高效液相色谱基础知识
高效液相色谱-HPLCppt课件.ppt
色谱法的分类
按固定相的形态分:
平面色谱 o 纸色谱
o 薄层色谱
柱色谱
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的,因 此,篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
色谱法的分类示意图
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▪ 高压梯度洗脱(高压混合,高压进柱,2个 泵。)
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▪安捷伦泵:小视频 ▪色谱学堂:泵
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色谱法原理及分类
什么是色谱法 色谱法溯源 Tswett(茨维特)的实验 色谱法原理 色谱法的分类
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什么是色谱法
色谱法是一种现代的分离分析方法 1906年正式命名(见诸文献) 20世纪30年代开始广泛研究和应用 高效液相色谱法的广泛应用始于20世纪70年代
1. 紫外—可见光度检测器:
①固定波长:254nm , 低压汞 灯。
② 可 调 波 长 : 190 ~ 800mm , 钨灯,氘灯。
UV
③光电二极管矩阵检测器: 190~700nm。
接色谱柱 石英窗 光电倍增管
废液
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高效液相色谱(HPLC)基础知识
高效液相色谱(HPLC)基础知识我国药典收载高效液相色谱法项目和数量比较表:方法项目数量1985年版1990年版1995年版2000年版HPLC法鉴别9 34 150 检查12 40 160 含量测定7 60 117 387鉴于HPLC应用在药品分析中越来越多,因此每一个药品分析人员应该掌握并应用HPLC。
I.概论一、液相色谱理论发展简况色谱法的分离原理是:溶于流动相(mobile phase)中的各组分经过固定相时,由于与固定相(stationary phase)发生作用(吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和)的大小、强弱不同,在固定相中滞留时间不同,从而先后从固定相中流出。
又称为色层法、层析法。
色谱法最早是由俄国植物学家茨维特(Tswett)在1906年研究用碳酸钙分离植物色素时发现的,色谱法(Chromatography)因之得名。
后来在此基础上发展出纸色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、液相色谱法。
液相色谱法开始阶段是用大直径的玻璃管柱在室温和常压下用液位差输送流动相,称为经典液相色谱法,此方法柱效低、时间长(常有几个小时)。
高效液相色谱法(High performance Liquid Chromatography,HPLC)是在经典液相色谱法的基础上,于60年代后期引入了气相色谱理论而迅速发展起来的。
它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀,小颗粒具有高柱效,但会引起高阻力,需用高压输送流动相,故又称高压液相色谱法(High Pressure Liquid Chromatography,HPLC)。
又因分析速度快而称为高速液相色谱法(High Speed Liquid Chromatography,HSLP)。
也称现代液相色谱。
二、HPLC的特点和优点HPLC有以下特点:高压——压力可达150~300 Kg/cm2。
色谱柱每米降压为75 Kg/cm2以上。
高速——流速为0.1~10.0 ml/min。
液相色谱基础知识
液相色谱—视差折光检测器
检测器组成:光源——透镜——两 束平行光——样品池和参比池—— 光电二极管——比较两者信号差 值——输出信号 。
液相色谱—凝胶色谱
பைடு நூலகம்
凝胶渗透色谱仪(GPC仪)、体积 排阻色谱(Size Exclusion Chrom.) 。 分离原理:利用多孔物质做固定相, 按照待测组分分子尺寸大小进行分 离。测定相对分子量大小、分子量 分布。
环己烷
正丁醇 乙醇 水 异丙醇
乙酸正丙酯
丙酸甲酯 四氯化碳 N,N-二甲基 甲酰胺 苯
260
260 265 270 280
碘甲烷
二硫化碳 硝基甲烷 硝基乙烷 2-硝基丙烷
350
380 380 380 380
甲醇
甲苯
285
液相色谱—荧光检测器
荧光检测器:样品中物质分子能在 特定波长的光激发后跃迁到高能级 状态,在返回到基态的过程中,会 发出波长较长的光,称做荧光。 荧光强度F=I0Φabc I0——激发光强度 Φ——荧光量子产率
Refractive Index Detector
A valve is opened and pure solvent passes into one half of a cell. The eluate flows through the other half of the cell. The two halves are separated by a glass plate mounted at an angle such that bending of the incident beam occurs if the two solutions differ in refractive index.
