高效液相色谱基础知识

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5.长时间不用仪器，应该将柱子取下用堵头封好保存，注意不
能用纯水保存柱子，而应该用有机相(如甲醇等)，因为纯水 易长霉。
6.每次做完样品后应该用溶解样品的溶剂(如甲醇)等清洗进样 器。
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7.C18柱绝对不能进蛋白样品，血样、生物样品。
8.堵塞导致压力太大，按预柱→混合器中的过滤器→管路过滤器 →单向阀检查 并清洗。 清洗方法：①以异丙醇作溶剂冲洗；②放在异丙醇中间用超声
（3）、打开冲洗泵头的10％异丙醇溶液的开关（需用针捅抽
），控制流量大小，以能流出的最小流量为准；
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四、 操作过程
（ 4 ）、注意各流动相所剩溶液的容积设定，若设定的 容积低于最低限会自动停泵，注意洗泵溶液的体积， 及时加液； （ 5 ）、使用过程中要经常观察仪器工作状态，及时正 确处理各种突发事件。
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四、操作过程
6、 实验结束后，一般先用水或低浓度甲醇水溶液冲洗整 个管路 30分钟以上，再用甲醇冲洗。冲洗过程中关闭 D灯、W灯；
7、 关机时，先关闭泵、检测器等，再关闭工作站，然后 关机，最后自下而上关闭色谱仪各组件，关闭洗泵溶 液的开关；
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四、操作过程
8、 使用者须认真履行仪器使用登记制度，出现问题及时
向老师报告，不要擅自拆卸仪器。未经操作培训，不 得擅自使用仪器。
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自己总结的12条 注意事项
以下12条注意事项是自己在安装和使用液相色谱 仪中的经验得出的，可能存在某些片面性，如有不当
之处请多提宝贵建议。
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1、流动相必须用HPLC级的试剂，使用前过滤除去其中的 颗粒性杂质和其他物质(使用0.45um或更细的膜过滤)。
： r=mr/Ar（其中 mr和 Ar分别为对照品的量和相应的峰面积或 峰高。 ） ②再根据供试品溶液的色谱峰响应值，计算供试品中被测成分的含 量（mi）： mi=r×Ai（其中 Ai为供试品溶液中被测成分的峰面 积或峰高）。 ③必要时，再根据稀释倍数、取样量和标示量折算成标示量的百分 含量，或根据稀释倍数、取样量折算成百分含量。
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六、 平衡系统
1、查看基线：
1.1：按《N2000色谱数据工作站操作规程》打开“在线色谱工作站”软件
， 1.2：输入实验信息并设定各项方法参数后， 1.3：按下“数据收集”页的 [ ] 按钮。
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六、 平衡系统
2 、等度洗脱方式
2.1 ：按A泵的[pump]键，A、B泵将同时启动，pump指示灯亮。用检 验方法规定的流动相冲洗系统，一般最少需6倍柱体积的流动相。 2.2 ：检查各管路连接处是否漏液，如漏液应予以排除。 2.3 ：观察泵控制屏幕上的压力值，压力波动应不超过1MPa。如超过 则可初步判断为柱前管路仍有气泡，按检查管路后再操作。 2.4 ：观察基线变化。如果冲洗至基线漂移<0.01mV/min，噪声为 <0.001mV时，可认为系统已达到平衡状态，可以进样。
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九、 清洗管路及进样口
1、分析完毕后，先关检测器和数据处理机，再用经滤过 和脱气的适当溶剂清洗色谱系统，正相柱一般用正已
烷，反相柱如使用过含盐流动相，则先用水，然后用
甲醇-水冲洗，冲洗前先按（4.1.1~4.1.2）操作，再用 分析流速冲洗，各种冲洗剂一般冲洗15~30分钟，特殊 情况应延长冲洗时间。
按钮校正基线零点，再按一下 [查看基线] 按钮使其弹 起。 2 、用试样溶液清洗注射器，并排除气泡后抽取适量即可
以进样了。
3、含量测定的对照溶液和样品供试溶液每份至少注样2 次。
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八、 谱图的判断 及结果计算
系统适用性实验：三个重要指标 ①分离度（加强）：一般应≥1.5。 ②重复性：两次谱图的峰面积应相差不的过1%。 ③理论塔板数：应≥规定的理论塔板数目。 ④拖尾因子：0.95＜T＜1.05 ⑤保留时间：对照与样品的主成分保留时间应大致一致。
第一节 岛津LC-10AT型 HPLC操作规程
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目的:规范岛津LC-10AT型高效液相色谱仪的使用。
范围:适用于岛津LC-10AT型高效液相色谱仪的使用。 职责:质检员对本规程的实施负责。
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一、 系统组成
