑浊培养14日后，不能从外观上判断有微生物生长，可取该培养液 适量接种于同种新鲜培养基中或斜面上，继续培养，细菌培养48h，真菌培 养72h，观察是否再现浑浊成斜面上有无菌生长；或用接种环取培养液涂片 ，染色，显微镜下镜检，进行判断是否有菌。 • (5)结果判定 当阳性对照管浑浊并确定有菌生长，阴性对照管无菌生长 时，方可据所观察到的结果判定。 • 若供试品管均澄清，或虽显浑浊但经确证无菌生长，判断供试品符合规定 • 若供试品管中任何一管显浑浊并确证有菌生长，判供试品不符合规定，除 非能充分证明试验结果无效即生长的微生物非供试品所含。
• 4.3阳性对照 • 应根据供试品特性选择阳性对照菌：无抑菌作用(如维生素B12注射液)及 抗革兰阳性菌(如青霉素钠注射剂)为主的供试品，以金黄色葡萄球菌为对照 菌：抗革兰阴性菌为主的供试品以大肠埃希菌为对照菌；抗厌氧菌的供试品 ，以生孢梭菌为对照菌;抗真菌的供试品，以白色念珠菌为对照菌。阳性对 照试验的菌液制备同方法验证试验，加菌量小于100cfu，供试品用量同供试 品无菌检查每份培养基接种的样品量。阳性对照管培养48～72h应生长良好 。
无菌检查法
附录ⅩⅢB 无菌检查法无菌检查法系用于检查药典要求无菌的药品、医疗器具、原料、辅料、及其他品种是否无菌的一种方法。
若供试品符合无菌检查法的规定,仅表明了供试品在该检验条件下未发现微生物污染。
无菌检查应在环境洁净度10 000 级下的局部洁净度100 级的单向流空气区域内或隔离系统中进行，其全过程应严格遵守无菌操作，防止微生物污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。
单向流空气区、工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行洁净度验证。
隔离系统应按相关的要求进行验证，其内部环境的洁净度须符合无菌检查的要求。
日常检验还需对试验环境进行监控。
无菌检查人员必须具备微生物专业知识，并经过无菌技术的培训。
培养基培养基的制备及培养条件培养基可按以下处方制备，亦可使用按该处方生产的符合规定的脱水培养基。
配制后应采用验证合格的灭菌程序灭菌。
制备好的培养基应保存在 2 ℃～25 ℃、避光的环境，若保存于非密闭容器中，一般在三周内使用；若保存于密闭容器中，一般可在一年内使用。
1. 硫乙醇酸盐流体培养基酪胨(胰酶水解) 15.0g 酵母浸出粉 5.0g葡萄糖 5.0g 氯化钠 2.5gL-胱氨酸0.5g 新配制的0.1% 刃天青溶液 1.0 ml硫乙醇酸钠0.5g 琼脂0.75g(或硫乙醇酸) （0.3 ml) 水1000 ml除葡萄糖和刃天青溶液外，取上述成分混合，微温溶解，调节pH 为弱碱性，煮沸，滤清，加入葡萄糖和刃天青溶液，摇匀，调节pH 值使灭菌后为7.1 ± 0.2 。
分装至适宜的容器中，其装量与容器高度的比例应符合培养结束后培养基氧化层（粉红色）不超过培养基深度的1/2 。
灭菌。
在供试品接种前，培养基氧化层的高度不得超过培养基深度的1/5 ，否则，须经100 ℃水浴加热至粉红色消失（不超过20 分钟），迅速冷却，只限加热一次，并防止被污染。
无菌检查标准操作规程
无菌检查标准操作规程无菌检查法是检查要求无菌的药品、医疗器具、原料、辅料及要求无菌的其他物品是否染有活菌的一种方法。
事实上，若供试品符合无菌检查法的规定，仅表明了供试品在该检验条件下未发现细菌和真菌污染。
无菌检查法有薄膜过滤法、直接接种法两种方式。
细菌培养温度32.5℃±2.5℃，真菌培养温度25.5℃±2.5℃。
1 无菌检查的环境无菌检查的所有操作均需在严格控制微生物污染的环境下进行，操作环境的无菌保证程度将直接影响无菌检查用洁净室（区）环境的稳定性，确保检查结果的可考性，对洁净室（区）的环境质量采取合理的控制措施和评价方法是必要的。
无菌检查应在环境洁净度10000级和局部洁净度100级的单向留空气区域内或隔离系统中进行，其全过程笔削严格遵守无菌操作，防止微生物污染。
单向流空气区、工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行洁净度验证。
