超分辨光学成像中的高密度荧光分子定位方法
光学超分辨成像技术研究
光学超分辨成像技术研究【前言】光学超分辨成像技术是指利用纳米结构材料或光学信息处理方法等手段，通过突破传统光学成像的衍射极限，实现对微观结构的高精度成像。
目前，超分辨成像技术已经成为科学研究和工业生产领域中必不可少的重要手段，对人类社会的发展具有重要的推动作用。
【技术原理】传统光学成像的分辨率受到衍射极限的限制，所谓衍射极限就是当光束传过一个缝隙或者通过某个物体时，光通过缝隙或物体边缘的衍射效应所产生的像差。
由于衍射效应的作用，传统光学成像系统所获得的成像图像不仅分辨率较低，而且无法直接显示出微观结构的真实信息。
超分辨成像技术通过采用不同的光学信息处理方法，减轻或避免光学衍射效应的影响，从而实现对微观结构的高精度成像。
目前，超分辨成像技术主要包括以下几种：1.近场光学显微技术近场光学显微技术是指通过利用探针与试样间的非接触作用，实现对微观结构的高分辨观测。
该技术主要应用于生物学、纳米科学、材料科学等领域中的微观结构的观测和研究。
常见的近场光学显微技术包括原子力显微镜、近场光谱学、近场输运显微镜等。
2.超分辨荧光光学显微技术超分辨荧光光学显微技术通过改变荧光标记分子的发射特性，实现对微观结构的高分辨成像。
该技术主要应用于生物学、医学等领域中的细胞和组织的成像和分析。
常见的超分辨荧光光学显微技术包括衍生自荧光簇的单分子定位技术、电子转移率显微镜、双光子荧光显微镜等。
3.计算光学成像技术计算光学成像技术是指通过数学计算和光学模拟技术对成像过程进行预测和仿真，实现对微观结构的高精度成像。
该技术主要应用于工业制造、无损检测等领域。
常见的计算光学成像技术包括逆问题算法、数学建模与仿真、统计建模等。
【应用前景】超分辨成像技术的应用前景广阔，涉及到物理学、化学、生物学、医学等多个学科领域。
未来，超分辨成像技术的发展方向主要包括以下几个方面：1.高分辨材料成像超分辨成像技术可以实现对材料的高分辨成像，为材料科学的研究和工业制造中的无损检测提供了有力的手段。
超分辨定位成像原理
超分辨定位成像原理超分辨定位成像原理是指通过对局部图像细节进行重建，提高图像分辨率和定位精度的一种成像技术。
该技术被广泛应用于生物医学、材料科学、纳米技术、半导体制造等领域。
本文将详细介绍超分辨定位成像原理的实现方法和原理。
一、超分辨技术综述随着现代科技的飞速发展，人们对图像清晰度和定位精度的需求越来越高。
由于物理学的限制或技术设备的限制，一些细小局部特征不能被清晰地观测和定位。
超分辨成像技术就是为了解决这个问题而产生的。
这项技术最早于20世纪60年代提出，但是由于技术手段的局限性，很长时间内都无法实现。
随着计算机技术和光学技术的不断发展，近年来，超分辨成像技术得到了长足的进展。
目前主要的超分辨成像技术包括局部反演技术、结构光技术、全息技术、点扫描技术和单分子成像技术等。
超分辨定位成像技术是一种通过对图像局部信息进行数学处理和运算，从而提高图像清晰度和定位精度的技术。
超分辨定位成像原理是基于荧光光学的原理实现的。
当样品被激发后，会发射出一些贡献于图像的单光子，这些单光子经过透镜聚焦之后，最后经过光电探测器探测，形成图像。
正常情况下，只能观测到可见光范围内的波长，其他波长的信息则无法被观测到。
超分辨定位成像技术通过对荧光分子的发光信息进行特殊处理，获取了波长以外的额外信息，从而提高了图像的分辨率和定位精度。
具体来讲，其实现过程可以分为光学与数据处理两个过程。
光学部分：图像采集的过程中，样品中的发光分子会发出光子，这些光子会被探测器探测到，最终形成图像。
光子的位置可以通过对探测器接收到的光信号进行位置测量（离子感应采集器或 EMCCD 等），但是受限于探测器的分辨率，光子的位置精度有限。
事实上，通过合理的光学设计和探测器参数的把握，可以获得极高的信噪比。
数据处理部分：对于超分辨图像处理，可以采用不同的算法，最常用的算法当属AST和HSLL。