本系统由2个LC-10ATvp溶剂输送泵（分主 /A泵和副/B泵）、Rheodyne 7725i手动进样阀、 SPD-10Avp紫外-可见检测器、N2000色谱数据工 作站和电脑等组成，另外还包括打印机、不间断 电源等辅助设备。
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六、 平衡系统
3 、梯度洗脱方式
3.1： 以检验方法规定的梯度初始条件，按2项下方法平衡系统。
3.2 ：在进样前运行1~2次空白梯度。方法：按A泵的[run]键，prog.run 指示灯亮，梯度程序运行；程序停止时，prog.run指示灯灭。
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七、 进样
1 、进样前按检测器[zero]键调零，按软件中 [零点校正]
[Enter]键。按[CE]键退出。
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五、 更换流动相并排气泡
1： 将A/B管路的吸滤器放入装有准备好的流动相的储液瓶中；
2 ：逆时针转动A/B泵的排液阀180°，打开排液阀； 3 ：按A/B泵的[purge]键，pump指示灯亮，泵大约以9.9ml/min的流速冲洗 ，3min（可设定）后自动停止； 4 ：将排液阀顺时针旋转到底，关闭排液阀。 5 ：如管路中仍有气泡，则重复以上操作直至气泡排尽。 6 ：如按以上方法不能排尽气泡，从柱入口处拆下连接管，放入废液瓶中 ，设流速为5ml/min，按[pump]键，冲洗3min后再按[pump]键停泵，重 新接上柱并将流速重设为规定值。
2、流动相过滤后要用超声波脱气，脱气后应该恢复到室温 后使用。
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3、不能用纯乙腈作为流动相，这样会使单向阀粘住而导致泵
不进液。
4、使用缓冲溶液时，做完样品后应立即用去离子水冲洗管路 及柱子一小时，然 后用甲醇(或甲醇水溶液)冲洗40分钟以 上，以充分洗去离子。对于柱塞杆 外部，做完样品后也必
须用去离子水冲洗20ml以上。
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二、样品
1、采用过滤或离心方法处理样品，确保样品中不含固体 颗粒； 2、用流动相或比流动相弱（若为反相柱，则极性比流动 相大；若为正相柱，则极性比流动相小）的溶剂制备 样品溶液，尽量用流动相制备样品液； 3、手动进样时，进样量尽量小，使用定量管定量时，进 样体积应为定量管的3～5倍；
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三、色谱柱
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三、 开机
接通电源，依次开启不间断电源、B泵、A 泵、检 测器，待泵和检测器自检结束后，打开打印机、电脑显 示器、主机，最后打开色谱工作站。
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四、 参数设定
1、 波长设定：在检测器显示初始屏幕时，按[func]键，用数字键输入所 需波长值，按[Enter]键确认。按[CE]键退出到初始屏幕。 2 、流速设定：在A泵显示初始屏幕时，按[func]键，用数字键输入所需 的流速（柱在线时流速一般不超过1ml/min），按[Enter]键确认。按
3.用>25mmol/L的缓冲液
4.每天冲洗柱 5.稳定进样条件,调节流动相 6.采用保护柱
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二、 保留时间缩短
1.流速增加 2.样品超载 1.检查泵,重新设定流速 2.降低样品量
3.键合相流失
3. 流 动 相 PH 值 保 持 在
3~7.5检查柱的方向
4.流动相组成变化 5.温度增加
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二、 准备
1 、准备所需的流动相，用合适的0.45μm滤膜过滤，超声脱气
20min。 2 、根据待检样品的需要更换合适的洗脱柱（注意方向）和定 量环。 3、 配制样品和标准溶液（也可在平衡系统时配制），用合适 的0.45μm滤膜过滤。（注意腐蚀性与有机系的的溶剂） 4 、检查仪器各部件的电源线、数据线和输液管道是否连接正 常。
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九、 清洗管路及进样口
2、 冲洗完毕后，逐步降低流速至0，关泵，进样器也应用
相应溶剂冲洗，可使用进样阀所附专用冲洗接头。
3 、关断电源，作好使用登记，内容包括日期、检品、色谱 柱、流动相、柱压，使用小时数，仪器完好状态等。
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九、 清洗管路及进样口
【特殊情况】：谱流路系统，从泵、进样器、色谱柱、 到检测器通池，在分析完毕后，均应按（5.1）充分冲 洗，特别是用过含盐流动相的，更应注意先用水，再 用甲醇-水，充分冲洗。
[CE]键退出。
3 、流动相比例设定：在A泵显示初始屏幕时，按[conc]键，用数字键输 入流动相B的浓度百分数，按[Enter]键确认。按[CE]键退出。
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四、 参数设定