HPLC基础知识
第一章高效液相色谱仪的特点混合物最有效的分离、分析方法。
俄国植物学家茨维特在1906年分离叶绿素,色谱法是一种分离技术。
混合物分离过程:试样中各组分在称之为色谱分离柱中的两相间不断进行着的分配。
一相固定不动,称为固定相。
另一相是携带试样混合物流过固定相的流体(气体或液体),称为流动相。
特点:高压、高效、高速、高灵敏适合高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。
与GC 互补性三、液相色谱组成:(一)、输液系统泵、进样阀、色谱柱、检测器、工作站(记录仪)(二)、附件过滤装置、脱气装置、柱温箱、收集装置等等。
(三)、工作程序:液体进入泵-压力传感器-脉动缓冲器-进样阀-色谱柱检测器(四)、泵体组成部分:电机、马达、双柱塞串联泵腔、缓冲器、压力传感器、面贴(五)、检测器组成部分:1、电器部分(变压器、氘灯板、系统电源伴、控制板、显示板、前置板、面贴)2、光学部分(氘灯、灯箱、光学盒、凹面镜、分光镜、小参比、单色器、流通池、前置板)(六)、HPLC的分类1、吸附色谱Adsorption Chromatography用固体吸附剂作固定相,以不同极性溶剂做流动相依据样品中各组分在吸附剂上吸附性能的差别来实现分离。
2、分配色谱Partition Chromatography用载带在固相基体上的固定液做固定相,以不同极溶剂作流动相。
依据样品中各组分在固定液上分配性能的差别来实现分离。
3、离子色谱Ion Chromatography用高效微粒离子交换剂作固定相,以具有一定PH值的缓冲液做流动相,依据离子型化合物中各离子组分与离子交换剂上表面带电荷基团进行可逆离子交换能力的差别来实现分离。
4、体积排阻色谱Size Exclusion Chromatography用化学惰性的多孔性凝胶做固定相,按固定相对样品中组分分子体积阻滞作用的差别来实现分离。
又分:a、Gel Filtration Chromatography(GFC)以水为流动相的体积排阻色谱b、Gel Permeation Chromatography(GPC)以有机溶剂为流动相的体积排阻色谱5、亲和色谱以在不同基体上,键合多种不同特性的特性的配位体做固定相用具有不同PH值的缓冲溶液作流动相,依据生物分子(氨基酸、肽、蛋白质、核碱、核酸、核苷酸、酶等)与基体上键合的配位体之间存在的特异性亲和作用能力的差别而实现对具有生物活性的生物分子的分离。
液相色谱法和高效液相色谱法
溶剂等级
➢ 不管采用何种途径,配制流动相应用新鲜水,放置 时间越短,水质越高。
➢ 理想的HPLC用水应为18.2MΩ的超纯水,并通过 0.22um的滤膜,除去热源、有机物、无机离子及空 气等。
溶剂等级
有机溶剂的等级 HPLC级 优级纯 分析纯
都经过蒸馏和0.45µm的过滤(除纤维毛,未溶解的机械颗粒) 优级纯的纯度比分析纯大,但里面含有防腐剂和抗氧化剂 HPLC级经过0.2µm的过滤,且除去有紫外吸收的杂质
《仪器分析》
液相色谱法
高效液相色谱法
High Performance Liquid Chromatography
For Short:HPLC
色谱基础知识
主要内容
液相色谱法基础知识 液相色谱仪的主要部件
液相色谱仪的维护
色谱基础知识
色谱起源
1903年俄国植物学家 M. S. Tswett 提出经典液相色谱
C18柱的使用注意点
柱压应低于柱子的承受压力 柱温在40℃左右,最高使用温度为50℃ 缓冲液pH使用范围为2~7
硅胶在PH为3~4时稳定性最好 碱浓度越低,流动相含水量越低,硅胶越稳定。
检测器 进样器
储液瓶 高压输液系统
输液泵
数据处理系统
柱温箱
常用检测器
紫外检测器(UV) 二极管阵列检测器(PDA) 荧光检测器(FL) 示差折光检测器 蒸发光散射检测器
溶剂等级
分析纯级(实线)和 HPLC 级溶剂(虚线)的吸光度比较
甲醇
乙睛
正己烷
溶剂等级
缓冲盐的使用:
使用前必须过滤 使用后一定要对柱子进行清洗 ,以免造成腐蚀、磨
损及阻塞:首先用纯水冲洗10-30min,再用甲醇冲 洗30min(0.5-1ml/min)
高效液相色谱提纲
高效液相色谱提纲色谱的基础知识第一章色谱分析法概述一、色谱分析法发展简介二、色谱法分类1、按两相状态分类2、按操作形式分类3、按分离原理分类三、HPLC与其他方法的比较1. 色谱法与精馏、萃取分离比较2. 色谱法与光谱、质谱分析方法比较3. 高效液相色谱与经典色谱的比较4. 液相色谱与气相色谱的比较四、色谱法特点五、现代色谱法应用领域六、有关色谱主要期刊与书籍第二章色谱分析法的理论基础一、色谱流出曲线二、色谱图中的基本术语三、分配平衡四、色谱法的基本理论五、色谱法基本分离方程第三章色谱定性分析和定量分析一、定性分析二、定量分析高效液相色谱的知识第四章高效液相色谱仪第五章色谱分离系统一、液相色谱分离原理及分类(一)分离原理(二)高效液相色谱法的主要类型二、高效液相色谱的固定相1. 高效液相色谱固定相以承受高压能力来分类2.高效液相色谱固定相按孔隙深度分类3. 高效液相色谱固定相以化学组成来分类三、流动相1.对流动相溶剂的要求:2. 流动相及流动相的极性3. 流动相的组成四、色谱柱1. 色谱柱的构型2. 色谱柱寿命第六章液固色谱法和液液色谱法一、液一固吸附色谱法(LSAC)1.分离原理 2.固定相 3.流动相二、液一液分配色谱法(LLPC)1.分离原理 2.固定相 3.流动相第七章化学键合相色谱法一、化学键合固定相二、反相键合相色谱法三、正相键合相色谱法四、离子性键合相色谱法第八章离子交换和离子色谱法一、离子交换色谱法1.离子交换色谱原理2.