其中AST主要是假设所有的荧光分子都是独立发光的，而HSLL则是过滤掉互相影响的噪音，从而保留信号信息。
STED超分辨成像技术
STED超分辨成像技术超分辨光学成像超分辨光学成像特指分辨率打破了光学显微镜分辨率极限（200nm）的显微镜，技术原理主要有受激发射损耗显微镜技术和光激活定位显微镜技术。
简介光学显微镜凭借其⾮接触、⽆损伤等优点，长期以来是⽣物医学研究的重要⼯具。
但是，⾃1873年以来，⼈们⼀直认为，光学显微镜的分辨率极限约为200 nm，⽆法⽤于清晰观察尺⼨在200 nm以内的⽣物结构。
超分辨光学成像(Super-resolution Optical Microscopy)是本世纪光学显微成像领域最重⼤的突破，打破了光学显微镜的分辨率极限（换⾔之，超越了光学显微镜的分辨率极限，故被称为超分辨光学成像），为⽣命科学研究提供了前所未有的⼯具。
光学显微镜的分辨率1873年，德国物理学家恩斯特·阿贝(Ernst Abbe)提出，光学显微镜受限于光的衍射效应和光学系统的有限孔径，存在分辨率极限（也称阿贝极限），其数值约为l / 2NA（分辨率极限公式），其中l是光波波长，NA是光学系统的数值孔径（Numerical Aperture）。
, n为介质的折射率，a为物镜孔径⾓的⼀半。
成像时若使⽤波长为400 nm的光，并采⽤空⽓（折射率为1）作为物镜和样本之间的介质，可计算得到分辨率极限为200 nm。
因此，我们通常说，光学显微镜的分辨率极限约为200 nm。
此后的研究表明，光学显微镜的分辨率决定于光学系统中聚焦光斑（称为艾⾥斑, Airy disc）的尺⼨。
另外，当⼀个艾⾥斑的边缘与另⼀个艾⾥斑的中⼼正好重合时，此时对应的两个物点刚好能被⼈眼或光学仪器所分辨（这个判据称为瑞利判据，Rayleigh Criterion）。
利⽤瑞利判据以及艾⾥斑的数学表达式，我们可以得到光学显微镜的分辨率公式：0.61λ/NA。
值得指出的是，光学显微镜的分辨率公式跟前⾯提到的分辨率极限公式有所不同，⽽前者更⼴泛的被光学成像领域使⽤。
一种高精度的荧光单分子纳米级定位算法
一种高精度的荧光单分子纳米级定位算法鄢志丹1,2，孙立东2，李艳宁1，胡小唐1，ZEPPENFELD Peter2【摘要】荧光成像系统的技术指标、采集的荧光图像信噪比和单分子定位算法是影响单分子定位精度的3大因素.在介绍单分子定位的基本极限精度和理论计算精度的基础上，提出了一种被称为图像去噪高斯掩膜算法的单分子定位算法.依据实验用单分子成像系统的具体配置，通过计算机仿真表明，该算法良好的去噪处理和高斯加权质心运算方式，不仅能实现纳米级的定位精度，而且能突破一般理论计算精度的限制，接近基本极限精度，特别是在背景噪声较大的情况下，其优势更加明显.这对单分子的精确定位和跟踪、扩散方式分析、转移速率计算等具有重要的意义.【期刊名称】纳米技术与精密工程【年(卷),期】2010(008)005【总页数】7【关键词】荧光成像；单分子纳米级定位；图像信噪比；二维高斯曲面经过近30年的理论完善和技术革新，单分子跟踪(single molecule tracking, SMT)已发展成为在众多学科领域广泛应用的方法之一[1-4].SMT以单分子荧光图像为研究对象，通过合理有效的算法，一方面确定单分子的中心位置，另一方面正确地将不同帧上的同一分子以时间序列的形式连接起来，从而分析单分子的扩散方式，确定扩散系数、转移速率、步进位移等，得到丰富而详细的分子运动动力学和统计学信息.这为单分子运动特性研究、多分子共域化选择、生物分子反应过程探索等提供了强大的技术手段.单分子的定位精度是SMT研究的一个关键因素.即在多大的误差范围内确定单分子的中心位置.这不仅是单分子荧光成像系统的重要技术指标，也影响着最终对单分子运动特征的评价[5-6].较大的单分子定位误差会导致不精确的计算结果，甚至会得出与客观事实相悖的结论.对于某一特定的实验分子，荧光成像系统的技术指标、采集的荧光图像质量和单分子定位算法是影响定位精度的3大因素.