关于HPLC的基础知识(中文)
高效液相色谱基础知识
谢谢大家！
第二节 岛津LC-10AT型 HPLC本卷须知
一、 流动相
1、流动相应选用色谱纯试剂、高纯水或双蒸水，酸碱液及 缓冲液需经过滤后使用，过滤时注意区分水系膜和油系 膜的使用范围；
2、水相流动相需经常更换〔一般不超过2天〕，防止长菌 变质；
3、使用双泵时，A、口位于混合器下方〕 放置含盐流动相，B、C〔进液口位于混合器上方〕放置 不含盐流动相； A、B、C、D四个储液器中其中一个为棕色瓶，用于存 放水相流动相。
2、 冲洗完毕后，逐步降低流速至0，关泵，进样器也应用 相应溶剂冲洗，可使用进样阀所附专用冲洗接头。
3 、关断电源，作好使用登记，内容包括日期、检品、色谱 柱、流动相、柱压，使用小时数，仪器完好状态等。
九、 清洗管路及进样口
【特殊情况】：谱流路系统，从泵、进样器、色谱柱、 到检测器通池，在分析完毕后，均应按〔5.1〕充分冲 洗，特别是用过含盐流动相的，更应注意先用水，再 用甲醇-水，充分冲洗。
四、 操作过程
〔 4 〕、注意各流动相所剩溶液的容积设定，假设设定 的容积低于最低限会自动停泵，注意洗泵溶液的体积 ，及时加液；
〔 5 〕、使用过程中要经常观察仪器工作状态，及时正 确处理各种突发事件。
四、 操作过程
2、 先以所用流动相冲洗系统一定时间〔如所用流动相为 含盐流动相，必须先用水冲洗20分钟以上再换上含盐 流动相〕，正式进样分析前30min 左右开启D灯或W灯 ，以延长灯的使用寿命；
1、采用过滤或离心方法处理样品，确保样品中不含固体颗粒；
〔1〕、翻开电源，用Harb相连接时，注意Harb电源，翻开计算机，翻开Bootp Server〔一般启动时已翻开〕；
4、 梯度设定：
4.
高效液相色谱-HPLCppt课件.ppt
色谱法的分类
按固定相的形态分:
平面色谱 o 纸色谱
o 薄层色谱
柱色谱
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
色谱法的分类示意图
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▪ 高压梯度洗脱（高压混合，高压进柱，2个 泵。）
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▪安捷伦泵：小视频 ▪色谱学堂：泵
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色谱法原理及分类
什么是色谱法 色谱法溯源 Tswett（茨维特)的实验 色谱法原理 色谱法的分类
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什么是色谱法
色谱法是一种现代的分离分析方法 1906年正式命名(见诸文献) 20世纪30年代开始广泛研究和应用 高效液相色谱法的广泛应用始于20世纪70年代
1. 紫外—可见光度检测器：
①固定波长：254nm ， 低压汞 灯。
② 可 调 波 长 ： 190 ～ 800mm ， 钨灯，氘灯。
UV
③光电二极管矩阵检测器： 190～700nm。
接色谱柱 石英窗 光电倍增管
废液
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HPLC-基础知识
B A
这种方法能使样品的各组分获得良好 的分离，色谱峰清晰。此外，除去冲洗剂 后，可获得纯度较高的物质。目前，这种 方法是色谱法中最常用的一种方法
顶替法是将样品加到色谱柱头后，在惰性 流动相中加入对固定相的吸附或溶解能力 比所有试样组分强的物质为顶替剂（或直 接用顶替剂作流动相），通过色谱柱，将 各组分按吸附或溶解能力的强弱顺序，依 次顶替出固定相 很明显，吸附或溶解能力最弱的组分最先 流出，最强的最后流出。顶替法的流出曲 线如下图
（1）软质凝胶 葡聚糖凝胶、琼脂凝胶等。多孔网状结构 水为流动相。适用于常压排阻分离
（2）半硬质凝胶 苯乙烯-二乙烯基苯交联共聚物，有机凝胶 非极性有机溶剂为流动相，不能用丙酮、乙醇等极性溶剂
（3）硬质凝胶 多孔硅胶、多孔玻珠等 化学稳定性、热稳定性好、机械强度大，流动相性质影响 小，可在较高流速下使用 可控孔径玻璃微球，具有恒定孔径和窄粒度分布
离子对色谱
原理：将一种（或多种）与溶质离子电荷相反的 离子（对离子或反离子）加到流动相中使其与溶 质离子结合形成疏水性离子对化合物，使其能够 在两相之间进行分配
