[5] 蛋白质工程实验技术原理 II(1)

第五节蛋白质工程实验技术原理II 授课教师：李旭授课时间：2014年10月17日蛋白质的表达蛋白质的表达•原核表达系统•大肠杆菌表达系统•芽孢杆菌表达系统•链霉菌基因表达系统•真核表达系统•酵母表达系统•丝状真菌表达系统•昆虫表达系统•哺乳动物细胞表达系统•转基因动植物•无细胞表达系统蛋白质的表达•大肠杆菌表达系统•分子水平上的遗传背景较为清晰•基因工程方法已趋于完善•比生长速率高•表达系统多样、有效•培养基廉价最佳条件下， E.coli 17分钟扩增一倍蛋白质的表达•大肠杆菌表达系统–不利方面：•内毒素的产生•无翻译后修饰及没有有效的分泌系统•在葡萄糖代谢中常常产生代谢副产物（乙酸等）–这些副产物的形成直接影响菌体细胞的生长以及目标产物的产率，常常在高密度培养过程中遇见蛋白质的表达大肠杆菌系统表达策略–固定菌株，对不同载体及融合蛋白加以筛选Tag-tagN-terminal His6蛋白质的表达大肠杆菌系统表达策略–固定载体及融合条件，选择不同生理特点的菌株BL21 (DE3) CodonPlus-RIL AGG/AGA (arginine), AUA (isoleucine) and CUA (leucine) BL21 (DE3) CodonPlus-RP AGG/AGA (arginine) and CCC (proline)蛋白质的表达•首选载体系统pET蛋白质的表达•常用大肠杆菌菌株–BL21(DE3)•菌株内源的蛋白酶过多，可能会造成外源表达产物的不稳定，所以一些蛋白酶缺陷型菌株往往成为理想的起始表达菌株•堪称经典的BL21系列就是lon和ompT蛋白酶缺陷型，也是我们非常熟悉的表达菌株•BL21(DE3)融源菌则是添加T7聚合酶基因，为pET表达系统而设计蛋白质的表达•常用大肠杆菌菌株–Rosetta2•真核细胞偏爱的密码子和原核系统有不同，因此，在用原核系统表达真核基因的时候，真核基因中的一些密码子对于原核细胞来说可能是稀有密码子，从而导致表达效率和表达水平很低•Rosetta2系列是携带pRARE2质粒的BL21衍生菌，补充大肠杆菌缺乏的七种(AUA,AGG,AGA,CUA,CCC,GGA及CGG)稀有密码子对应的tRNA，提高外源基因、尤其是真核基因在原核系统中的表达水平蛋白质的表达•常用大肠杆菌菌株–Origami2•当要表达的蛋白质需要形成二硫键以形成正确的折叠时，可以选择K–12衍生菌Origami2系列，thioredoxin reductase(trxB)和glutathione reductase(gor)两条主要还原途径双突变菌株，显著提高细胞质中二硫键形成几率，促进蛋白可溶性及活性表达蛋白质的表达•常用大肠杆菌菌株–pLysS or pLysE蛋白质的表达•常用大肠杆菌菌株–C41(DE3)or C43(DE3)–Lucigen公司•OverExpress™C41(DE3)and C43(DE3)Competent Cells蛋白质的表达E.coli重组表达菌株选择策略现象可能原因建议菌株无蛋白表达E. coli 的密码子偏好性Rosetta 2Rosetta-gami 2Rosetta-gami B出现截短蛋白包涵体二硫键形成困难蛋白质的表达•酵母表达系统–酵母菌（Yeast ）是一群以芽殖或裂殖方式进行无性繁殖的单细胞真核生物•共由56个属和500多个种组成•酵母细胞倍增时间约为2小时I.II.III.IV.Time对数期:2-5天，达107个/mL，很少超过2(5)×108稳定期:持续8天左右，动态平衡衰减期:持续几周，活细胞降至105蛋白质的表达•酵母表达系统–优点•培养条件普通，生长繁殖速度迅速•能够耐受较高的流体静压，可以大规模生产•具有一定的翻译后加工能力，收获的外源蛋白质具有一定程度上的折叠加工和糖基化修饰•具有外分泌信号序列，能够将所表达的外源蛋白质分泌到细胞外蛋白质的表达•酵母表达系统–缺点•产物蛋白质不均一•信号肽加工不完全•内部降解•多聚体形成•表达产物过度糖基化蛋白质的表达•酵母表达系统–酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)–乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)–巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)–非洲酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)–多态汉逊酵母(Hansenula