隔离系统按相关的要求进行验证，其内部环境的洁净度须符合无菌检查的要求。
无菌室应采光良好、避免潮湿、远离厕所及污染区。
面积一般不超过10m2，不小于5m2；高度不超过2.4m。
由1～2个缓冲间、操作间组成（操作间和缓冲间的门不应直对），操作间与缓冲间之间应具备灭菌功能的样品传递箱。
在缓冲间内应有洗手盆、毛巾、无菌衣裤放置架及挂钩、拖鞋等，不应放置培养箱和其他杂物；无菌室内应六面光滑平整，能耐受清洗消毒。
墙壁与地面、天花板连接处应呈凹弧形，无缝隙，不留死角。
操作间内不应安装下水道。
无菌操作室应具有空气除菌过滤的单向流空气装置，操作区洁净度100级或放置同等级别的超净工作台，室内温度控制18～26℃，相对湿度45%～65%。
缓冲间及操作室内均应设置能达到空气消毒效果的紫外灯或其他适宜的消毒装置，空气洁净级别不同的相邻房间之间的静压差应大于5Pa，洁净室（区）与室外大气的静压差大于10Pa。
无菌室内的照明灯应嵌装在天花板内，室内光照应分布均匀，光照度不低于300lx。
微生物限度检查方法薄膜过滤法验证方案
微生物限度检查方法薄膜过滤法验证方案 Document number【SA80SAB-SAA9SYT-SAATC-SA6UT-SA18】微生物限度检查方法(薄膜过滤法)验证方案微生物限度检查方法(薄膜过滤法) 验证方案编码：表一、验证方案的起草与批准1.验证方案起草起草人：起草时期：年月日2.验证小组成员：3.验证方案审核4.验证方案批准批准人：批准日期：二、验证方案1.验证目的和原理验证目的为确认所采用的方法适合于该药品的细菌、霉菌、酵母菌数的测定，特制定本方案。
验证过程应严格按照本方案规定的内容进行，若因特殊原因确需要变更时，应报验证委员会批准。
原理通过比较试验4组中试验菌的恢复生长结果来评价整个检验方法的准确性、有效性和重现性。
2.验证方法步骤验证前的准备：进行微生物限度检查方法（薄膜过滤法）验证前，所有的平皿和稀释剂都应该严格按照相关的灭菌程序消毒，以确保其对试验的结果没有影响。
试验菌应包括G—、G+、酵母菌和霉菌类微生物以基本覆盖样品中可能存在的微生物。
验证试验的操作计划：用3个不同批号产品微生物限度检测方法进行平行试验，通过计算回收率来判断限度检查方法是否对产品有影响。
试验结果可接受标准：用标准菌株评价方法“”的微生物限度检查对检品中微生物的抑制性，试验结果应显示3次独立的平行试验中，稀释剂对照组的菌回收率应不小于70%，试验组回收率也不低于70%。
3.试验实施试验前的准备3.1.1主要仪器设备：恒温培养箱、生化培养箱、电子天平、高压蒸汽灭菌器、净化工作台。
3.1.2操作环境：操作间应该安装空气除菌过滤层装置。
环境洁净度不应低于10000级，局部洁净度为100级（或放置同等级净化工作台）。
操作间或净化工作台的洁净空气应该保持对环境形成正压，不低于。
3.1.3试验样品：批号：批号：批号：3.1.4培养基：3.1.5稀释液：无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液以上经115℃高压蒸汽灭菌30min。
3.1.6验证用微生物名称及其编号实验菌株的来源：编号由菌名首字母—传代代数—制备日期组成。
无菌检查(薄膜过滤法)SOP
无菌检查SOP（薄膜过滤法）1.目的为规范无菌检查方法及无菌检查全过程的操作，最大限度防止试验操作过程造成的污染，确保结果准确。
2.范围本SOP适用于生物制品的中间产品（包括原液、纯化产物、半成品、生产中的液体、辅料等）、成品的无菌检查。
只要供试品性状允许，应采用薄膜过滤法。
3.定义无菌检查法系用于检查药典要求无菌的生物制品、医疗器具、原料、辅料及其他品种是否无菌的一种方法。
若供试品符合无菌检查法的规定，仅表明了供试品在该检验条件下未发现微生物污染。
4.职责4.1.QC负责本规程的起草、修订、培训及执行；4.2.QA、QC组长、质量管理部经理负责本规程的审核；4.3.质量总监负责批准本规程；4.4.QA负责本规程执行的监督。