成像系统的技术指标主要包括NA(numeric aperture)值、放大倍率、采集效率、CCD(charge coupled device)图像探测器像素尺寸等；荧光图像质量用信噪比(signal to noise ratio, SNR)衡量，该值由图像的单分子信号和背景噪声共同确定；单分子定位算法则以单分子在成像面的点扩散函数(point spread function, PSF)为基础，利用不同的计算方式，如质心法、相关矩阵法、绝对差求和法、二维直接高斯拟合等，实现对单分子中心的亚像素定位[7].如果说成像系统的技术指标和荧光图像质量是实现高精度的单分子定位“硬”的要求，则单分子定位算法是“软”的要求.当“硬”的系统配置固定时，“软”的算法便对定位精度起着主要的作用.本文中首先介绍了基于一定“硬”条件下，单分子定位的基本极限精度和理论计算精度，并且探讨了SNR同有效采集光子数这两个经常用于精度分析的参数之间的关系，然后提出了一种被称为图像去噪高斯掩膜算法的单分子定位算法，并依据实验用单分子成像系统具体配置，在不同的有效采集光子数(20～1 000)和背景噪声(0.1～20)条件下，对其优化的放大倍率和CCD像素尺寸及理论计算精度进行了理论分析.通过计算机仿真表明，该算法良好的去噪处理和高斯加权质心运算方式，在有效采集光子数(或SNR)增大时，能突破理论计算精度的限制，并接近基本极限精度，特别是在背景噪声较大的情况下，其表现更具优势.1 单分子定位的理论精度1.1 PSF与二维高斯曲面对于三维结构上远小于显微镜分辨率的单个分子，将在像空间一定区域内形成分散的电磁场斑点，其分布的情况可用点扩散函数PSF来表示，即(1)式中(2)式中J1(*)、NA、λ、r分别表示第一类一阶Bessel函数、物镜数值孔径、光波波长、像平面某点到第一零级主极大的距离.由于在实际的单分子荧光图像上，二维高斯曲面与PSF差别微小，再加之方便计算，易于处理，因而通常用其近似替代PSF[1,8]，即(3)式中σ表示拟合后二维高斯曲面的标准方差，或称宽度.当二维高斯方程与PSF 包含的体积相等时，其大小约为[9](4)下面介绍的公式推导和结果分析都是在二维高斯曲面上进行的.1.2 理论精度分析对于特定的单分子成像系统，单分子定位的精度受荧光图像质量和不同定位算法的影响，不同的算法在同一荧光图像时，其表现各不相同[7,10].通过选择恰当的算法可以达到更优的运算结果.那么这种“更优”是无限的，还是有限的？也就是说，对于特定的单分子荧光图像，存不存在这样一个精度极限，使得不管如何改进算法，单分子定位都只能得到接近于这个极限精度值，而无法获取更高精度的特征点坐标呢？Ober等[5]利用Fisher信息矩阵在仅考虑单分子荧光发射特点和相关探测系统的效率时，推导出一个不存在其他任何噪声的基本极限精度(5)N=γRt(6)式中N、γ、R、t分别表示有效采集光子数、探测系统光学效率、发射速率和曝光时间.这是在进行单分子定位时所能得到的最优精度.在实际应用中由于各种噪声及不同算法的影响，所得到的精度值都应大于这个理想值.当用二维高斯曲面近似代替单分子PSF后，其基本极限精度δfund可表示为(7)此外，Thompson等[8]在分析散粒噪声、像素化噪声和背景噪声3个方面对单分子定位精度影响的基础上，提出了一个理论计算精度δtheo的计算公式，即(8)式中s、a、b分别表示单分子PSF的标准偏差、像平面上CCD像素代表的实物尺寸和背景噪声大小.式中3项分别表示散粒噪声、像素化噪声和背景噪声对单分子定位精度的影响.不难看出，在散粒噪声为主要噪声的荧光图像中，定位精度与总采集光子的平方根成反比，而在背景噪声为主要噪声的荧光图像中，其与总采集光子数成反比.s也可以用二维高斯分布的标准方差σ代替[11]，即令s =σ，将式(4)代入式(8)，则有(9)1.3 N与SNR的关系在多个文献中提到SNR或者N与单分子定位精度的相互关系[5,7,10,12]，但都没有把N与SNR统一起来，本节即在寻求N与SNR的内在联系.