阴离子分离：常采用烷基铵类，如氢氧化四丁基 铵或氢氧化十六烷基三甲铵作为对离子
阳离子分离：常采用烷基磺酸类，如己烷磺酸钠 作为对离子
AB
此法适于制备纯物质或浓子 或除去被柱子吸附的物质后，才能再使 用
迎头法是将试样混合物连续通过色谱柱，吸附或 溶解能力最弱的组分首先以纯物质的状态流出， 其次则以第一组分和吸附或溶解能力较弱的第二 组分混合物，以此类推。流出曲线如下图
3. 按固定相的外型分类
固定相装于柱内的色谱法，称为柱色谱
固定相呈平板状的色谱，称为平板色谱， 它又可分为薄层色谱和纸色谱
HPLC基础知识
第一章高效液相色谱仪的特点混合物最有效的分离、分析方法。
俄国植物学家茨维特在1906年分离叶绿素，色谱法是一种分离技术。
混合物分离过程：试样中各组分在称之为色谱分离柱中的两相间不断进行着的分配。
一相固定不动，称为固定相。
另一相是携带试样混合物流过固定相的流体(气体或液体)，称为流动相。
特点：高压、高效、高速、高灵敏适合高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。
与GC 互补性三、液相色谱组成：（一）、输液系统泵、进样阀、色谱柱、检测器、工作站（记录仪）（二）、附件过滤装置、脱气装置、柱温箱、收集装置等等。
（三）、工作程序：液体进入泵-压力传感器-脉动缓冲器-进样阀-色谱柱检测器（四）、泵体组成部分：电机、马达、双柱塞串联泵腔、缓冲器、压力传感器、面贴（五）、检测器组成部分：1、电器部分（变压器、氘灯板、系统电源伴、控制板、显示板、前置板、面贴）2、光学部分（氘灯、灯箱、光学盒、凹面镜、分光镜、小参比、单色器、流通池、前置板）（六）、HPLC的分类1、吸附色谱Adsorption Chromatography用固体吸附剂作固定相，以不同极性溶剂做流动相依据样品中各组分在吸附剂上吸附性能的差别来实现分离。
2、分配色谱Partition Chromatography用载带在固相基体上的固定液做固定相，以不同极溶剂作流动相。
依据样品中各组分在固定液上分配性能的差别来实现分离。
3、离子色谱Ion Chromatography用高效微粒离子交换剂作固定相，以具有一定PH值的缓冲液做流动相，依据离子型化合物中各离子组分与离子交换剂上表面带电荷基团进行可逆离子交换能力的差别来实现分离。
4、体积排阻色谱Size Exclusion Chromatography用化学惰性的多孔性凝胶做固定相，按固定相对样品中组分分子体积阻滞作用的差别来实现分离。
又分：a、Gel Filtration Chromatography（GFC）以水为流动相的体积排阻色谱b、Gel Permeation Chromatography（GPC）以有机溶剂为流动相的体积排阻色谱5、亲和色谱以在不同基体上，键合多种不同特性的特性的配位体做固定相用具有不同PH值的缓冲溶液作流动相，依据生物分子（氨基酸、肽、蛋白质、核碱、核酸、核苷酸、酶等）与基体上键合的配位体之间存在的特异性亲和作用能力的差别而实现对具有生物活性的生物分子的分离。
高效液相色谱基础知识总结
（LC-MS），有效的弥补了色谱法定性分析特征性差的弱 点，成为最重要的分离分析方法之一， LC-MS在选择性、 灵敏度、分子量测定和提供结构信息方面具有明显的优 势，能够同时获得可靠的定性定量结果，因而被广泛应 用于药物的质量控制（杂质、副产物、降解产物等的鉴 定和测定）、药物在生物体内的吸收、分布和代谢研究 （包括代谢物的结构确定及定量）和临床医学研究（如 蛋白异常的研究）。 LC-MS已成为新药研究必不可少的 手段。20世纪70年代，高效液相色谱法崛起克服了
高效液相色谱基础知识总结
二、基本概念和术语
一、色谱图和峰参数 1、色谱图(chromatogram)--样品流经色谱柱和检测器， 所得到的信号-时间曲线，又称色谱流出曲线(elution profile)。 2、基线(base line)--经流动相冲洗，柱与流动相达到 平衡后，检测器测出一段时间的流出曲线。一般应平行 于时间轴。基线反映仪器及操作条件的恒定程度，主要 由流动相中的杂质等因素决定。
键合相色谱法是将类似于气相色谱中的固定液的液 体，通过化学反应键合到硅胶表面，从而形成固定相。
高效液相色谱基础知识总结
采用化学键合固定相的色谱法称为键合相色谱。若采用 极性键合相、非极性流动相，则称为正相色谱；采用非 极性键合相、极性流动相，则称为反相色谱。这种分离 的保留值大小，主要决定于组分分子与键合固定液分子 间作用力的大小。