5.引用标准《中华人民共和国药典》2020年版三部6.材料6.1.无菌检查用物品、物料要求：所有物品、物料进入无菌室前，均应经过高压蒸汽灭菌（121℃40分钟，放灭菌指示卡）或180℃干烤2小时或其它经过验证的方法消毒后传入无菌室；如不能用前者消毒方式消毒的物品，须经消毒液浸泡、擦拭后传入无菌室。
6.2.无菌检查环境要求：应在环境洁净度万级下的局部洁净度百级的单向流空气区域内或隔离系统中进行，其全过程应严格遵守无菌操作，防止微生物污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。
6.3.仪器、设备与设施集菌仪、显微镜、台式灭菌器、无菌试验室（万级）、超净工作台（万级背景下的局部百级）：每月环境检测（沉降菌、浮游菌、尘埃粒子）合格后，方可使用。
20-25℃培养房或培养箱、30-35℃培养房或培养箱。
6.4.试验用具：洁净工作服（洁净底服、十万级工作服、万级工作服、鞋套）、工作鞋、口罩及帽子；无菌医用手套或一次性乳胶医用手套：试验前及试验过程中用消毒液浸泡消毒；封闭式集菌培养器（双针头、三联及单针头、三联）：薄膜孔径不大于0.45μm，直径约为 50mm。
根据供试品及其溶剂的特性选择滤膜材质。
微生物限度检查方法(薄膜过滤法)验证方案
微生物限度检查方法(薄膜过滤法)验证方案微生物限度检查方法(薄膜过滤法) 验证方案编码：表一、验证方案的起草与批准1.验证方案起草起草人：起草时期：年月日2.验证小组成员：3.验证方案审核4.验证方案批准批准人：批准日期：二、验证方案1.验证目的和原理验证目的为确认所采用的方法适合于该药品的细菌、霉菌、酵母菌数的测定，特制定本方案。
验证过程应严格按照本方案规定的内容进行，若因特殊原因确需要变更时，应报验证委员会批准。
原理通过比较试验4组中试验菌的恢复生长结果来评价整个检验方法的准确性、有效性和重现性。
2.验证方法步骤验证前的准备：进行微生物限度检查方法（薄膜过滤法）验证前，所有的平皿和稀释剂都应该严格按照相关的灭菌程序消毒，以确保其对试验的结果没有影响。
试验菌应包括G—、G+、酵母菌和霉菌类微生物以基本覆盖样品中可能存在的微生物。
验证试验的操作计划：用3个不同批号产品微生物限度检测方法进行平行试验，通过计算回收率来判断限度检查方法是否对产品有影响。
试验结果可接受标准：用标准菌株评价方法“”的微生物限度检查对检品中微生物的抑制性，试验结果应显示3次独立的平行试验中，稀释剂对照组的菌回收率应不小于70%，试验组回收率也不低于70%。
3.试验实施试验前的准备3.1.1主要仪器设备：恒温培养箱、生化培养箱、电子天平、高压蒸汽灭菌器、净化工作台。
3.1.2操作环境：操作间应该安装空气除菌过滤层装置。
环境洁净度不应低于10000级，局部洁净度为100级（或放置同等级净化工作台）。
操作间或净化工作台的洁净空气应该保持对环境形成正压，不低于。
3.1.3试验样品：批号：批号：批号：3.1.4培养基：3.1.5稀释液：无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液以上经115℃高压蒸汽灭菌30min。
3.1.6验证用微生物名称及其编号实验菌株的来源：编号由菌名首字母—传代代数—制备日期组成。
3.1.7器具：无菌薄膜过滤器：（孔径直径50mm）、无菌移液管（5ml）4.验证方法菌液的制备将大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌接种至10ml的无菌营养肉汤中在30～35℃下培养18～24小时，将白色念珠菌接种至改良马丁液体培养基中，在23～28℃下培养24～48小时。
无菌检测薄膜过滤法的操作流程
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无菌检查法标准操作规程
将废液和实验物品及已操作完毕的含培养基的集菌培养器等移至 传递窗并拿出，擦拭工作台面，检查电源是否关闭，是否有遗留物品 等。按照《人员进出实验室的净化更衣规程》脱掉无菌服并装入配套 的袋中，开启无菌室紫外灯半小时，将无菌服送至特定的洗衣机进行 清洗灭菌。实验完毕的样品按照《检验用样品管理规程》进行销毁处 理。 4.1.4阳性对照
关闭紫外灯10分钟后，进入缓冲间，按照《人员进出实验室的净化 更衣规程》进入，并按照此规程穿戴无菌服、口罩。