众所周知，有效采集光子数N将在像平面服从PSF分布，假设其标准PSF的最大值落在某一像素点的中心位置，那么通过计算该像素范围内D0的光子数(光强)同整个PSF范围内D光子数(光强)之比NR，就可以得知该像素内的光子数(光强) (10)可将D0设置为一个中心在PSF最大值处、面积等于a2的圆形区域，则其半径r0为(11)将式(11)代入(10)，并展开二重积分后，可有(12)即(13)则荧光单分子图像的SNR为(14)当b一定时，SNR与I0(N)成正比，而当I0(N)不变时，其与背景噪声b成反比.2 单分子定位算法2.1 图像去噪高斯掩膜算法用于单分子定位的图像去噪高斯掩膜算法(image de-noising Gaussian mask，IDGM)包括荧光图像去噪[2,10]和高斯掩膜质心法[8]计算单分子中心位置两个主要部分.图像去噪的目的是尽可能地去除图像噪声(背景噪声和散粒噪声)以分离单分子图像信息.将原始CCD图像数组先转换成浮点类型Io(x,y)，经过如下卷积后即可得到去噪后图像I (x,y)，即(15)其中(16)(17)(18)(19)(20)(21)式中：Dx(x,y)、Bx(x,y)、D(x,y)、B(x,y) 分别为x方向和二维卷积后的去除散粒噪声图像和背景图像模型；Kxd、Kxb、Kyd、Kyb 为x、y方向上去除散粒噪声和背景噪声的卷积核，其中Kxd=(Kyd)T=exp(-i2/4)/B，Kxb=(Kyb)T=[fltarr(2w+1)-1/(2w+1)]，fltarr(*)表示*个元素值为0的行矩阵；w是正整数，其物理意义为大于或等于PSF第一零级半径而小于分子间距离(图像上存在多个分子时)的像素个数.高斯掩膜质心法将质心法和二维直接高斯拟合相结合，该算法运算量小、精度高、并能有效去除散粒噪声对计算结果的影响.利用高斯掩膜法计算单分子中心坐标的公式为(22)其中(23)式中：Iij、Nij分别表示图像中点(i, j)处的像素值和高斯加权值；p (xp,yp)为通过图像膨胀运算而得到的某一微粒p的像素级坐标；p (xcp,ycp)为微粒p (xp,yp)的具有亚像素分辨率的中心位置，称之为特征点坐标.2.2 中心定位精度计算假设单分子的实际中心位置为(x,y)，计算特征点坐标为，则单分子中心定位精度为(24)式中〈·〉表示对所有参与运算的坐标值的平均.该计算精度与准确度(bias)和精确度σ[7]计算稍有不同，准确度主要反映计算位置同实际中心的偏差程度，精确度反映计算位置本身的集中程度，而δp则反映了计算位置与实际中心的集中程度，更能全面地反映图像信噪比、定位算法、随机噪声等的综合影响.由于实际实验中无法得知单分子的准确位置信息，只能获取其计算位置，故本文中采用计算机仿真，对不同条件下(如I0、b、a不同等)的大数据量单分子图像序列(1 000帧)来定量分析.在每个序列中，每帧图像上除散粒噪声由泊松分布的随机值表示外，其他各参数皆保持不变.2.3 单分子仿真图像序列实验用荧光单分子成像系统以NIKON 90i荧光显微镜(Nikon，日本)为主体，配有CFI60(色差校正光学系统和无限远光学系的融合)物镜(NA0.55，放大倍率50×)、中继放大镜片组(放大倍率4×)、UV-1A荧光滤镜组(典型发射波长为420 nm)及电子增益CCD(Andor，英国)，其成像范围和像素数目分别为8 mm×8 mm和1 004×1 002.计算得知该系统的光学分辨率、单分子PSF宽度、σ、a、NR分别约为466 nm、367 nm、168 nm、40 nm和0.86%.在生成单分子仿真图像序列时，首先依据设置的有效采集光子数N和实验用单分子成像系统的实际配置来确定与PSF相近似的不同峰值I0的二维高斯曲面；然后将该二维高斯曲面叠加到具有常数背景噪声b的图像中去，并明确其中心位置；最后依据每个像素的值，用泊松分布随机值来代替各原始像素值.对于不同I0的二维高斯曲面和b，分别建立1 000帧中心位置确定而具有不同散粒噪声分布的单分子荧光图像，并依据此序列图像来计算定位精度.