高效液相色谱基础知识总结
气相色谱法不能直接用于分析难挥发、热不稳定及高分 子化合物等的弱点，大大扩大了色谱法的应用范围，把 色谱法推进到一个新水平。
高效液相色谱（high performance liquid chromatography, HPLC）是一种高效、快速的分离分析 技术，具有灵敏度高、选择性好的特点。HPLC具有的同 时分离和分析的功能对于体内药物分析和体内内源性物 质的分析及成分复杂的中药分析尤其重要。 HPLC的分离 功能还广泛用于药物的纯化和制备，如用制备色谱分离
HPLC基础知识
HPLC基礎知識三、色譜法分類按兩相的物理狀態可分為：氣相色譜法(GC)和液相色譜法(LC)。
氣相色譜法適用於分離揮發性化合物。
GC根據固定相不同又可分為氣固色譜法(GSC)和氣液色譜法(GLC)，其中以GLC應用最廣。
液相色譜法適用於分離低揮發性或非揮發性、熱穩定性差的物質。
LC同樣可分為液固色譜法(LSC)和液液色譜法(LLC)。
此外還有超臨界流體色譜法(SFC)，它以超臨界流體（界於氣體和液體之間的一種物相）為流動相（常用CO2），因其擴散係數大，能很快達到平衡，故分析時間短，特別適用於手性化合物的拆分。
按原理分為吸附色譜法(AC)、分配色譜法(DC)、離子交換色譜法(IEC)、排阻色譜法(EC，又稱分子篩、凝膠過濾(GFC)、凝膠滲透色譜法(GPC）和親和色譜法。
（此外還有電泳。
）按操作形式可分為紙色譜法(PC)、薄層色譜法(TLC)、柱色譜法。
四、色譜分離原理高效液相色譜法按分離機制的不同分為液固吸附色譜法、液液分配色譜法（正相與反相）、離子交換色譜法、離子對色譜法及分子排阻色譜法。
1〃液固色譜法使用固體吸附劑，被分離組分在色譜柱上分離原理是根據固定相對組分吸附力大小不同而分離。
分離過程是一個吸附－解吸附的平衡過程。
常用的吸附劑為硅膠或氧化鋁，粒度5~10μm。
適用於分離分子量200~1000的組分，大多數用於非離子型化合物，離子型化合物易產生拖尾。
常用於分離同分異構體。
2〃液液色譜法使用將特定的液態物質塗於擔體表面，或化學鍵合於擔體表面而形成的固定相，分離原理是根據被分離的組分在流動相和固定相中溶解度不同而分離。
分離過程是一個分配平衡過程。
塗布式固定相應具有良好的惰性；流動相必頇預先用固定相飽和，以減少固定相從擔體表面流失；溫度的變化和不同批號流動相的區別常引起柱子的變化；另外在流動相中存在的固定相也使樣品的分離和收集複雜化。
由於塗布式固定相很難避免固定液流失，現在已很少採用。
現在多採用的是化學鍵合固定相，如C18、C8、氨基柱、氰基柱和苯基柱。
HPLC色谱柱的基础知识及使用技巧
HPLC色谱柱的基础知识及使用技巧一、引言高效液相色谱法（HPLC）是一种广泛应用于化学、生物、医药等领域的分析技术。
色谱柱是HPLC系统的核心组成部分，其性能直接影响分析结果的准确性和可靠性。
本文将详细介绍HPLC色谱柱的基本原理、分类、使用及维护等方面的专业知识。
二、色谱柱的基本原理色谱法是一种基于不同物质在固定相和移动相之间的分配平衡进行分离的物理化学方法。
HPLC色谱柱的核心是固定相，它是由硅胶、氧化铝、活性炭等颗粒状物质组成。
当样品溶液通过色谱柱时，不同物质根据其与固定相的相互作用力大小，依次从固定相中解吸下来，从而实现各成分的分离。
三、色谱柱的分类1.正相色谱柱：适合分离极性化合物，如糖类、醇类等。
2.反相色谱柱：适合分离非极性化合物，如脂肪酸、烃类等。
3.离子交换色谱柱：适合分离带电离子或极性化合物，如氨基酸、核酸等。
4.体积排阻色谱柱：适合分离大分子物质，如蛋白质、多糖等。
四、色谱柱的选择与使用1.根据分析物的性质选择合适的色谱柱。
2.确保色谱柱不受污染，使用前需进行清洗和活化。
3.避免过度使用压力，以延长色谱柱的使用寿命。
4.定期更换色谱柱，以保证分析结果的稳定性。
五、色谱柱的维护与保养1.使用后及时清洗色谱柱，防止残留物对柱子的污染。
2.色谱柱应储存于干燥、避光的环境中，避免受潮或暴晒。
3.对于长期不用的色谱柱，应定期检查其性能并进行活化处理。
4.避免将色谱柱置于高温或低温环境中，以防止硅胶固定相产生裂纹或变形。
5.定期更换流动相，以保证流动相的质量和稳定性。
同时，流动相的pH值应控制在固定相所能承受的范围内。
6.在使用过程中，应时刻关注色谱柱的压力变化。
若发现异常压力或突然变化，应及时检查柱子是否堵塞或受损。