4.操作
4.1薄膜过滤法 4.1.1操作前准备
检查无菌室电源和仪器是否完好，标示状态卡是否正确，是否有前 次遗留物品及废液等，戴上无菌手套将供试品及所需物品移入无菌操作 室，开启超净工作台并擦拭工作台面。 4.1.2操作 4.1.2.1根据药液性质选用不同型号的培养器，对于普通药液选用型号
菌检查法的要求。 （2）回顾无菌试验过程，发现有可能引起微生物污染的因素。 （3）供试品管中生长的微生物经鉴定后，确证是因无菌试验中所
使用的物品和（或）无菌操作技术不当引起的。 试验若经确认无效，应重试。重试时，必须重新取同量供试品，依
法重试，若无菌生长，判供试品符合规定；若有菌生长，判供试品不符 合规定。
否无菌的一种方法。若供试品符合无菌检查法的规定,仅表明了供试品 在该检验条件下未发现微生物污染。无菌检查法包括薄膜过滤法和直接 接种法。 1.2 检验数量
指一次检验所用供试品最小包装容器的数量。除另有规定外，按表 1规定的最少检验数量进行，最少检验数量不包括阳性对照试验的供试 品用量。采用薄膜过滤法，应增加1/2的最小检验数量做阳性对照用； 采用直接接种法，增加每个培养基容器接种的样品量作为阳性对照用。
无菌检查方法(薄膜过滤法)中常见问题
无菌检查方法（薄膜过滤法）中常见问题按照2020年版《中华人民共和国药典》规定，只要供试品性状允许，包括能直接过滤或者经过处理后能过滤的供试品，应采用薄膜过滤法进行无菌检查。
采用薄膜过滤法，可将药物抗菌成分去除，细菌等其他微生物则会遗留在过滤器，对其培养促使生长和繁殖，以此定性或定量检测微生物。
1常见问题及分析1.1供试品溶解不彻底固体注射剂（如密封瓶粉针剂）无菌检查时需要溶解、转移、稀释后再采用薄膜过滤法过渡，在溶解稀释的过程中，溶剂和稀释液的种类、比例和振荡器的使用等因素都会直接影响到供试品的溶解过滤效果。
2020年版中国药典四部无菌检查法中收载的稀释液有0.1%无菌蛋白陈水溶液、pH7.0无菌氯化钠-蛋白腺缓冲液、0.9%的无菌氯化钠溶液，试验研究结果表明，用前两种溶液做稀释剂，其微生物的回收率远高于0∙9%的无菌氯化钠溶液。
如果供试品溶解不彻底，过滤时滤膜会吸附大量供试品，被滤膜吸附的供试品虽经反复冲洗仍不能去除干净，残留在滤膜上的供试品会导致阳性菌不能在规定的条件下生长。
1.2集菌培养器选择不当为了避免操作过程带来的人为污染和人为偏差，大部分实验室会优先选择用一次性全封闭集菌培养器对供试品溶液进行过滤。
全封闭集菌培养器的滤膜材质、孔径及其与检品的相容性是影响试验结果的关键因素。
选择滤膜材质时应保证供试品及其溶剂不影响微生物的充分截留效果，即部分注射剂具有抑菌性，在过滤时易被滤膜吸附，须采用疏水性边缘及低吸附的滤膜，如可选用尼龙膜材质的集菌器。
无菌检查用的薄膜过滤器的淀膜孔径应不大于0.45 μm,该孔径流膜能有效截留微生物。
每片淀膜的总过滤量不宜过大，以避免淀膜上的微生物受损。
目前市面上销售的一次性全封闭集菌培养器的品牌、型号、规格众多，适用的产品类型也不相同。
如某企业生产的集菌培养器：安甑瓶装药液可选用加长型取样针，无需将样品额外转移，可快速转移检品；西林瓶装粉剂可选用双针座设计，提供全封闭溶解方案，实现溶解、过滤、冲洗一体化操作，避免转移操作；需稀释的西林瓶装抑菌性粉剂可选用三针座设计，溶解、稀释、过滤、冲洗一体化操作，降低抑菌成分浓度，减少吸附。
无菌检查记录(薄膜过滤法)
品名：生产单位：批号：亚批号：规格：剂型：1.检验依据：《中华人民共和国药典》2015年版三部□本企业注册标准□其它：□2.检验方法：薄膜过滤法3.操作规程：SOP-04-13-4501《无菌检查SOP》4.判定标准：4.1 试验成立条件：阳性对照应生长良好，阴性对照不得有菌生长。
否则，试验无效。
4.2 供试品应澄清，或虽显浑浊但经确证无菌生长，判供试品符合规定；若供试品中任何一管显浑浊并确证有菌生长，判供试品不符合规定。