4、 梯度设定： 4.1 ：在A泵显示初始屏幕时，按[edit]键，[Enter]键； 4.2 ：用数字键输入时间，按[Enter]键，重复按[func]键选择所需功能（ FLOW设定流速，BCNC设定流动相B的浓度），按[Enter]键，用数字 键输入设定值，按[Enter]键； 4.3： 重复上一步设定其它时间步骤； 4.4 ：用数字键输入停止时间，重复按[func]键直至屏幕显示STOP，按
⑥RSD： ＜3%
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八、 谱图的判断 及结果计算
1、内标法 用含对照品和内标物质的对照溶液所得色谱峰响应值， 按下式算出校正因子（f）：
其中 As和Ar分别为内标物质和对照品的峰面积或峰高，ms和mr 分别为加入内标物质和对照品的量。
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八、 谱图的判断 及结果计算
2、外标法：
①用含对照品的对照溶液所得色谱峰响应值，按下式计算比值（r）
四、 操作过程
4、 使用手动进样器进样时，在进样前和进样后都需用洗
针液洗净进样针筒，洗针液一般选择与样品液一致的 溶剂，进样前必须用样品液清洗进样针筒3遍以上，并 排除针筒中的气泡； 5、 溶剂瓶中的沙芯过滤头容易破碎，在更换流动相时注
意保护，当发现过滤头变脏或长菌时，不可用超声洗
涤，可用5%稀硝酸溶液浸泡后再洗涤；
使用过程中注意轻拿轻放。
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四、操作过程
1、 开机操作： （ 1 ）、打开电源，用 Harb 相连接时，注意 Harb 电源，打开 计算机，打开Bootp Server（一般启动时已打开）； （ 2 ）、自上而下打开个组件电源，Bootp Server里显示有信 号时（有六行字符），打开工作站（先打开On line）；
波清 洗；③用10％稀硝酸清洗。
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9.气泡会致使压力不稳，重现性差，所以在使用过程中要尽 量避免产生气泡。 10.如果进液管内不进液体时，要使用注射器吸液：通常在输 液前要进行流动相 的清洗。
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11.要注意柱子的PH值范围，不得注射强酸强碱的样品，特别是
碱性样品。
12.更换流动相时应该先将吸滤头部分放入烧杯中边振动边清洗
1、 使用前仔细阅读色谱柱附带的说明书，注意适用范围 ，如pH值范围、流动相类型等； 2、 使用符合要求的流动相； 3、 使用保护柱； 4、 如所用流动相为含盐流动相，反相色谱柱使用后，先 用水或低浓度甲醇水（如5％甲醇水溶液），再用甲醇 冲洗。
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三、 色谱柱
5、 色谱柱在不使用时，应用甲醇冲洗，取下后紧密封闭 两端保存； 6、 不要高压冲洗柱子； 7、 不要在高温下长时间使用硅胶键合相色谱柱；
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谢谢大家！
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第二节 岛津LC-10AT型
HPLC注意事项
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一、 流动相
1、流动相应选用色谱纯试剂、高纯水或双蒸水，酸碱液及 缓冲液需经过滤后使用，过滤时注意区分水系膜和油系 膜的使用范围； 2、水相流动相需经常更换（一般不超过2天），防止长菌 变质； 3、使用双泵时，A、B、C、D四相中，若所用流动相中有 含盐流动相，则 A 、 D （进液口位于混合器下方）放置 含盐流动相，B、C（进液口位于混合器上方）放置不含 盐流动相； A、 B、 C、 D四个储液器中其中一个为棕色瓶，用于存 放水相流动相。
，然后插入新的 流动相中。更换无互溶性的流动相时要用异
丙醇过渡一下。
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谢谢大家！
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第三节 高效液相色谱中 常遇见的问题及处理方法
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一、 保留时间变化
1.柱温变化 2.等度与梯度间未能充分平衡 1.柱恒温 2.至少用10倍柱体积的流动相平衡柱
3.缓冲液容量不够
4.柱污染 5.柱内条件变化 6.柱快达到寿命
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四、 操作过程
2、 先以所用流动相冲洗系统一定时间（如所用流动相为
含盐流动相，必须先用水冲洗 20分钟以上再换上含盐
流动相），正式进样分析前30min 左右开启D灯或W灯
，以延长灯的使用寿命； 3、 建立色谱操作方法，注意保存为自己命名的 Method ，勿覆盖或删除他人的方法及实验结果；
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