若确有问题，应立即停止使用并进行修复或更换。
7.在使用过程中，还应注意观察色谱峰的形状和大小。
若发现异常峰或分离效果变差，应考虑更换流动相或清洗柱子。
若问题仍未解决，应考虑更换色谱柱。
液相基础知识
• 色谱法也叫层析法，它是一种高效能的物理分离 技术，将它用于分析化学并配合适当的检测手段， 就成为色谱分析法。 • 色谱法（Chromatography）溯源
– 色谱法 色谱法又称色谱分析 色谱分析法 层析法 色谱分析、色谱分析法 层析法，是一种 色谱分析 色谱分析法、层析法 分离和分析方法，在分析化学、有机化学、生物化学 等领域有着非常广泛的应用。色谱法利用不同物质在 不同相态的选择性分配，以流动相对固定相中的混合 物进行洗脱，混合物中不同的物质会以不同的速度沿 固定相移动，最终达到分离的效果。
－－经典的液相色谱 液相色谱法，流动相在常压下输送，所 液相色谱 用的固定相柱效低，分析周期长。 －－而现代液相色谱 液相色谱法引用了气相色谱的理论，流 液相色谱 动相改为高压输送（最高输送压力可达 4.9107Pa）;色谱柱是以特殊的方法用小粒径的 填料填充而成，从而使柱效大大高于经典液相色 液相色 谱（每米塔板数可达几万或几十万）；同时柱后 连有高灵敏度的检测器，可对流出物进行连续检 测。因此，高效液相色谱 液相色谱具有分析速度快、分离 液相色谱 效能高、自动化等特点。所以人们称它为高压、 高速、高效或现代液相色谱 液相色谱法。 液相色谱
缺乏灵敏度 － 和其他检测器相比，RI检测器一般灵敏度较低 和其他检测器相比， 检测器一般灵敏度较低
0.14 0.12 0.10 AU 0.08 0.06 0.04 0.02 0.00 15.00 10.00 5.00 0.00 -5.00 -10.00 -15.00 -20.00 -25.00 -30.00
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液相色谱的检测器
• 常规检测器
– 示差折光检测器（Refractive Index） – 紫外/可见光吸收检测器（UV-Vis） – 荧光检测器（Fluorescence） – 蒸发光散射检测器（Evaporative Light Scattering） – 其他检测器（Other Detectors）
HPLC原理及基本操作
HPLC原理及基本操作HPLC（高效液相色谱法）是一种广泛应用于分析化学和制药工业中的分离技术。
它基于液相色谱法，通过将样品溶解在流动相中，并通过固定填料进行分离和分析。
1.样品的溶解：样品通常是固体或液体，在HPLC中需要将其溶解在流动相中。
流动相可以是水、有机溶剂或它们的混合物。
2.固定相填料的选择：HPLC中的填料通常是高度吸附性和具有大表面积的细小颗粒。
这些颗粒被填充在色谱柱中，提供了分离和分析的平台。
3.流动相选择：流动相的选择取决于样品的性质和目标分析的目的。
流动相的成分和配比可以根据需要进行调整，以改变分离效果和分辨率。
4.注射样品：将样品通过注射器引入HPLC系统，注射器将样品推入色谱柱中。
5.流动相的微量泵：流动相的微量泵非常重要，它通过控制流动相的流速将样品推过填料。
6.色谱分离：样品在填料中根据其亲水性（亲水性成分被保留在固定相上，疏水性成分则被推至溶剂流动相）进行分离。
固定相越亲水，则与样品中的亲水性成分相互作用越强；固定相越疏水，则与样品中的疏水性成分相互作用越强。
7.检测器：色谱柱的末端通常装有检测器，用于检测样品溶液中目标化合物的浓度。
8.数据处理：使用计算机系统分析检测器输出的图形数据，然后计算和解释结果。
HPLC基本操作：1.准备样品：将样品溶解在适当的溶剂中。
2.准备色谱柱：将填料装入色谱柱中，并使其适当压实。
3.连接色谱柱：将装有填料的色谱柱连接至HPLC系统。
4.设置流动相：根据需要设置流动相的组成和配比，通过微量泵提供流动相。
5.设置检测器：根据需要设置检测器，选择适合目标化合物的检测方法。
6.注射样品：使用自动或手动注射器将样品引入HPLC系统。
7.运行分析：通过微量泵控制流速，运行HPLC系统使样品通过色谱柱，分离和分析目标化合物。
8.数据处理：使用计算机系统分析检测器输出的图形数据，进行峰面积计算、峰高定量等数据处理。
9.结果解释：根据分析结果解释样品中的目标化合物的存在和浓度。
HPLC上岗培训考试试题
HPLC上岗培训考试试题HPLC（高效液相色谱）是一种常用的分析技术，广泛应用于制药、化工、环境监测等领域。