固定相3.流动相二、离子色谱法1.离子色谱法原理2.离子色谱具有以下优点3.离子色谱装置类型4.离子色谱的应用第九章体积排阻色谱法高效液相色谱同时测定食品中的苯甲酸、山梨酸、糖精钠、维生素C高效液相色谱同时测定药品中的苯甲酸与水杨酸样品处理、条件优化及应用第十章色谱分析样品处理一、样品的采集二、常用样品制备技术(一)溶剂萃取***1. 液-液萃取液-液萃取新技术——液相微萃取2. 液-固萃取3. 液-气萃取(溶液吸收)4. 萃取溶剂的选择(二)蒸馏1. 简单蒸馏2. 分馏3. 减压蒸馏4. 水蒸气蒸馏(三)固相萃取***1. 固相萃取的模式及原理2. 固相萃取的常用吸附剂3. 固相萃取的装置及操作程序4. 固相萃取技术的应用(四)膜分离(五)衍生化技术*(六)其它样品制备技术*1. 超临界流体萃取2. 微波萃取技术第十一章衍生化技术及浓缩柱一、衍生化技术(一)按衍生化反应分类1.衍生化反应满足条件2. 按衍生化反应类别分类(二)按衍生化的方式分类1. 柱前衍生2. 柱后衍生二、浓缩柱第十二章高效液相色谱分离条件的优化及建立分析方法的一般步骤一、高效液相色谱分离条件的优化(一)高效液相色谱中色谱参数的相关性1. 色谱参数的分类2. 色谱参数的相关性(二)色谱分离条件优化标准的选择1. 难分离物质对的峰对分离优化标准2. 整体色谱图的优化标准二、建立HPLC分析方法的一般步骤(一)样品的性质及柱分离模式的选择1. 样品的溶解度2. 样品的分子量范围3. 样品的分子结构和分析特性(二)分离操作条件的选择1. 容量因子和死时间的测量2. 色谱柱操作参数的选择3. 样品组分保留值和容量因子的选择4. 相邻组分的选择性系数和分离度的选择第十三章高效液相色谱法的实验技术和分析应用一、高效液相色谱法的实验技术1. 溶剂的纯化技术2. 色谱柱的装填技术3. 色谱柱的平衡、保护与清洗、再生技术二、HPLC法的分析应用第十四章液相制备色谱。
高效液相色谱基础知识总结
(LC-MS),有效的弥补了色谱法定性分析特征性差的弱 点,成为最重要的分离分析方法之一, LC-MS在选择性、 灵敏度、分子量测定和提供结构信息方面具有明显的优 势,能够同时获得可靠的定性定量结果,因而被广泛应 用于药物的质量控制(杂质、副产物、降解产物等的鉴 定和测定)、药物在生物体内的吸收、分布和代谢研究 (包括代谢物的结构确定及定量)和临床医学研究(如 蛋白异常的研究)。 LC-MS已成为新药研究必不可少的 手段。20世纪70年代,高效液相色谱法崛起克服了
高效液相色谱基础知识总结
二、基本概念和术语
一、色谱图和峰参数 1、色谱图(chromatogram)--样品流经色谱柱和检测器, 所得到的信号-时间曲线,又称色谱流出曲线(elution profile)。 2、基线(base line)--经流动相冲洗,柱与流动相达到 平衡后,检测器测出一段时间的流出曲线。一般应平行 于时间轴。基线反映仪器及操作条件的恒定程度,主要 由流动相中的杂质等因素决定。
键合相色谱法是将类似于气相色谱中的固定液的液 体,通过化学反应键合到硅胶表面,从而形成固定相。
高效液相色谱基础知识总结
采用化学键合固定相的色谱法称为键合相色谱。若采用 极性键合相、非极性流动相,则称为正相色谱;采用非 极性键合相、极性流动相,则称为反相色谱。这种分离 的保留值大小,主要决定于组分分子与键合固定液分子 间作用力的大小。
高效液相色谱基础知识总结
气相色谱法不能直接用于分析难挥发、热不稳定及高分 子化合物等的弱点,大大扩大了色谱法的应用范围,把 色谱法推进到一个新水平。
高效液相色谱(high performance liquid chromatography, HPLC)是一种高效、快速的分离分析 技术,具有灵敏度高、选择性好的特点。HPLC具有的同 时分离和分析的功能对于体内药物分析和体内内源性物 质的分析及成分复杂的中药分析尤其重要。 HPLC的分离 功能还广泛用于药物的纯化和制备,如用制备色谱分离
(干货)液相色谱基础知识大全
一、基本原理高效液相色谱(HPLC)法是以高压下的液体为流动相,并采用颗粒极细的高效固定相的柱色谱分离技术。
高效液相色谱对样品的适用性广,不受分析对象挥发性和热稳定性的限制,因而弥补了气相色谱法的不足。
在目前已知的有机化合物中,可用气相色谱分析的约占20%,而80%则需用高效液相色谱来分析。
高效液相色谱和气相色谱在基本理论方面没有显著不同,它们之间的重大差别在于作为流动相的液体与气体之间的性质的差别。
二、高效液相色谱分析原理(1)、高效液相色谱分析的流程:由泵将储液瓶中的溶剂吸入色谱系统,然后输出,经流量与压力测量之后,导入进样器。
被测物由进样器注入,并随流动相通过色谱柱,在柱上进行分离后进入检测器,检测信号由数据处理设备采集与处理,并记录色谱图。
废液流入废液瓶。
遇到复杂的混合物分离(极性范围比较宽)还可用梯度控制器作梯度洗脱。
这和气相色谱的程序升温类似,不同的是气相色谱改变温度,而HPLC改变的是流动相极性,使样品各组分在最佳条件下得以分离。
(2)、高效液相色谱的分离过程:同其他色谱过程一样,HPLC也是溶质在固定相和流动相之间进行的一种连续多次交换过程。
它借溶质在两相间分配系数、亲和力、吸附力或分子大小不同而引起的排阻作用的差别使不同溶质得以分离。
开始样品加在柱头上,假设样品中含有3个组分,A、B和C,随流动相一起进入色谱柱,开始在固定相和流动相之间进行分配。
分配系数小的组分A不易被固定相阻留,较早地流出色谱柱。
分配系数大的组分C在固定相上滞留时间长,较晚流出色谱柱。
组分B的分配系数介于A,C之间,第二个流出色谱柱。