图1所示为当设定N=1 000、b=2.0时，单分子仿真图像序列生成的过程.此时，I0、SNR分别约为8.58和2.64.3 结果与分析3.1 实验系统的a/s和δtheoThompson等[8]指出为了得到尽可能好的精度，整个成像系统的放大倍率是个重要的因素，在大多数情况下应该调整放大倍率，使得a/s≈1时，可实现最高准确度的定位.其实，一个优化的放大倍率与总采集光子数和背景噪声的大小相关.Thompson等的结论是当N=100、b=0.7时得出来的.针对实际的单分子成像实验系统，笔者在不同的N(20～1 000)和b(0.1～20)条件下，对优化的a/s比例进行了理论计算.如图2所示，在定位精度最优的情况下，对于不同的N和b，其a/s和与之相对应的理论计算精度δtheo是不同的.当b一定时，它们的大小与N成反比；当N一定时，其与b成正比.而SNR与N和b的变化则出现相反的趋势，当b一定时，它的大小与N成正比；当N一定时，其与b成反比.除非在N或b固定的条件下，不然无论是优化的a/s，还是δtheo，都与荧光图像的SNR没有明显的单调递减的关系.在相同的SNR条件下，也可得到不同的a/s和δtheo，例如N=8 500，b=0.7(SNR= 8.50)时，a/s=0.36，δtheo =4.05 nm；N=8 650，b=2.0(SNR= 8.50)时，a/s=0.60，δtheo=4.10 nm；N=8 970，b=5.0(SNR= 8.50)时，a/s=0.96，δtheo=4.19 nm；N=9 460，b=10.0(SNR= 8.50)时，a/s=1.35，δtheo =4.33 nm 等.3.2 IDGM定位精度针对现有的单分子成像系统(σ=168 nm、a=40 nm)，参照Thompson等提出的方法，笔者对Gaussian mask(GM)、IDGM、理论计算和基本极限精度进行了比较分析.图3(a)、3(b)、3(c)、3(d)分别为当b=0.7、2.0、5.0、10.0时，N从100到10 000的变化过程中各精度值的变化曲线.该图中的计算结果与Thompson等的结果稍有不同，这主要是因为采用了不同系统配置和有效采集光子数确定方法的原因.从图中可以看出，随着N的增大，各精度值的偏差不断减小，除GM δp外，IDGM δp和δtheo接近于δfund的趋势明显，如在b=0.7情况下，当N=1 080时，IDGM δp=20.5 nm；当N=5 600时，IDGM δp =7.9 nm；当N=10 000 时，IDGM δp =4.7 nm.若在实验可能的情况下，选择高纯度、大吸收面积、高量子产量、高光学稳定性的荧光物质，并采用良好的边界锐利的滤镜组去除杂散光(如激发光二次入射、瑞利散射光等)，利用荧光和杂散光在时间特性上的区别来消除拉曼散射光，采用低暗噪声、高采集效率的探测器(如液氮冷却、背光照明的增强CCD或电子增益CCD)、构建高效的去噪光路(如大数值孔径物镜、共焦、双光子激发光路等)、适当增加曝光时间等，将会大大增加成像系统的有效采集光子数并降低背景噪声强度，提高单分子荧光图像信噪比，进而得到更好的单分子定位精度，实现更精确的单分子定位.图3(a)、3(b)和3(c)中，有GM δp>IDGM δp>δtheo>δfund，而在图3(d)中，当N>380时，δtheo 与IDGM δp 非常接近，甚至在某些N值，有GM δp>δtheo >IDGM δp >δfund.这不仅说明本文中提出的IDGM算法具有比GM更好的计算精度，而且由于其良好的去噪处理和高斯加权质心运算方式，使得它能突破Thmopson等所提出的理论计算精度的限制，特别是在背景噪声b较大的情况下，IDGM的优势更加明显.此外，在各个图的上方都标注了在相应的背景噪声b下，不同N所对应的SNR值，便于从SNR出发，去分析定位精度的变化趋势.3.3 IDGM定位实验目前已将该算法成功地应用到超高真空荧光有机分子生长设备中对绝缘体表面生长的荧光分子微粒的定位研究之中，如图4所示.