为了提高分析人员的技能水平，许多实验室都会组织HPLC上岗培训考试，以确保操作人员掌握相关知识和技能。
本文将针对HPLC上岗培训考试试题展开讨论。
一、基础知识篇1. HPLC的英文全称是什么？HPLC的英文全称是High Performance Liquid Chromatography，即高效液相色谱。
2. HPLC的工作原理是什么？HPLC利用固定相和流动相之间的相互作用，通过样品在固定相上的分配和再分配，实现对样品成分的分离和定量分析。
3. HPLC中常用的固定相有哪些？常用的固定相有反相、离子交换、凝胶、亲水性等。
4. HPLC中常用的流动相有哪些？常用的流动相有水、有机溶剂、缓冲液等。
5. HPLC中常用的检测器有哪些？常用的检测器有紫外检测器、荧光检测器、电导检测器等。
二、方法开发与优化篇1. 在HPLC方法开发中，如何选择合适的固定相？选择固定相时需要考虑样品的性质、分离目标和分析条件等因素。
一般来说，反相固定相适用于非极性或弱极性化合物的分离，离子交换固定相适用于离子化合物的分离。
2. 在HPLC方法开发中，如何选择合适的流动相？选择流动相时需要考虑样品的性质、分离目标和分析条件等因素。
一般来说，水和有机溶剂的组合常用于非极性或弱极性化合物的分离，而缓冲液常用于离子化合物的分离。
3. 在HPLC方法开发中，如何选择合适的检测器？选择检测器时需要考虑样品的性质、分离目标和分析条件等因素。
紫外检测器适用于吸收性化合物的检测，荧光检测器适用于荧光性化合物的检测，电导检测器适用于离子化合物的检测。
4. 在HPLC方法开发中，如何优化分离条件？优化分离条件可以通过调整流速、温度、pH值、固定相类型等参数来实现。
一般来说，较高的流速可以缩短分析时间，适当的温度可以提高分离效果，合适的pH值可以影响离子化合物的分离。
HPLC(液相色谱)常识及疑难详解(附实际操作图解)
1 液相色谱基础知识1.1 液相色谱名词术语Mobile phase：流动相，在色谱柱中存在着相对运动的两相，一相为固定相，一相为流动相。
流动相是指在色谱过程中载带样品（组分）向前移动的那一相。
Stationary phase：固定相，柱色谱或平板色谱中既起分离作用又不移动的那一相。
Gradient elution: 梯度洗脱,一个分析周期中，按一定程序不断改变流动相的浓度配比, 使一个复杂样品中的性质差异较大的组分能按各自适宜的容量因子k达到良好的分离目的。
Detection wavelength：检测波长，retention time：保留时间，被分离样品组分从进样开始到柱后出现该组分浓度极大值时的时间Peak:峰Peak Base：峰基线，经流动相冲洗，柱与流动相达到平衡后，检测器测出一段时间的流出曲线。
一般应平行于时间轴Peak Height：峰高，色谱峰顶点至峰底的距离。
Peak Width：峰宽，色谱峰两侧拐点处所作切线与峰底相交两点间的距离Peak Width at Half Height：半峰高宽Peak Area：峰面积Tailing Peak: 后沿较前沿平缓的不对称峰Leading Peak:前沿较后沿平缓的不对称峰Ghost Peak: 假峰，并非由试样所产生的峰Baseline Drift:基线漂移Baseline Noise:基线噪音Band Broadening:组分在色谱柱内移动过程中谱带宽度增加的现象. 1.2 流动相1.2.1 流动相类型正相液相色谱流动相：一般正相色谱固定相极性大于流动相极性，采用极性固定相（如聚乙二醇、氨基与腈基键合相）；流动相为相对非极性的疏水性溶剂（烷烃类如正已烷、环已烷），常加入乙醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯甲烷等以调节组分的保留时间。
常用于分离中等极性和极性较强的化合物（如酚类、胺类、羰基类及氨基酸类等），极性小的组分先出柱。
反相液相色谱流动相：一般用非极性固定相（如C18、C8）；流动相为水或缓冲液，常加入甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以调节保留时间。
hplc简介
HPLC简介下面我要向同学们介绍的就是HPLC，即高效液相色谱。
HPLC是常见的蛋白质分离技术之一。
我们已经做过的实验，比如柱层析、薄层层析和纸层析就是经典的液相色谱，它们所用的固定相大多为大于100um 的吸附剂（如硅胶、氧化铝等）。