若一个含有多个组分的混合物进入系统,则混合物中各组分按其在两相间分配系数的不同先后流出色谱柱,达到分离之目的。
不同组分在色谱过程中的分离情况,首先取决于各组分在两相间的分配系数、吸附能力、亲和力等是否有差异,这是热力学平衡问题,也是分离的首要条件。
其次,当不同组分在色谱柱中运动时,谱带随柱长展宽,分离情况与两相之间的扩散系数、固定相粒度的大小、柱的填充情况以及流动相的流速等有关。
高效液相色谱法
• (二)高效液相色谱仪工作流程及主要组成部分
• 高效液相色谱仪主要有分析型、制备型和专用型3类。一般由s个部分 组成:高压输液系统、进样系统、分离系统、检测系统和数据处理系 统。
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一、背景知识
• 1.仪器工作流程 • 高效液相色谱仪现在多做成一个个单元组件,然后根据分析要求将各
• 4)检测系统 • 检测器的作用是将柱流出物中样品组成和含量的变化转化为可供检测
的信号,常用检测器有紫外吸收、荧光、示差折光、化学发光等。 • (1)紫外可见吸收检测器(UVD, Ultraviolet Visible Detector)。 • 紫外可见吸收检测器(UVD)是HPLC中应用最广泛的检测器之一,几
段地改变配比浓度,以达到改变流动相极性、离子强度或pH值,从 而提高洗脱能力,改善分离的一种有效方法。
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一、背景知识
• 2)进样器 • 进样器一般要求密封性好,死体积小,重复性好,保证中心进样,进
样时对色谱系统的压力和流量波动小,并便于实现自动化。 • 微量进样注射器和高压进样阀是目前广泛采用的两种进样器。阀的种
模块五高效液相色谱法
• 一、背景知识 • 二、项目化教学参考方案
一、背景知识
• (一)概述
• 高效液相色谱法(HPLG , High Performance , Liquid Chromatography)是在经典液相色谱法基础上发展起来的一种新型 分离、分析技术。经典液相色谱法由于
• 使用粗颗粒的固定相,填充不均匀,依靠重力使流动相流动,因此分 析速度慢,分离效率低。新型高效的固定相、高压输液泵、梯度洗脱 技术以及各种高灵敏度的检测器相继发明,使高效液相色谱法迅速发 展起来。
高效液相色谱分析法 HPLC
§2-3 各类高效液相色谱法简介
一、液固吸附色谱法(LSC) (liquid-solid adsorption chromatography)
二、液液分配色谱法(LLC) (liquid-liquid partition chromatography, chemical bonded phase chromatography
2.流动相差别的区别 GC:流动相为惰性,气体组分与流动相无亲合作用
力,只与固定相有相互作用。 HPLC:流动相为液体,流动相与组分间有亲合作用
力,能提高柱的选择性、改善分离度,对分离起 正向作用。且流动相种类较多,选择余地广,改 变流动相极性和pH值也对分离起到调控作用,当 选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相 也可以增大分离选择性。 3.操作条件差别 GC:加温操作 HPLC:室温;高压(液体粘度大,峰展宽小)
2.进样装置 1)隔膜进样(高分子有机硅胶垫→进样室)
GC系统压力较小,可以 HPLC系统压力太大,必须停泵进样(早期) 2)阀进样:不必停泵,六通阀
液相色谱
3.色谱柱:直径4~6mm,柱长10~30cm 柱效评价:色谱系统适应性试验 R,n,fs(拖尾因子) 柱再生:维护、保养、柱子的冲洗
4.检测器 1)紫外检测器:适于吸收紫外光的物质 2)荧光检测器:只能分析自身发光的物质 灵敏度高 3)示差折光检测器:利用折光率的差别 灵敏度低,温度要求严格 4)电化学检测器 5)化学发光
注:调节溶剂极性,可以控制组分的保留时间 5.出柱顺序:强极性组分后出柱,弱极性组分先出柱 6.硅胶吸水量↑,LSC→LLC • 硅胶含水量较小 吸附色谱 硅胶极性较大 • 硅胶含水量>17% 分配色谱 硅胶失活→载体
高效液相试题及答案(终审稿)
高效液相试题及答案文稿归稿存档编号:[KKUY-KKIO69-OTM243-OLUI129-G00I-FDQS58-高效液相色谱基础知识测试一、填空题1、我们公司所用的高效液相色谱仪的品牌是:安捷伦1260 。
高效气相色谱仪的型号是安捷伦 7890 。
2、高效液相色谱系统由恒温器、四元泵、进样器、色谱柱、检测器和分析系统组成。
3、本公司所用的高效液相,为防止压力过大导致柱内填料空间发生变化,影响分离效果。
一般采用C18(十八烷基硅烷键合硅胶)填料的色谱柱,最高工作压力为400 bar。
4、高效液相根据流动相与固定相极性分为:正相高效液相色谱和反相高效液相色谱。
5、开机步骤:接通电源,依次开启不间断电源、真空脱气机、四元泵、检测器,待泵和检测器自检结束后,打开电脑显示器、主机,最后打开色谱工作站。
6、高效液相的维护:最后一次进样完成后,应用流动相冲洗20分钟,以保证洗脱完全,若流动相中含有无机盐类,应用高纯水冲洗30分钟,。
7、进样器的保养:每次分析结束后,要反复冲洗进样口,防止样品的交叉污染。
8、气相色谱仪常用的检测器有热导检测器,氢火焰检测器,电子捕获检测器和火焰光度检测器。