5.检验操作5.1供试品无菌检查5.1.1 材料及设施仪器5.1.1.1培养基及稀释液5.1.1.2设施品名：批号：5.1.1.3仪器5.1.1.4耗材5.1.2实验步骤5.1.2.1试验前环境检查5.1.2.1.1洁净室试验条件：温度18℃～26℃，湿度45％～65％，压差≥10Pa 是□否□5.1.2.1.2操作间工作台面是否有与本次操作无关的物品是□否□确认人：确认日期：5.1.2.2操作步骤品名：批号：5.1.2.3试验后清场5.1.2.4环境监测结果5.1.2.5 培养及观察：“-”表示无菌生长，“+”表示有菌生长无菌检查记录（薄膜过滤法）品名：批号：5.1.2.6结果：品名：批号：5.2阳性菌试验5.2.1 材料及设施仪器5.2.1.1 菌株5.2.1.2设施5.2.1.3 仪器5.2.2实验步骤5.2.2.1试验前环境检查5.2.2.1.1洁净室试验条件：温度18℃～26℃，湿度45％～65％，压差≥10Pa是□否□5.2.2.1.2 操作间内工作台面是否清除与本次操作无关的物品是□否□确认人：确认日期：品名：批号：5.2.2.2 操作步骤操作间：微生物限度区阳性菌室操作间编号：27145.2.2.3试验后清场品名：批号：5.2.2.4培养及观察：“-”表示无菌生长，“+”表示阳性菌生长。
5.2.2.5 结果：6.结论：结果符合规定□结果不符合规定□检验人：检验日期：复核人：复核日期：。
无菌检查标准操作规程
无菌检查标准操作规程1 目的明确无菌检查法的过程，保证产品质量。
2 适用范围使用薄膜过滤法或直接接种法，检查要求无菌的产品及其原、辅料等是否无菌。
3 定义无。
4 职责与权限检验员：按本标准判定产品质量并出具报告。
负责人：监督执行情况，审批最终结果。
5 内容及流程5.1 实验说明5.1.1 TSB为“胰酪大豆胨液体培养基”。
5.1.2 所用材料及用具（待检品、菌株除外）应经过灭菌处理；检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。
5.1.3 直接接种法适用于无法用薄膜过滤法进行无菌检查的供试品。
5.2 检验量最少检验量（生物制品原液或半成品）：每个容器（每个容器制品）的取样量为总量的0.1%或不少于10mL，每开瓶一次，应如上法抽验。
5.3 实验材料与用具5.3.1 待检品（供试品）。
5.3.2 菌悬液（浓度≤100cfu/mL）：应根据供试品特性选择阳性对照菌。
①无抑菌作用及抗革兰阳性菌为主的供试品，以金黄色葡萄球菌作对照；②抗革兰阴性菌为主的供试品，以大肠埃希菌作对照；③抗厌氧菌的供试品，以生孢梭菌作对照；④抗真菌的供试品，以白色念珠菌作对照。
5.3.3 薄膜过滤法：无菌封闭式薄膜过滤器、无菌滤膜（孔径≤0.45μm，直径约50mm）、pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、硫乙醇酸盐流体培养基（400mL/瓶）、TSB培养基（400mL/瓶）、无菌吸头、移液器。
5.3.4 直接接种法：0.9%无菌氯化钠溶液、硫乙醇酸盐流体培养基（15mL/支）、TSB培养基（10mL/支）、无菌吸头、移液器。
5.4 薄膜过滤法5.4.1 供试品处理：打开包装前，先用75%乙醇对供试品容器表面进行彻底消毒，再以无菌操作拆开每个包装。
如有需要可将供试品混合不少于100mL的稀释液中再进行操作。
5.4.2 润湿：取10mL pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液注入滤筒，过滤，使整个滤膜表面湿润。
无菌检查法实训报告总结
一、实训背景无菌检查法是确保药品、生物制品、医疗器械等产品质量和安全的重要手段。
为了提高我们对无菌检查法的认识和操作技能，我们参加了无菌检查法的实训。
本次实训以《中国药典》中的无菌检查法为主要内容，通过实际操作，加深了对无菌检查法的理解和掌握。
二、实训内容1. 无菌检查法的基本原理无菌检查法是通过检测供试品中的微生物数量，判断供试品是否符合无菌要求的一种方法。
其主要原理是利用培养基中的微生物在适宜条件下生长繁殖，通过观察培养基中的菌落生长情况，判断供试品中是否存在微生物。
2. 无菌检查法的操作步骤（1）培养基的选用和制备：根据《中国药典》的规定，我们选择了硫乙醇酸盐流体培养基和胰酪大豆胨培养基。