而今天要介绍的HPLC，就是以这些经典的液相色谱为基础，以高压下的液体作为流动相的色谱过程。
我们知道传统的液相色谱所用的固定相颗粒比较大，传质扩散相对较慢，因而柱效低，分离能力差，只能进行简单的混合物的分离，比如叶绿素的分离实验。
那么相比于传统的液相色谱分离技术，HPLC究竟有什么不同呢？让我们先来了解一下高效液相色谱法的基本信息。
【基本信息】高效液相色谱法（HPLC）是20世纪60年代后期发展起来的一种分析方法。
近年来，在保健食品功效成分、营养强化剂、维生素类、蛋白质的分离测定等方面应用广泛。
世界上约有80%的有机化合物可以用HPLC来分析测定。
【分离原理】同其他色谱过程一样，HPLC也是溶质在固定相和流动相之间进行的一种连续多次交换过程。
它借溶质在两相间分配系数、亲和力、吸附力或分子大小不同而引起的排阻作用的差别使不同溶质得以分离。
简单举一个例子：假设样品中含有A、B、C三个组分。
样品随流动相一起进入色谱柱，在流动相和固定相之间进行分配。
A的分配系数小，则A不易被固定相阻留，最早流出色谱柱。
分配系数最大的C在固定柱上滞留时间最长，最后流出。
则B就介于AC之间流出，从而达到分离的目的。
所以总的来说，HPLC的分离原理就是：在色谱柱内填充细小而均匀的固体，而流动相携带各种蛋白质分子流经固定相，与固定相颗粒作为固定相，如C18发生相互作用（非共价性质）。
由于蛋白质间存在性质和结构上的差异，导致他们与固定相之间产生不同的作用力，最后各组分依据被保留的时间不同而顺序流出色谱柱。
通过检测器可以得到不同的峰信号，每个峰代表一个组分。
了解到HPLC的原理之后我们可以发现，其实它与经典的色谱分离并没有本质的差别。
waters_e2695_training
--中心实验室 唐翠娥
目录
1
HPLC 基础知识简介
2 HPLC 系统组成部件
3 Waters e2695实验操作
4
软件操作
5 常见色仪器和色谱图故障
HPLC 基础知识简介
表1.正相色谱法与反相色谱法比较表
Waters e2695 进样系统系统
五个独立的24位样品盘
Waters 2998 PDA检测器
PDA检测器的三维(3D)图
Waters液相操作
1、溶剂准备：色谱纯级别
a): 过滤—0.45μm滤膜（纤维素膜水溶液， 尼龙、PTFE通用型） b):脱气—超声3-5min，排除O2，N2等。保证流量准确，提高色谱图重现
Waters液相操作
2、开机一般流程：开启HPLC系统各个设备的电源。 1525系统：
开泵、柱温箱、自动进样器:待设备通过自检后，打开计 算机。 打开检测器电源:检测器通过自检后（3-5min）,才能被软 件控制, 建议有流动相流经检测器后再开启电源。 启动色谱管理软件,1525系统没有控制版面，所有操作都 需在软件上执行。
性，增加信噪比（低紫外去氧气吸收），保护色谱柱（填料氧化）。
c):溶剂截止波长：最好避免，如乙腈和水190nm, 甲醇和乙醇 210nm,等。 d):缓冲盐流动相：需现配现用，低温密封保存最多3天；
有机溶剂和缓冲盐（水）混配流动相，需低温保存。 e):溶剂混溶性：建议用色谱纯10%异丙醇or水作为过渡溶剂。
Waters液相操作
2）打开在线脱气机：在面板中直接操作或者软件
中打开。
液相色谱基础知识(waters)
H 3 C H 3 C
C H 2
C H 2
C H 2 C H 2
H 2 C
H 2 C
H 2 C H 2 C
C H 2
C H 2
C H 2 C H 2
H 2 C
H 2 C
H 2 C H 2 C
C H 2 H 2 C
H 2 C C H 2 H 2 C C H 2 H 2 C C H 2
H H 3 C S C i H 2 C H 3 H H 3 C S C i H 3 C H 3 H H 3 C S C i H 2 C H 3 H H 3 C S C i H 2 C H 3 H H 3 C S C i H 2 C H 3 H H 3 C S C i H 3 C H 3 O S O iO O S O iO O S O iO O S O iO O S O iO O S O iO O S O iO O S O iO O S O iO O S i O O O S O iO H O S O iO
离子交换柱(钙基/Ca)
用于单糖、双糖及糖醇等低分子量的糖、及乙醇等的分析。 主要用于药厂维生素C的原料分析(sorbitol/mannitol-山梨 醇/甘露醇)，酒厂(葡萄酒、啤酒等)的糖及乙醇含量的分析。
