植物内生菌及其天然产物的探究

MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY REVIEWS （2003）
Gary Strobel* and Bryn Daisy
IF：0.638
一、植物内生菌的定义、分类
定义： 指那些在其生活史的一定阶段或全部阶段生活 于健康植物的各种组织和器官内部的微生物， 被感染的宿主植物不表现出外在病症，可通过 组织学方法或植物表面消毒的方法进而从植物 组织中分离出的菌株。
植物内生菌及其天然产物的探究
导 师： 报告人：
报告内容
一、植物内生菌的定义、分类 二、研究意义 三、天然活性产物及其传统用法
四、采集和分离植物内生菌的原理和方法
五、植物内生菌天然产物的获得及其应用
报告文献
Bioprospecting for Microbial Endophytes and Their Natural Products
2、抗病毒化合物
Cytonaema sp 通过这株真菌的固体发酵 获得的两种新型的人类巨细胞病毒蛋白酶抑制 剂. 有效化合物：cytonic acids A and B
3、不稳定的抗生素 Muscodor albus 是从肉桂中分离得到的， 这株真菌通过产生一系列不稳定化合物能够 有效的杀死某些特定的真菌和细菌，通过气 相层析质谱仪鉴定，人工合成了几种这类化 合物，同物杀虫剂 Nodulisporium sp.（多节孢属）是从Bontia daphnoides中分离得到的。 有效化合物：Nodulisporic acids
7、抗糖尿病制剂
Pseudomassaria sp是从位于刚果人民共 和国境内的非洲雨林中分离得到的一株植物 内生真菌。 有效化合物：L-783,281
ATCC 27029 （AC）
L5（BD）
小单包菌的分布：
小单孢菌分布非常广泛，比如：海岸沉 积物、海洋沉积物、沼泽森林、泛滥的草原、 植物的根际。
谢 谢！
分类： 细菌、真菌、放线菌等
二、研究意义
植物内生菌可产生丰富多样的具生物活 性的代谢产物、范围非常广泛、有抗肿瘤物 质、抗生素类物质、抗菌物质、抗氧化物质、 生长调节类物质、免疫抑制剂和杀虫剂等。 近年来，由于器官移植的出现导致真菌感染 发病率的极大增加，加之细菌抗药性的出现 充分说明了人们在处理这些问题方面做得不 够充分。
4、抗肿瘤药物
T. andreanae是从短叶红豆杉中分离得到 的一株真菌。具有很好的抗肿瘤效果，是世 界上第一个具有十亿美元销量的抗肿瘤药物。
有效化合物：Paclitaxel（紫杉醇）
5、抗氧化剂
P. microspora（微孢子门）是从生长在 巴布亚几内亚的塞皮克河榄仁树中分离得到 的，其化合物能够清除超氧化物和羟基自由 基。 有效化合物：pestacin and isopestacin
植物内生菌是位于植物组织内部的的微 生物，相对来说研究的比较少且具有产生新 的化合物的潜能，地球上大约有300000植物 种类，每一个植物含有至少一个以上的内生 菌，这些植物中只有少数被完全研究过，内 生菌作为微生物中的重要类群，其物种丰富， 数量庞大，是一个巨大的资源库，具有广阔 的研究前景。
三、天然活性产物及其传统用法
小单包菌的生活方式：
小单包菌生活方式复杂，可以从其基内菌 丝和孢子形成进行识别（不产生气生菌丝）。 小单孢菌经常产生与其它放线菌混淆的难以辨 认的菌落。事实上，小单包菌在显微镜下的细 胞形态是很相似的，都能产生分支的，直径在 0.2-0.6μm之间的被隔膜分开的菌丝。它们的 菌落也能产生各种各样的颜色，包括白色、橙 黄、玫瑰红或者棕色，这些色素可能分散到基 内。
分离方法：
1、取样：对采集植物地点进行标绘，
切 取一段茎去除过量的水分后装入密封 塑料袋中4℃的条件下保藏备用。
2、70%乙醇清理样品的表面（有时可以 火烧） ，然后风干。
3、用消毒的刀片切除样品的外部组织，然后 小心地将内部组织切开后放到琼脂平板上。
4、经过数天的培养之后，将真菌的单菌落转 接到土豆培养基上；（细菌会经常出现在植 物的组织上，有时候也会有放线菌出现）
Microbial drug discovery: 80 years of progress
The Journal of Antibiotics
Arnold L Demain1 and Sergio Sanchez