按照培养基的制备方法，将培养基溶解、调pH、分装、灭菌，确保培养基的无菌性。
（2）培养基的适用性检查：随机取不少于5支培养基，在规定温度下培养14天，观察培养基是否无菌生长。
同时，对菌种进行传代次数和保藏技术的检查，确保菌种的生物学特性。
（3）方法适应性试验：对供试品进行无菌检查法的方法适应性试验，确定最佳的操作条件。
（4）供试品的无菌检查：根据供试品的性质，选择薄膜过滤法或直接接种法进行无菌检查。
同时，设置阳性对照和阴性对照，确保检查结果的准确性。
3. 无菌检查法的注意事项（1）无菌操作：在整个无菌检查过程中，应严格遵守无菌操作规程，防止微生物污染。
（2）环境监测：定期对试验环境进行监测，确保环境符合无菌检查的要求。
（3）培养基的保存：制备好的培养基应置于无菌密闭容器中，在适宜的温度下保存，并在经验证的保存期内使用。
三、实训收获1. 提高了无菌操作技能：通过实训，我们掌握了无菌检查法的操作步骤，提高了无菌操作技能。
2. 加深了对无菌检查法的理解：通过实际操作，我们对无菌检查法的原理、操作步骤和注意事项有了更深入的理解。
3. 增强了团队协作能力：在实训过程中，我们学会了与他人协作，共同完成任务，提高了团队协作能力。
无菌检查法标准
⽆菌检查法标准⽆菌检查法标准操作程序1⽬的建⽴⼀个⽆菌检查法标准操作程序，保证实验的准确性、可靠性。
2范围适⽤于原料、辅料及成品的⽆菌检查。
3职责微⽣物检验员遵照执⾏。
4内容⽆菌检查法系⽤于检查药典要求⽆菌的药品、⽣物制品、医疗器具、原料、辅料及其他品种是否⽆菌的⼀种⽅法。
若供试品符合⽆菌检查法的规定，仅表明了供试品在该检验条件下未发现微⽣物污染。
⽆菌检查应在⽆菌条件下进⾏，试验环境必须达到⽆菌检查的要求，检验全过程应严格遵守⽆菌操作，防⽌微⽣物污染，防⽌污染的措施不得影响供试品中微⽣物的检出。
单向流空⽓区、⼯作台⾯及环境应定期按医药⼯业洁净室（区）悬浮粒⼦、浮游菌和沉降菌的测试⽅法的现⾏国家标准进⾏洁净度确认。
隔离系统应定期按相关的要求进⾏验证，其内部环境的洁净度须符合⽆菌检查的要求。
⽇常检验还需对试验环境进⾏监控。
4.1 培养基硫⼄醇酸盐流体培养基主要⽤于厌氧菌的培养，也可⽤于需氧菌的培养；胰酪⼤⾖胨液体培养基⽤于真菌和需氧菌的培养。
4.1.1 培养基的制备及培养条件培养基可按以下处⽅制备，亦可使⽤按该处⽅⽣产的符合规定的脱⽔培养基或成品培养基。
配制后应采⽤验证合格的灭菌程序灭菌。
制备好的培养基应保存在2?25°C、避光的环境，若保存于⾮密闭容器中，⼀般在3 周内使⽤；若保存于密闭容器中，⼀般可在⼀年内使⽤。
4.1.1.1 硫⼄酵酸盐流体培养基胰酪胨15. 0g 氯化钠2. 5g酵母浸出粉 5. 0g 新配制的0.1 % 刃天⽆⽔葡萄糖 5.0g 青溶液1.0mlL-胱氨酸0. 5g 琼脂0. 75g硫⼄醇酸钠0.5g ⽔1000ml(或硫⼄醇酸）（0.3ml)除葡萄糖和刃天青溶液外，取上述成分混合，微温溶解，调节p H 为弱碱性，煮沸，滤清，加⼊葡萄糖和刃天青溶液，摇匀，调节p H , 使灭菌后在25℃的p H 值为7.1 ⼟0.2。
分装⾄适宜的容器中，其装量与容器⾼度的⽐例应符合培养结束后培养基氧化层（粉红⾊)不超过培养基深度的1/2。
无菌检查法药品无菌检查规程
无菌检查法药品无菌检查规程一、目的：阐述无菌检查规程。
二、适用范围：适用于无菌检查规程。
三、责任者：品控部。
四、正文：1 概述无菌检查是检查药品、敷料、缝合线、无菌器具及适用于中国兽药典要求无菌检查的其它品种是否染有活菌的一种方法。
无菌检查的操作环境和全部过程应严格遵守无菌操作。
该检查法根据供试品有无抑菌作用而采用薄膜过滤法或直接接种法两种方式。
2 仪器、设备和用具无菌室分无菌操作室和缓冲间。
在缓冲间应有洗手盆、毛巾、无菌衣裤放置架及挂钩、拖鞋等。
无菌操作室应具有空气除菌过滤的单向流空气装置，局部洁净度100级或放置同等级别的超净工作台，室内温控(25±2)℃及除湿装置。
缓冲间及操作室内均设置能达到空气消毒的紫外灯和照明灯，操作室或工作台应保持正压。
2.1.1 无菌室应每周和每次操作前用%新洁尔灭或2%甲酚液或其他适宜消毒液擦拭操作台及可能污染的死角，开动无菌空气过滤器及紫外灯杀菌半小时。