柱温~90℃，要求有柱温箱。对流动相(水)的要求较高，要求 用户另置超纯水系统。
T = 1.58 峰面积回收率
97.8 % 95.3 % 92.3 %
Waters 21,379
超越极限：全新Xterra色谱柱
集硅胶与聚合物基质填料的优点为一体,突破常规 高效色谱柱的极限 高效、高速分离
不仅能够使用极小粒径的填料以进行高分辨及快 速分析，而且允许在高温下进行分离
HPLC基本知识介绍
液相色谱基础HPLC基本知识介绍常见的分离方式❀蒸馏❀离心❀电泳❀过滤❀超滤✎色谱色谱法简介❀色谱法(Chromatography)溯源-Tswett应用吸附原理分离植物色素的新方法❀1906年正式命名(见诸文献)❀30年代开始广泛研究和应用❀高效液相色谱法的广泛应用始于70年代色谱分离的机理分离是一个物理的过程。
固定相(Stationary Phase)流动相(Mobile Phase)样品 (溶解于流动相中的溶质)什么是液相色谱？色谱液相色谱气相色谱柱色谱纸色谱薄层色谱高效液相色谱HPLC什么是高效液相色谱(HPLC)？❀HPLC (High Performance LiquidChromatography )—高效液相色谱法❀是一种区别于经典液相色谱,基于仪器方法的高效能分离手段:高性能色谱柱,高精度输液泵,高灵敏度检测器…❀广泛应用于各个领域:医药,环保,石化,生命科学,食品工业,农业…❀无论在技术上,理论上,还是在应用上仍处于发展阶段HPLC的仪器配置及流程色谱泵及控制器数据处理及控制进样器色谱柱检测器W a te rs486HPLC 的图形图形结果结果--色谱图(Chromatogram)色谱图:色谱柱流出物通过检测器时所产生的响应信号对时间 的曲线图,其纵坐标为信号强度,横坐标为保留时间.←色谱峰时间(分)基线↓峰高峰宽响应值液相色谱图相关术语(1)❀色谱图相关术语:组分通过检测器时产生✎色谱峰(Peak):色谱柱流出组分组分的响应信号的微分曲线✎峰底(Peak Base):峰的起点与终点之间连接的直线✎峰高(Peak Height):峰最大值到峰底的距离✎峰宽(Peak Width):在峰两侧拐点处所作切线与峰底相交两点之间的距离✎半(高)峰宽(Peak Width at Half Height):通过峰高的中点作平行于峰底的直线,其与峰两侧相交两点之间的距离液相色谱图相关术语(2)❀色谱图相关术语:✎峰面积(Peak Area):峰与峰底之间的面积,又称响应值✎标准偏差(σ)(Standard Error):0.607倍峰高处所对应峰宽的一半✎拖尾峰(Tailing Peak):后沿较前沿平缓的不对称峰✎前伸峰(Leading Peak):前沿较后沿平缓的不对称峰✎鬼峰(Ghost Peak):并非由试样所产生的峰,亦称假峰液相色谱图相关术语(3)❀色谱图相关术语:✎基线(Baseline):在正常操作条件下,仅由流动相所产生的响应信号的曲线✎基线飘移(Baseline Drift):基线随时间定向的缓慢变化✎基线噪声(N)(Baseline Noise):由各种因素所引起的基线波动✎谱带扩展(Band Broadening):由于纵向扩散,传质阻力等因素的影响,使组分在色谱柱内移动过程中谱带宽度增加的现象液相色谱图相关术语(4)❀色谱图相关术语:)(Dead time):不被固定相滞留的组分,✎死时间(t从进样到出现峰最大值所需的时间)(Retention time):组分从进样到出✎保留时间(tR现峰最大值所需的时间)(Dead volume):不被固定相滞留的组分,✎死体积(V从进样到出现峰最大值所需的流动相体积)(Retention volume):组分从进样到✎保留体积(VR出现峰最大值所需的流动相体积液相色谱的应用（一）❀“分析型液相色谱”❀定性及定量分析✎灵敏度的要求✎样品的复杂性✎样品量的要求✎精度及准确度的要求✎容易使用液相色谱的应用（二）❀“制备型液相色谱”❀分离及纯化✎化合物的稳定性✎样品的复杂性✎制备量的要求✎纯度的要求，及纯度的鉴定✎方法的安全性开发液相色谱方法❀液相色谱实验所需的基本参数:✔流动相:种类及配比(等度或梯度)✔固定相:色谱柱类型及内径,长短✔流动相输送系统参数:流速✔检测器参数:检测波长,灵敏度等✔温度控制✔进样量以上参数即构成一个具体的HPLC方法,亦称色谱条件评价液相色谱方法的标准问题∶什么样的分离结果是好的?分辨率?什么是色谱的分辨率？分辨率的公式：)(211212W W V V R +−=影响分辨率的因素：K ’,α,N ❀分辨率的方程∶✎ k‘ 是容量因子，表达了被分离组分与柱填料 的作用强弱。