二、选择题1.在液相色谱法中,提高柱效最有效的途径是( D )A.提高柱温B.降低板高C.降低流动相流速D.减小填料粒度2. 在高固定液含量色谱柱的情况下,为了使柱效能提高,可选用 ( A )A.适当提高柱温B.增加固定液含量C.增大载体颗粒直径D.增加柱长3. 在液相色谱中, 为了提高分离效率, 缩短分析时间, 应采用的装置是 ( B )A. 高压泵B. 梯度淋洗C. 贮液器D. 加温4. 在液相色谱中, 最通用型检测器是 ( A )A.示差折光检测器B.极谱检测器C.荧光检测器D.电化学检测器5. 在液相色谱中, 为了获得较高柱效能, 常用的色谱柱是 ( A )A.直形填充柱B.毛细管柱C.U形柱D.螺旋形柱6. 实验室常用气相色谱仪的基本组成是( B )。
HPLC(液相色谱)常识及疑难详解(附实际操作图解)
1 液相色谱基础知识1.1 液相色谱名词术语Mobile phase:流动相,在色谱柱中存在着相对运动的两相,一相为固定相,一相为流动相。
流动相是指在色谱过程中载带样品(组分)向前移动的那一相。
Stationary phase:固定相,柱色谱或平板色谱中既起分离作用又不移动的那一相。
Gradient elution: 梯度洗脱,一个分析周期中,按一定程序不断改变流动相的浓度配比, 使一个复杂样品中的性质差异较大的组分能按各自适宜的容量因子k达到良好的分离目的。
Detection wavelength:检测波长,retention time:保留时间,被分离样品组分从进样开始到柱后出现该组分浓度极大值时的时间Peak:峰Peak Base:峰基线,经流动相冲洗,柱与流动相达到平衡后,检测器测出一段时间的流出曲线。
一般应平行于时间轴Peak Height:峰高,色谱峰顶点至峰底的距离。
Peak Width:峰宽,色谱峰两侧拐点处所作切线与峰底相交两点间的距离Peak Width at Half Height:半峰高宽Peak Area:峰面积Tailing Peak: 后沿较前沿平缓的不对称峰Leading Peak:前沿较后沿平缓的不对称峰Ghost Peak: 假峰,并非由试样所产生的峰Baseline Drift:基线漂移Baseline Noise:基线噪音Band Broadening:组分在色谱柱内移动过程中谱带宽度增加的现象. 1.2 流动相1.2.1 流动相类型正相液相色谱流动相:一般正相色谱固定相极性大于流动相极性,采用极性固定相(如聚乙二醇、氨基与腈基键合相);流动相为相对非极性的疏水性溶剂(烷烃类如正已烷、环已烷),常加入乙醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯甲烷等以调节组分的保留时间。
常用于分离中等极性和极性较强的化合物(如酚类、胺类、羰基类及氨基酸类等),极性小的组分先出柱。
反相液相色谱流动相:一般用非极性固定相(如C18、C8);流动相为水或缓冲液,常加入甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以调节保留时间。
高效液相色谱法教案
高效液相色谱法教案
一、课时安排
课时安排| 教学内容
1 | 液相色谱基础知识介绍
2 | 实验工艺要求及操作细节介绍
3 | 数据分析与结果评价
二、教学目标
1. 掌握高效液相色谱的原理及实验步骤;
2. 学会如何用高效液相色谱检测物质的实验方法;
3. 能够正确评价液相色谱的结果和数据分析;
4. 掌握液相色谱在实际生产中的应用。
三、教学内容
1. 高效液相色谱的原理及实验步骤:
介绍高效液相色谱的操作原理,建立色谱柱,确定检测射入方式,调节pH值,控制升温排量率,调节流速等步骤;
2. 实验工艺要求及操作细节介绍:
通过理论讲解及实际操作,让学生熟练掌握操作和实验注意事项;
3. 数据分析与结果评价:
通过给出的数据让学生灵活分析,结合实际情况,来判断实验的成果是否达到要求,进行正确评价。
四、活动组织
以理论讲解结合实实操作的方式,依次完成操作过程和检测结果,批改数据分析结果,综合实验结果判断实验成果。
高效液相色谱柱基础知识
色谱柱的种类
➢ 高分子聚合物 • 常用的是以高交联度的苯乙烯-二乙烯苯或聚甲基丙
烯酸酯为基质的球形填料。 • 压力限度比无机填料低; • 在整个pH范围内稳定,可以用NaOH或强碱来清洗
分离有机酸、碱、盐这些离子型化合物。 ➢ 样品容量随烷基链长增加而增大,且长链烷基可
使溶质的保留值增大,并常常可改善分离的选择 性;短链烷基键合相具有较高的覆盖度,分离极 性化合物时可得到对称性较好的色谱峰。苯基键 合相与短链烷基键合相的性质相似。
反相键合相色谱
流动相为极性的水或缓冲液,常加入甲醇、 乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶 的有机溶剂以调节保留时间。
ZORBAX Extend-C18,pH9~12, ➢ 基质的颗粒度 颗粒度越小:柱效越高(传质好,涡流扩散小),分离度越好,柱压
越高(渗透性差),常用5μ。 ➢ 基质的颗粒分布 颗粒分布越宽:柱效低(渗透性差) ➢ 基质的颗粒形状 球型:柱效高、重现性好、柱床结构均匀 无定型(不规则形状):柱床结构不均匀,流动相线性速度不均匀,
色谱柱 ; • 聚合物基质在流动相发生变化时会出现膨胀或收缩,
对于小分子化合物柱效低; • 主要用于大分子化合物,常制成凝胶柱或离子交换
柱。
化学键合相色谱柱
➢ 定义:将有机官能团通过化学反应共价键合到硅胶 表面的游离羟基上而形成的固定相称为化学键合相。
➢ 种类 非极性键合相(反相):键合相表面基团为非极性
高效液相色谱柱基础知识
张润平
色谱柱的构造
✓ 色谱柱由柱管、填料压帽、卡套(密封环)、筛板(滤片)、 于70 kg/cm2 时,也可采用 厚壁玻璃或石英管。为提高柱效,减小管壁效应,管内壁要求 有很高的光洁度,不锈钢柱内壁多经过抛光。