polymorpha)蛋白质的表达•酵母表达系统–酿酒酵母•难于高密度培养•分泌效率低，几乎不分泌分子量大于30kD的外源蛋白质•不能使所表达的外源蛋白质正确糖基化，高度糖基化，糖链上可以带有40个以上的甘露糖残基•蛋白质的C端往往被截短蛋白质的表达•酵母表达系统–巴斯德毕赤酵母•由野生型石油酵母Y11430突变而来，常用的宿主菌是GS115、KM71和MC1o0‐3•以甲醇为唯一能源和碳源•有自我复制型游离载体和整合型载体，前者极不稳定，因此一般采用整合型载体蛋白质的表达•酵母表达系统–巴斯德毕赤酵母•整合型载体–采用已知的最强启动子3‘AOX1非编码区序列P，外源蛋白质的表达量可达到宿主菌总蛋白的5%~40%–某些整合型载体还含有外分泌信号肽–信号肽加工、蛋白质折叠、二硫键形成和糖基化位点与哺乳动物细胞相同，生成的糖链较短蛋白质的表达•毕赤酵母表达体系–多拷贝分泌型质粒PIC9K蛋白质的表达•毕赤酵母表达体系–多拷贝分泌型质粒PIC9K蛋白质的表达•毕赤酵母表达体系–多拷贝分泌型质粒PIC9K蛋白质的表达•毕赤酵母表达体系–常用表达菌株•GS115(Mut+,HIS‐)–快速、高产、分泌•KM71(Mut s,HIS‐)–慢速、胞内、分泌•SMD1168(Mut+,HIS‐,蛋白酶缺陷)–快速、高产、胞内蛋白质的表达•毕赤酵母表达体系–实验流程•密码子偏好性替换•载体选择•酶切位点及融合标签选择•转化•高拷贝数筛选•单克隆鉴定蛋白质的表达•昆虫细胞-杆状病毒表达系统–昆虫细胞表达系统是以杆状病毒基因组为基础构建的，因此也称杆状病毒表达(BEVS)系统–杆状病毒对昆虫的感染具有特异性，对脊椎动物无致病性蛋白质的表达•昆虫细胞-杆状病毒表达系统–目前用于昆虫细胞表达系统的主要是核型多角体病毒(nuclear polyhedrosis virus,NPV)：•苜蓿尺蠖核型多角体病毒(AcNPV)•家蚕核型多角体病毒(BmNPV)蛋白质的表达•昆虫细胞-杆状病毒表达系统–优点•重组蛋白具有完整的生物学功能•能进行翻译后加工修饰(糖基化、磷酸化、酰基化)•表达水平高，可达总蛋白量的50%•可容纳大分子的插入片段(~200KD)•可在同一个感染昆虫细胞内同时表达多个外源基因蛋白质的表达•昆虫细胞-杆状病毒表达系统Insect Hostearly late replicationSf9 Cell AcNPVinfection Polyhedrin蛋白质的表达•昆虫细胞-杆状病毒表达系统5’3’Transfer vectorPolyhedrin genex xCloned geneAcMNPV DNA5’3’Cloned geneRecombinantAcMNPV DNA蛋白质的表达•昆虫细胞-杆状病毒表达系统蛋白质的表达•转基因植物–根癌农杆菌细胞中含有Ti质粒，这是一种染色体外自主复制的环形双链DNA分子，它控制根瘤的形成，可作为基因工程的载体蛋白质的表达•转基因植物–在Ti质粒上有一段T‐DNA，即Transfer‐DNA，又称为T区(T region)–根癌农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T‐DNA插入到植物基因组中蛋白质的表达•转基因植物–T‐DNA•T‐DNA可以将携带的任何基因整合到植物基因组中•这些基因本身与T‐DNA的转移和整合无关，仅左右两端各25bp的同向重复序列（左边界和右边界）为其加工所必需蛋白质的表达•转基因植物蛋白质的表达•转基因植物Leaf Disk Preparation Co-cultivation with Agrobacterium Selection for TransformationRegeneration of S Adaptation to growth in the Greenhouse蛋白质的表达•转基因植物蛋白质的表达•无细胞表达系统–无细胞蛋白质合成系统(The cell‐free protein synthesis system)是一种以外源mRNA或DNA为模板，在细胞抽提物的酶系中补充底物和能量来合成蛋白质的体外系统蛋白质的表达•无细胞表达系统–优点•表达对细胞有毒害作用的蛋白质•表达含有非天然氨基酸(如D‐氨基酸)的特殊蛋白质•表达易降解蛋白•可表达大蛋白(>150KD)•能够直接以PCR产物作为模板同时平行合成多种蛋白质，适合于基因产物的快速检测蛋白质的表达•无细胞表达系统•含有T7、T3或者SP6启动子的环状质粒或PCR产物片段可直接加入体系，诱导后1~4小时完成蛋白表达蛋白质的表达•无细胞表达系统蛋白质的表达•无细胞表达系统菌种保藏李旭部分第四次作业请简述pET系统成为大肠杆菌中异源蛋白表达的首选载体的原因。