Micromonospora: An important microbe for biomedicine and potentially for biocontrol and biofuels Soil Biology & Biochemistry Ann M. Hirsch *, Maria Valdés IF：2.978
1、应选择生长在特殊环境里的植物，特别 是那些具有新的方式生存的植物需要仔细研 究。
2、应选择具有人类植物学历史的植物，这 些植物一般具有有特殊研究应用价值。（这 些植物一般被当地居民直接使用或者有文字 记载）
3、选择那些土生土长的、比较古老的或 者长久占据某一片土地的植物。这些植物中 更有可能寄宿能产生天然活性产物的内生菌。
从2008三个小单包菌的基因组被测序和 被人们广泛引用以来，更多的小单包菌被测 序。小单孢菌以能够合成抗生素而闻名，特 别是氨基糖苷类、烯二炔类、低聚糖类的抗 生素，因此，小单包菌对于药物的影响是相 当大的。此外，小单包菌能产生水解酶，可 以作为生物控制剂，可以刺激植物根际生长， 具有固氮作用等，有广阔的研究前景。
4、生长在生物多样性丰富的地区中的植 物也有可能寄宿种类繁多的内生菌。
植物内生菌和生物多样性
地球上具有数不清的生态系统，这些生物 多样性丰富的地区似乎也同样含有大量的、种 类繁多的植物内生菌。热带雨林和温带雨林是 地球上生物多样性最丰富的陆地生态系统，而 其仅占地球表面的1.44%，却包含了超过60% 的陆地生物种类。
天然活性产物主要是从微生物、植物或者 动物获得的代谢产物、代谢产物衍生物及派生 物。这些产物已经被人们开发利用了数千年， 而植物是用于药物的主要的化合物资源，即使 在今天最大的传统药物的使用者还是中药。
亚马孙河平原新几内亚岛的土著人发现了 某些植物能够解除头伤风、大的创伤和肠内疾 病。
3000年前的玛雅人发现了生长在烤熟的玉 米上的真菌可以治疗肠内疾病。 800年前的本笃会的僧侣开始应用罂粟作为 麻醉剂来缓解疼痛。
事实上，生物的多样性意味着化学药品的多 样性，因为化学药品的革新通常是存在于那些为 了生存而物种的进化比较活跃的生态系统中。热 带雨林就是一个典型的这样的环境，资源有限， 竞争激烈，选择的压力达到了最大值，这导致了 雨林地区是一个具有很大可能性发现新型的分子 结构和生物活性化合物的资源。
有报告通过统计学的数据对从热带和温 带雨林的分离出的植物内生菌进行了比较。 不但发现热带雨林植物内生菌比温带雨林产 生更多的具有生物活性的化合物，而且热带 雨林植物内生菌比从热带雨林土壤中分离的 真菌产生更多的次级代谢产物。
后续步骤：
15%甘油-70℃保藏 ↓ 培养基选取与优化 ↓ 发酵培养测活性 ↓ 萃取分离纯化有活性化合物
五、植物内生菌天然产物的获得及其应用 1、抗生素
Cryptosporiopsis quercina是从生长在欧 亚大陆的一种药用植物雷公藤中分离得到的 一 株真菌，具有很强的抗真菌活性。 有效化合物：cryptocandin
小单孢菌：
放线菌的一个科，基内菌丝形成单个孢子， 通常无气生菌丝，能够分解一些不易分解的有 机质，如纤维素、几丁质、木聚糖等。
研究背景：
尽管小单包菌长久以来被认为是生物药 物上产生次级代谢产物的一个重要的资源， 一些资料也已经说明了其对于土壤生态学的 重要性。但是，直到最近，小单包菌对植物 生长和发育的重要性才被人们认可。
8、免疫抑制剂
Fusarium subglutinans是从雷公藤中分 离得到的一株真菌。
有效化合物：Subglutinol A and B
Natural Products as Sources of New Drugs over the Last 25 Years
J. Nat. Prod David J. Newman* and Gordon M. Cragg IF：3.159
植物内生菌和植物化学
Tan和Zou认为一些植物内生菌之所以能 够产生某些一定的植物素是因为这些内生菌 在进化期间可能与宿主发生了基因重组。这 个概念最初是为了解释T. andreanae（真菌） 问什么能够产生紫杉醇。
植物内生菌与它们各自宿主的各个方面 的相互关系是一个巨大的没有被研究和具有 很强吸引力的领域。因此，收集更多的关于 植物种类和其微生物的背景信息对于寻找具 有生物活性的产物是非常有帮助的。
直到巴斯德发现了发酵是由活细胞引起的， 人们才开始把微生物作为一个产生天然活性产 物的资源来认真的研究。细微的观察和意外发 现使弗莱明开创了抗生素的新纪元——盘尼西 林。由于先进的筛选技术的出现，大量的微生 物及其产物在医药、农业和工业上得到广泛应 用。
四、采集和分离植物内生菌原理和方法
选择植物的条件：