高效液相色谱法(HPLC)的概述
此帖与GC版的对应,是为了让大家更好的学习和了解LC主要内容包括:1.高效液相色谱法(HPLC)的概述2. 高效液相色谱基础知识介绍(1——13楼)3. 高压液相色谱HPLC发展概况、特点与分类4. 液相色谱的适用性5.应用高效液相色谱法(HPLC)的概述以高压液体为流动相的液相色谱分析法称高效液相色谱法(HPLC)。
其基本方法是用高压泵将具有一定极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂泵入装有填充剂的色谱柱,经进样阀注入的样品被流动相带入色谱柱内进行分离后依次进入检测器,由记录仪、积分仪或数据处理系统记录色信号或进行数据处理而得到分析结果。
由于高效液相色谱法具有分离效能高、选择性好、灵敏度高、分析速度快、适用X围广(样品不需气化,只需制成溶液即可)、色谱柱可反复使用的特点,在《中国药典》中有50种中成药的定量分析采用该法,已成为中药制剂含量测定最常用的分析方法。
高效液相色谱法按固定相不同可分为液-液色谱法和液-固色谱法;按色谱原理不同可分为分配色谱法(液-液色谱)和吸附色谱法(液-固色谱)等。
目前,化学键合相色谱应用最为广泛,它是在液-液色谱法的基础上发展起来的。
将固定液的官能团键合在载体上,形成的固定相称为化学键合相,不易流失是其特点,一般认为有分配与吸附两种功能,常以分配作用为主。
C18(ODS)为最常使用的化学键合相。
根据固定相与流动相极性的不同,液-液色谱法又可分为正相色谱法和反相色谱法,当流动相的极性小于固定相的极性时称正相色谱法,主要用于极性物质的分离分析;当流动相的极性大于固定相的极性时称反相色谱法,主要用于非极性物质或中等极性物质的分离分析。
在中药制剂分析中,大多采用反相键合相色谱法。
系统组成:(一)高压输液系统由贮液罐、脱气装置、高压输液泵、过滤器、梯度洗脱装置等组成。
1.贮液罐由玻璃、不锈钢或氟塑料等耐腐蚀材料制成。
贮液罐的放置位置要高于泵体,以保持输液静压差,使用过程应密闭,以防止因蒸发引起流动相组成改变,还可防止气体进入。
高效液相试题及答案
高效液相色谱基础知识测试一、填空题1、我们公司所用的高效液相色谱仪的品牌是:安捷伦1260 .高效气相色谱仪的型号是安捷伦7890 。
2、高效液相色谱系统由恒温器、四元泵、进样器、色谱柱、检测器和分析系统组成。
3、本公司所用的高效液相,为防止压力过大导致柱内填料空间发生变化,影响分离效果.一般采用C18(十八烷基硅烷键合硅胶)填料的色谱柱,最高工作压力为400 bar.4、高效液相根据流动相与固定相极性分为:正相高效液相色谱和反相高效液相色谱。
5、开机步骤:接通电源,依次开启不间断电源、真空脱气机、四元泵、检测器,待泵和检测器自检结束后,打开电脑显示器、主机,最后打开色谱工作站。
6、高效液相的维护:最后一次进样完成后,应用流动相冲洗20分钟,以保证洗脱完全,若流动相中含有无机盐类,应用高纯水冲洗30分钟,。
7、进样器的保养:每次分析结束后,要反复冲洗进样口,防止样品的交叉污染。
8、气相色谱仪常用的检测器有热导检测器,氢火焰检测器,电子捕获检测器和火焰光度检测器。
二、选择题1.在液相色谱法中,提高柱效最有效的途径是( D )A。
提高柱温B。
降低板高C。
降低流动相流速 D.减小填料粒度2。
在高固定液含量色谱柱的情况下,为了使柱效能提高,可选用( A ) A.适当提高柱温B。
增加固定液含量C。
增大载体颗粒直径D。
增加柱长3。
在液相色谱中,为了提高分离效率,缩短分析时间, 应采用的装置是(B )A. 高压泵B。
梯度淋洗C。
贮液器D。
加温4. 在液相色谱中,最通用型检测器是(A )A.示差折光检测器B.极谱检测器C.荧光检测器D。
电化学检测器5。
在液相色谱中, 为了获得较高柱效能, 常用的色谱柱是( A )A.直形填充柱B。
毛细管柱C。
U形柱D。
螺旋形柱6。
实验室常用气相色谱仪的基本组成是( B )。
(1)光源;(2)气路系统;(3)单色器系统;(4)进样系统;(5)分离系统;(6)吸收系统;(7)电导池;(8)检测系统;(9)记录系统.A 1-3—6-8-9B 2—4-5-8—9C 2-4—5—7—9D 2-4—6—7—97.在气相色谱定性分析中,实验室之间可以通用的定性参数是( D ).A 调整保留时间B 校正保留时间C保留时间D相对保留值三、判断题:(正确—————√;错误-——-×)1. 确基线噪音和漂移是检测器稳定性的主要技术指标( √)2. 灵敏度是检测器的主要性能指标( √)3。
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波清 洗;③用10%稀硝酸清洗。
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9.气泡会致使压力不稳,重现性差,所以在使用过程中要尽 量避免产生气泡。 10.如果进液管内不进液体时,要使用注射器吸液:通常在输 液前要进行流动相 的清洗。
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11.要注意柱子的PH值范围,不得注射强酸强碱的样品,特别是
碱性样品。
12.更换流动相时应该先将吸滤头部分放入烧杯中边振动边清洗
⑥RSD: <3%
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八、 谱图的判断 及结果计算
1、内标法 用含对照品和内标物质的对照溶液所得色谱峰响应值, 按下式算出校正因子(f):
