[5] 蛋白质工程实验技术原理 II(1)

第五节

蛋白质工程实验技术原理II 授课教师：李旭

授课时间：2014年10月17日

蛋白质的表达

蛋白质的表达

•原核表达系统

•大肠杆菌表达系统

•芽孢杆菌表达系统

•链霉菌基因表达系统

•真核表达系统

•酵母表达系统

•丝状真菌表达系统

•昆虫表达系统

•哺乳动物细胞表达系统

•转基因动植物

•无细胞表达系统

蛋白质的表达

•大肠杆菌表达系统

•分子水平上的遗传背景较为清晰

•基因工程方法已趋于完善

•比生长速率高

•表达系统多样、有效

•培养基廉价

最佳条件下， E.coli 17分钟扩增一倍

蛋白质的表达

•大肠杆菌表达系统

–不利方面：

•内毒素的产生

•无翻译后修饰及没有有效的分泌系统

•在葡萄糖代谢中常常产生代谢副产物（乙酸等）–这些副产物的形成直接影响菌体细胞的生长以及目标产物

的产率，常常在高密度培养过程中遇见

蛋白质的表达

大肠杆菌系统表达策略

–固定菌株，对不同载体及融合蛋白加以筛选

Tag

-tag

N-terminal His

6

蛋白质的表达

大肠杆菌系统表达策略

–固定载体及融合条件，选择不同生理特点的菌

株

BL21 (DE3) CodonPlus-RIL AGG/AGA (arginine), AUA (isoleucine) and CUA (leucine) BL21 (DE3) CodonPlus-RP AGG/AGA (arginine) and CCC (proline)

蛋白质的表达•首选载体系统pET

蛋白质的表达

•常用大肠杆菌菌株

–BL21(DE3)

•菌株内源的蛋白酶过多，可能会造成外源表达产物

的不稳定，所以一些蛋白酶缺陷型菌株往往成为理

想的起始表达菌株

•堪称经典的BL21系列就是lon和ompT蛋白酶缺陷型，

也是我们非常熟悉的表达菌株

•BL21(DE3)融源菌则是添加T7聚合酶基因，为pET表

达系统而设计

蛋白质的表达

•常用大肠杆菌菌株

–Rosetta2

•真核细胞偏爱的密码子和原核系统有不同，因此，

在用原核系统表达真核基因的时候，真核基因中的

一些密码子对于原核细胞来说可能是稀有密码子，

从而导致表达效率和表达水平很低

•Rosetta2系列是携带pRARE2质粒的BL21衍生菌，补

充大肠杆菌缺乏的七种(AUA,AGG,AGA,CUA,CCC,

GGA及CGG)稀有密码子对应的tRNA，提高外源基因

、尤其是真核基因在原核系统中的表达水平

蛋白质的表达

•常用大肠杆菌菌株

–Origami2

•当要表达的蛋白质需要形成二硫键以形成正确的折

叠时，可以选择K–12衍生菌Origami2系列，

thioredoxin reductase(trxB)和glutathione reductase

(gor)两条主要还原途径双突变菌株，显著提高细胞

质中二硫键形成几率，促进蛋白可溶性及活性表达

蛋白质的表达

•常用大肠杆菌菌株

–pLysS or pLysE

蛋白质的表达

•常用大肠杆菌菌株

–C41(DE3)or C43(DE3)

–Lucigen公司

•OverExpress™C41(DE3)and C43(DE3)Competent Cells

蛋白质的表达

E.coli重组表达菌株选择策略

现象可能原因建议菌株

无蛋白表达

E. coli 的密码子偏好性Rosetta 2

Rosetta-gami 2

Rosetta-gami B

出现截短蛋白

包涵体

二硫键形成困难

蛋白质的表达

•酵母表达系统

–酵母菌（Yeast ）是一群以芽殖或裂殖方式进行无性繁殖的单细胞真核生物

•共由56个属和500多个种组成•酵母细胞倍增时间约为2小时

I.

II.

III.

IV.

Time

对数期:2-5天，达107个/mL，

很少超过2(5)×108

稳定期:持续8天左右，动态平衡衰减期:持续几周，活细胞降至105

蛋白质的表达

•酵母表达系统

–优点

•培养条件普通，生长繁殖速度迅速

•能够耐受较高的流体静压，可以大规模生产

•具有一定的翻译后加工能力，收获的外源蛋白质具

有一定程度上的折叠加工和糖基化修饰

•具有外分泌信号序列，能够将所表达的外源蛋白质

分泌到细胞外

蛋白质的表达

•酵母表达系统

–缺点

•产物蛋白质不均一

•信号肽加工不完全

•内部降解

•多聚体形成

•表达产物过度糖基化

蛋白质的表达

•酵母表达系统

–酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)

–乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)

–巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)

–非洲酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)–多态汉逊酵母(Hansenula polymorpha)