HPLC基础知识
HPLC基础知识．概论高速——流速为0.1~10.0 ml/min。
高效——可达5000塔板每米。
在一根柱中同时分离成份可达100种。
高灵敏度——紫外检测器灵敏度可达0.01ng。
同时消耗样品少。
HPLC与经典液相色谱相比有以下优点：速度快——通常分析一个样品在15~30 min，有些样品甚至在5 min内即可完成。
分辨率高——可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果。
灵敏度高——紫外检测器可达0.01ng，荧光和电化学检测器可达0.1pg。
柱子可反复使用——用一根色谱柱可分离不同的化合物。
样品量少，容易回收——样品经过色谱柱后不被破坏，可以收集单一组分或做制备。
三、色谱法分类按两相的物理状态可分为：气相色谱法(GC)和液相色谱法(LC)。
气相色谱法适用于分离挥发性化合物。
GC根据固定相不同又可分为气固色谱法(GSC)和气液色谱法(GLC)，其中以GLC应用最广。
液相色谱法适用于分离低挥发性或非挥发性、热稳定性差的物质。
LC同样可分为液固色谱法(LSC)和液液色谱法(LLC)。
此外还有超临界流体色谱法(SFC)，它以超临界流体（界于气体和液体之间的一种物相）为流动相（常用CO2），因其扩散系数大，能很快达到平衡，故分析时间短，特别适用于手性化合物的拆分。
按原理分为吸附色谱法(AC)、分配色谱法(DC)、离子交换色谱法(IEC)、排阻色谱法(EC，又称分子筛、凝胶过滤(GFC)、凝胶渗透色谱法(GPC）和亲和色谱法。
（此外还有电泳。
）按操作形式可分为纸色谱法(PC)、薄层色谱法(TLC)、柱色谱法。
四、色谱分离原理高效液相色谱法按分离机制的不同分为液固吸附色谱法、液液分配色谱法（正相与反相）、离子交换色谱法、离子对色谱法及分子排阻色谱法。
1．液固色谱法使用固体吸附剂，被分离组分在色谱柱上分离原理是根据固定相对组分吸附力大小不同而分离。
分离过程是一个吸附－解吸附的平衡过程。
常用的吸附剂为硅胶或氧化铝，粒度5~10μm。
高效液相色谱法(HPLC)的概述
此帖与GC版的对应，是为了让大家更好的学习和了解LC主要内容包括：1.高效液相色谱法（HPLC）的概述2. 高效液相色谱基础知识介绍（1——13楼）3. 高压液相色谱HPLC发展概况、特点与分类4. 液相色谱的适用性5.应用高效液相色谱法（HPLC）的概述以高压液体为流动相的液相色谱分析法称高效液相色谱法（HPLC）。
其基本方法是用高压泵将具有一定极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂泵入装有填充剂的色谱柱，经进样阀注入的样品被流动相带入色谱柱内进行分离后依次进入检测器，由记录仪、积分仪或数据处理系统记录色信号或进行数据处理而得到分析结果。
由于高效液相色谱法具有分离效能高、选择性好、灵敏度高、分析速度快、适用X围广（样品不需气化，只需制成溶液即可）、色谱柱可反复使用的特点，在《中国药典》中有50种中成药的定量分析采用该法，已成为中药制剂含量测定最常用的分析方法。
高效液相色谱法按固定相不同可分为液-液色谱法和液-固色谱法；按色谱原理不同可分为分配色谱法（液-液色谱）和吸附色谱法（液-固色谱）等。
目前，化学键合相色谱应用最为广泛，它是在液－液色谱法的基础上发展起来的。
将固定液的官能团键合在载体上，形成的固定相称为化学键合相，不易流失是其特点，一般认为有分配与吸附两种功能，常以分配作用为主。
C18（ODS）为最常使用的化学键合相。
根据固定相与流动相极性的不同，液-液色谱法又可分为正相色谱法和反相色谱法，当流动相的极性小于固定相的极性时称正相色谱法，主要用于极性物质的分离分析；当流动相的极性大于固定相的极性时称反相色谱法，主要用于非极性物质或中等极性物质的分离分析。
在中药制剂分析中，大多采用反相键合相色谱法。
系统组成：（一）高压输液系统由贮液罐、脱气装置、高压输液泵、过滤器、梯度洗脱装置等组成。
1.贮液罐由玻璃、不锈钢或氟塑料等耐腐蚀材料制成。
贮液罐的放置位置要高于泵体，以保持输液静压差，使用过程应密闭，以防止因蒸发引起流动相组成改变，还可防止气体进入。
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