其中 As和Ar分别为内标物质和对照品的峰面积或峰高,ms和mr 分别为加入内标物质和对照品的量。
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八、 谱图的判断 及结果计算
2、外标法:
①用含对照品的对照溶液所得色谱峰响应值,按下式计算比值(r)
2、流动相过滤后要用超声波脱气,脱气后应该恢复到室温 后使用。
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3、不能用纯乙腈作为流动相,这样会使单向阀粘住而导致泵
不进液。
4、使用缓冲溶液时,做完样品后应立即用去离子水冲洗管路 及柱子一小时,然 后用甲醇(或甲醇水溶液)冲洗40分钟以 上,以充分洗去离子。对于柱塞杆 外部,做完样品后也必
须用去离子水冲洗20ml以上。
,然后插入新的 流动相中。更换无互溶性的流动相时要用异
丙醇过渡一下。
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谢谢大家!
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第三节 高效液相色谱中 常遇见的问题及处理方法
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一、 保留时间变化
1.柱温变化 2.等度与梯度间未能充分平衡 1.柱恒温 2.至少用10倍柱体积的流动相平衡柱
3.缓冲液容量不够
4.柱污染 5.柱内条件变化 6.柱快达到寿命
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九、 清洗管路及进样口
2、 冲洗完毕后,逐步降低流速至0,关泵,进样器也应用
相应溶剂冲洗,可使用进样阀所附专用冲洗接头。
3 、关断电源,作好使用登记,内容包括日期、检品、色谱 柱、流动相、柱压,使用小时数,仪器完好状态等。
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九、 清洗管路及进样口
【特殊情况】:谱流路系统,从泵、进样器、色谱柱、 到检测器通池,在分析完毕后,均应按(5.1)充分冲 洗,特别是用过含盐流动相的,更应注意先用水,再 用甲醇-水,充分冲洗。
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六、 平衡系统
1、查看基线:
1.1:按《N2000色谱数据工作站操作规程》打开“在线色谱工作站”软件
, 1.2:输入实验信息并设定各项方法参数后, 1.3:按下“数据收集”页的 [ ] 按钮。
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六、 平衡系统
2 、等度洗脱方式
2.1 :按A泵的[pump]键,A、B泵将同时启动,pump指示灯亮。用检 验方法规定的流动相冲洗系统,一般最少需6倍柱体积的流动相。 2.2 :检查各管路连接处是否漏液,如漏液应予以排除。 2.3 :观察泵控制屏幕上的压力值,压力波动应不超过1MPa。如超过 则可初步判断为柱前管路仍有气泡,按检查管路后再操作。 2.4 :观察基线变化。如果冲洗至基线漂移<0.01mV/min,噪声为 <0.001mV时,可认为系统已达到平衡状态,可以进样。
: r=mr/Ar(其中 mr和 Ar分别为对照品的量和相应的峰面积或 峰高。 ) ②再根据供试品溶液的色谱峰响应值,计算供试品中被测成分的含 量(mi): mi=r×Ai(其中 Ai为供试品溶液中被测成分的峰面 积或峰高)。 ③必要时,再根据稀释倍数、取样量和标示量折算成标示量的百分 含量,或根据稀释倍数、取样量折算成百分含量。
第一节 岛津LC-10AT型 HPLC操作规程
1
目的:规范岛津LC-10AT型高效液相色谱仪的使用。
范围:适用于岛津LC-10AT型高效液相色谱仪的使用。 职责:质检员对本规程的实施负责。
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一、 系统组成
本系统由2个LC-10ATvp溶剂输送泵(分主 /A泵和副/B泵)、Rheodyne 7725i手动进样阀、 SPD-10Avp紫外-可见检测器、N2000色谱数据工 作站和电脑等组成,另外还包括打印机、不间断 电源等辅助设备。
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四、操作过程
6、 实验结束后,一般先用水或低浓度甲醇水溶液冲洗整 个管路 30分钟以上,再用甲醇冲洗。冲洗过程中关闭 D灯、W灯;
7、 关机时,先关闭泵、检测器等,再关闭工作站,然后 关机,最后自下而上关闭色谱仪各组件,关闭洗泵溶 液的开关;
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四、操作过程
8、 使用者须认真履行仪器使用登记制度,出现问题及时
(3)、打开冲洗泵头的10%异丙醇溶液的开关(需用针捅抽
),控制流量大小,以能流出的最小流量为准;
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四、 操作过程
( 4 )、注意各流动相所剩溶液的容积设定,若设定的 容积低于最低限会自动停泵,注意洗泵溶液的体积, 及时加液; ( 5 )、使用过程中要经常观察仪器工作状态,及时正 确处理各种突发事件。
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谢谢大家!