在每次操作完毕，同样上述消毒溶液擦拭工作台面，除去室内湿气，用紫外灯杀菌半小时。
2.1.2 无菌室的无菌程度检查无菌室在消毒处理后，无菌试验前及操作过程中需检查空气中菌落数；取直径约90mm双碟，在接种室内点燃乙醇灯，在乙醇灯旁，以无菌操作，将双碟半开注入溶化的营养琼脂培养基约20ml，制成平板，在30～35℃培养48小时，取出检查，100级清洁度要求:3个平板上生长的菌落数平均不得超过1个。
无菌操作台面或超净工作台应定期请有关部门检测其洁净度，应达到100级(一般用尘埃粒子计数仪)检测尘埃粒径≤5μm的粒数不得超过个/升；空气流量应控制在～S；细菌菌落数平均＜1个，可根据无菌状况必要时置换过滤器。
恒温培养箱及可调20～25℃的生化培养箱。
离心机、显微镜、蒸汽灭菌器、标准PH比色器%酚磺酞指示液和溴钾酚蓝指示液)、恒温烤箱。
玻璃器皿试管、量筒、三角瓶、移液管、刻度吸管(1、5、10ml)、注射器(2、5、10ml)、双碟等，用玻璃洗涤剂或清洁液浸泡，水洗3次。
薄膜过滤法微生物限度检查操作要点
薄膜过滤法微生物限度检查操作要点1. 设备、仪器1.1 无菌室微生物限度检查应有单独的无菌室，每个无菌室应有独立的净化空气系统。
1.1.1 操作间操作间应安装空气除菌过滤层流装置。
环境洁净度不应低于10000级，局部洁净度为100级（或放置同等级净化工作台）。
操作间或净化工作台的洁净空气应保持对环境形成正压，不低于4.9Pa。
操作台上备有电子天平，乙醇灯，火柴，乙醇棉球，大、小橡皮乳头等。
1.1.2 缓冲间缓冲间内应有洗手盆，无菌衣、帽、口罩、拖鞋等。
缓冲间内不得放置培养箱和其他杂物。
1.1.3 在每次操作前、后，用75%乙醇溶液或其他消毒液擦拭操作台及可能污染的死角。
然后启动层流净化装置，同时用紫外杀菌灯照射30min。
1.1.4 无菌室操作台消毒擦拭后，先启动层流净化装置30min，将备妥的营养琼脂平板3个（经30～350C预培养48h，证明无菌落生长），以无菌方式移入操作间，置净化台左、中、右各1个，开盖，暴露30min 后将盖盖上。
在30～350C培养箱内倒置培养48h，取出检查。
3个平板生长的平均菌落数不超过1个。
1.2 仪器1.2.1 恒温培养箱（30～350C）、生化培养箱（23～280C）、电冰箱、蒸汽灭菌器。
1.2.2 玻璃器皿烧杯、培养皿、量筒、试管及塞、吸管。
玻璃器皿用前应洗涤干净，吸管、量筒不挂水滴，无残留抗菌物质。
玻璃器皿均应用牛皮纸（或双层报纸）严密包裹置蒸汽灭菌器高压蒸汽121℃灭菌30min，烘干。
或于160℃干热灭菌2h，备用。
2培养基及其制备方法2.1 营养琼脂培养基：取营养琼脂培养基34g，加1000ml蒸馏水，加热溶解，分装，121℃高压灭菌15分钟。
2.2 玫瑰红钠琼脂培养基：取玫瑰红钠琼脂培养基30.5g，加1000ml蒸馏水，加热溶解，分装，121℃高压灭菌15分钟。
2.3 胆盐乳糖培养基：取胆盐乳糖培养基36g，加1000ml蒸馏水，加热溶解，分装，121℃高压灭菌15分钟。
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贵州明湖药业股份有限公司GMP文件
目的建立无菌检查法。
依据国家药品监督局《药品生产质量管理规范》(2010年修订)第七十五条
范围本标准适用于抗菌药物注射液。
责任人试剂配制人及QA负责人、化验员对本标准实施负责。
内容
1 概述
无菌检查是检查药品是否染有活菌的一种方法。
2仪器、设备和用具
2.1 恒温培养箱及可调20～25℃的生化培养箱。
2.2 显微镜、蒸汽灭菌器、标准pH比色器(0.02％酚磺酞指示液和澳钾酚蓝指示液)、恒温烤箱。
2．3 三角瓶、刻度吸管(1、5、10m1)、玻璃器皿、移液管、试管。
2．3．1 移液管、刻度吸管在管口上端内，松松地塞少许棉花，然后放于吸管衙内或牛皮纸袋内盖严，灭菌备用。
2.3.2 试管、三角瓶等在管(瓶)口塞上海棉胶专用塞或纱布棉塞，塞子应塞进管口内2／3处，用皮纸格管口(包括塞子)包扎严,灭菌备用。