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第二节 岛津LC-10AT型
HPLC注意事项
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一、 流动相
1、流动相应选用色谱纯试剂、高纯水或双蒸水,酸碱液及 缓冲液需经过滤后使用,过滤时注意区分水系膜和油系 膜的使用范围; 2、水相流动相需经常更换(一般不超过2天),防止长菌 变质; 3、使用双泵时,A、B、C、D四相中,若所用流动相中有 含盐流动相,则 A 、 D (进液口位于混合器下方)放置 含盐流动相,B、C(进液口位于混合器上方)放置不含 盐流动相; A、 B、 C、 D四个储液器中其中一个为棕色瓶,用于存 放水相流动相。
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九、 清洗管路及进样口
1、分析完毕后,先关检测器和数据处理机,再用经滤过 和脱气的适当溶剂清洗色谱系统,正相柱一般用正已
烷,反相柱如使用过含盐流动相,则先用水,然后用
甲醇-水冲洗,冲洗前先按(4.1.1~4.1.2)操作,再用 分析流速冲洗,各种冲洗剂一般冲洗15~30分钟,特殊 情况应延长冲洗时间。
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四、 操作过程
动相,必须先用水冲洗 20分钟以上再换上含盐
流动相),正式进样分析前30min 左右开启D灯或W灯
,以延长灯的使用寿命; 3、 建立色谱操作方法,注意保存为自己命名的 Method ,勿覆盖或删除他人的方法及实验结果;
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按钮校正基线零点,再按一下 [查看基线] 按钮使其弹 起。 2 、用试样溶液清洗注射器,并排除气泡后抽取适量即可
以进样了。
3、含量测定的对照溶液和样品供试溶液每份至少注样2 次。
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八、 谱图的判断 及结果计算
系统适用性实验:三个重要指标 ①分离度(加强):一般应≥1.5。 ②重复性:两次谱图的峰面积应相差不的过1%。 ③理论塔板数:应≥规定的理论塔板数目。 ④拖尾因子:0.95<T<1.05 ⑤保留时间:对照与样品的主成分保留时间应大致一致。
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六、 平衡系统
3 、梯度洗脱方式
3.1: 以检验方法规定的梯度初始条件,按2项下方法平衡系统。
3.2 :在进样前运行1~2次空白梯度。方法:按A泵的[run]键,prog.run 指示灯亮,梯度程序运行;程序停止时,prog.run指示灯灭。
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七、 进样
1 、进样前按检测器[zero]键调零,按软件中 [零点校正]
[Enter]键。按[CE]键退出。
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五、 更换流动相并排气泡
1: 将A/B管路的吸滤器放入装有准备好的流动相的储液瓶中;
2 :逆时针转动A/B泵的排液阀180°,打开排液阀; 3 :按A/B泵的[purge]键,pump指示灯亮,泵大约以9.9ml/min的流速冲洗 ,3min(可设定)后自动停止; 4 :将排液阀顺时针旋转到底,关闭排液阀。 5 :如管路中仍有气泡,则重复以上操作直至气泡排尽。 6 :如按以上方法不能排尽气泡,从柱入口处拆下连接管,放入废液瓶中 ,设流速为5ml/min,按[pump]键,冲洗3min后再按[pump]键停泵,重 新接上柱并将流速重设为规定值。
1、 使用前仔细阅读色谱柱附带的说明书,注意适用范围 ,如pH值范围、流动相类型等; 2、 使用符合要求的流动相; 3、 使用保护柱; 4、 如所用流动相为含盐流动相,反相色谱柱使用后,先 用水或低浓度甲醇水(如5%甲醇水溶液),再用甲醇 冲洗。
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三、 色谱柱
5、 色谱柱在不使用时,应用甲醇冲洗,取下后紧密封闭 两端保存; 6、 不要高压冲洗柱子; 7、 不要在高温下长时间使用硅胶键合相色谱柱;
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二、 准备
1 、准备所需的流动相,用合适的0.45μm滤膜过滤,超声脱气
20min。 2 、根据待检样品的需要更换合适的洗脱柱(注意方向)和定 量环。 3、 配制样品和标准溶液(也可在平衡系统时配制),用合适 的0.45μm滤膜过滤。(注意腐蚀性与有机系的的溶剂) 4 、检查仪器各部件的电源线、数据线和输液管道是否连接正 常。
使用过程中注意轻拿轻放。
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四、操作过程
1、 开机操作: ( 1 )、打开电源,用 Harb 相连接时,注意 Harb 电源,打开 计算机,打开Bootp Server(一般启动时已打开); ( 2 )、自上而下打开个组件电源,Bootp Server里显示有信 号时(有六行字符),打开工作站(先打开On line);
[CE]键退出。
3 、流动相比例设定:在A泵显示初始屏幕时,按[conc]键,用数字键输 入流动相B的浓度百分数,按[Enter]键确认。按[CE]键退出。
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四、 参数设定
4、 梯度设定: 4.1 :在A泵显示初始屏幕时,按[edit]键,[Enter]键; 4.2 :用数字键输入时间,按[Enter]键,重复按[func]键选择所需功能( FLOW设定流速,BCNC设定流动相B的浓度),按[Enter]键,用数字 键输入设定值,按[Enter]键; 4.3: 重复上一步设定其它时间步骤; 4.4 :用数字键输入停止时间,重复按[func]键直至屏幕显示STOP,按