2.3.3 将注射器、针头(8—9号)配对，检查针头是否畅通后，将注射芯、管和针头分别放在双层纱布(或布)内，包扎严密，置带盖容器(瓷盘或铝制饭盒)内，盖严，用牛皮纸包扎后，灭菌备用。
2.4 无菌衣、裤、帽、口罩等洗净晾干，配套，用牛皮纸包严，灭菌备用或用一次性的无菌物品代替。
2.5 真空泵。
2.6 用具的灭菌将包扎妥的用具(除另有规定外)，在(121土0．5)℃蒸气灭菌30分钟，物品取出时切勿立即置冷处，以免急速冷却，使灭菌物品内蒸气冷凝造成负压，易致染菌，应置恒温培养箱中烘干。
适于高温灭菌的器皿也可采用160℃干热灭菌2小时。
3 试液
3.1 75％乙醇溶液配制酒精棉球用。
3.2 碘配溶液配制碘酒棉球用。
3.3 新洁尔灭(1：1000)溶液。
3.4 3-5％甲酚溶液或其他适宜消毒溶液。
3.5 0.02％酚磺酞指示液pH6.8-8.4系列比色液管
3.6 溴甲酚蓝指示液pH6.0-7.6系列比色液管。
3.7 2mol/L盐酸溶液。
3.8 2mol/L氢氧化钠溶液。
4 培养基
4.1 一般采用商品脱水培养基，临用时按照使用说明书进行配制，需注意培养基的pH值应符合规定，否则必须校正后，灭菌使用。
4.2 新鲜配制的培养基，应按中国药典2005版规定的处方，对培养基的原材料要进行挑选，化学药品均需用CP试剂规格。
5操作人员
用肥皂、水清洗双手，关闭紫外光灯，进入缓冲间，换拖鞋，再用碘酒棉、75％乙醇棉球擦手，穿载衣、帽、口罩。
将所需物品剥去牛皮纸，移入无菌间，每次试验中所用物品必须计划好，并有备用物。
6供试品外部消毒
用75％L醇棉球擦拭外壁及瓶塞，待干，用灭菌撬瓶器剔去铝盖，再用75％L醇棉球擦拭瓶塞，过火焰数次。
7供试品制备
注射液可直接用注射器吸取药液。
按规定或需灭活的供试品可用灭活剂溶解，将瓶内供试液抽出稀释至规定的浓度。
依法接种于上述培养基中。
8 操作
8.1如供试品有抗菌作用，按中国药典2005年版无菌检查法表1规定量取供试品10瓶，照直接接种法供试品制备项下，吸取供试液加入无菌0.9％氯化钠溶液或其他适
宜的溶液至少100ml具塞的瓶中，混匀。
用薄膜过滤器，通过火焰，将瓶塞打开倒入薄膜滤器内，立即开动真空泵将供试液抽干，然后用无菌0．9％氯化钠溶液或其他适宜的溶剂冲洗滤膜，每冲洗一次需将液体抽干，冲洗次数及冲洗液量依供试品种类及量而异，至阳性对照菌正常生长为度，打开抽气瓶塞中的排气管的螺旋夹，将过滤器从排液管架取下，松动底座的螺母，取下滤膜部分，用灭菌镊将滤膜取出，放入灭菌双碟中，用灭菌剪刀将滤膜剪成3等份，分别加入需气菌、厌气菌和真菌培养基中。
采用封闭式过滤器时，将双芯针头插至供试液容器塞上，开动电脑蠕动泵电源，使药液均匀通过3个一组的集茵培养器，待药液排尽，关闭电源，将针头取下插至无菌0.9％氯化钠溶液或其他适宜
的冲洗液的容器塞上，冲洗集茵培养器的滤膜，照上述操作要求，冲洗次数及量以阳性对照管细菌生长为度。
关闭电源，将集菌培养器上排气孔胶帽取下，套于集菌培养器底部的排液管口上；将连接集菌培养器塑胶管之一用夹子(或止血钳)夹紧，将针头插入含需气菌、厌气菌培养基200ml的容器塞上，启动电源。
使该种培养基均匀加至两个集菌培养器中，分别用夹子夹紧与其相连的两个塑胶管，同时开通另一个塑胶管的夹子，将针头插入含真菌培养基lOOmI的容器塞上，启动电源，待真菌培养基全部移入培养器中，关闭电源，取下集菌培养器，用夹子夹紧塑胶管近端，用剪切断塑胶管远端。
8．2 将已操作完毕的培养基移出，依供试品特性加入相应的对照菌液1m1(抗细菌药物，以金黄色葡萄球菌为对照菌；抗厌氧菌药物，以生抱梭菌为对照菌；抗真菌药物，以白色念珠菌为对照菌)，按规定温度与时间培养。
阳性对照管细菌应在培养24～48小时，真菌应培养24～72，小时有菌生长。
薄膜过滤后，须冲洗。
8.3 每次操作时，均应取相应溶剂和稀释剂、及冲洗液同法操作，作为阴性对照。
9 结果判断
当阳性对照管显浑浊并确有细菌生长时，可根据观察所得的结果判定：如需气菌、厌气菌及霉菌培养管均为澄清或虽显浑浊但经证明并非有菌生长，均应判为供试品合格；如需气菌、厌气菌及霉菌培养管中任何1管显浑浊并确证为有菌生长，应重新取样，别依法复试2次，除阳性对照管外，其他各管均不得有菌生长，否则应判为供试品不合格。