实验过程中，先将整个系统排气至2×10-8 Pa的真空度，然后利用液氦对绝缘基体进行冷却使之维持一定的低温状态(可达到150 K)，然后打开分子蒸镀仪，将有机分子蒸镀到绝缘基体表面，最后通过事先已精确对齐和聚焦的荧光显微镜进行成像，并利用自主开发的单分子定位软件对观测微区中的有机分子微粒进行定位.如图5所示，荧光显微镜正确聚焦后，对生长在云母基体上的罗丹明分子微粒进行定位.待打开分子蒸镀仪后，CCD采集的荧光图像上逐渐出现若干个明亮的罗丹明分子微粒，在荧光图像上选择特定区域(图5(a)矩形框内)，则该区域内的分子微粒定位结果如图5(b)所示.在后续的研究中，将分子定位和轨迹链接结合起来，计算分子扩散系数、转移速率、步进位移等，分析分子动力学特性，这对于有机分子薄膜生长机理的探索以及有机分子与基体表面相互作用的理解具有重要的实践意义和理论意义.4 结语以单分子荧光显微术为基础的SMT，不仅揭示个体行为和大量分子平均行为的差异，而且可反映出分子微观环境的变化信息.其中单分子定位精度是SMT算法中重要的考虑因素，本文中对单分子定位算法的精度进行了详细而全面的分析，并理顺了信噪比和有效采集光子数间的相互关系.通过对IDGM算法的精度分析可以发现，它计算精度高，对图像信噪比要求低，加之以质心法为核心的计算特点，其结构简单，计算速度快.可以说，该算法在表面物理学、生物物理、细胞学等领域的单分子研究中，特别是实时在线的分子动力学研究中具有很高的应用价值.参考文献：[1] Anderson C M, Georgiou G N, Morrison I E G, et al. 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Tracking single particles: A user-friendly quantitative evaluation[J]. Physical Biology, 2005, 2(1): 60-72.基金项目：中国-奥地利国际合作项目(WTZ-VII.VB.18，2008DFA71610)；国家自然科学基金资助项目(50675152)；高等学校学科创新引智计划111项目(B07014).。
超高分辨率荧光显微镜中单分子识别和定位算法及抗漂移方法
超高分辨率荧光显微镜中单分子识别和定位算法及抗漂移方法1873年，德国物理学家Ernst Abbe发现由于光的衍射，传统远场光学显微镜空间分辨率极限大约在250nm(Abbe极限)。
上世纪90年代以来，开发了多种用于突破Abbe极限的光学成像新技术和新方法。
在这些技术和方法中，单分子定位显微镜(single molecule localization microscopy, SMLM)，比如光活化定位显微镜(photoactivation localization microscopy，PALM)和随机光学重建显微镜(stochasticoptical reconstruction microscopy，STORM)，基于识别和定位单分子荧光闪烁，可获得20-30nm的横向分辨率和60-70nm的轴向分辨率。
在SMLM方法中，所探测的为单分子荧光事件，由于单分子荧光信号微弱，及背景和噪声的存在，单分子事件的识别是一件富有挑战的工作。
本文提出了一个实时，健壮的单分子荧光识别和定位算法(SNSMIL)，该算法基于光子探测过程中噪声的内在特征(泊松噪声)的分析，即使在高背景和不均匀背景的条件下，也能极大提高单分子荧光事件的识别精度。
为了完成实时数据分析，开发了运行在图形处理单元(GPU)上的软件，实现了大规模并行计算，达到数据采集和分析的同步。
另一方面，一个典型的SMLM测量需要记录1000-100000帧的图片(成像速度为10-1000帧/秒),每次测量需要几分钟或更长的时间，由于力学弛豫，温度变化等原因，样品漂移(通常1-10nm/s)不可避免，而SMLM成像的目标是几十纳米的超高分辨率图像，样品漂移会降低图像的分辨率，甚至使图像失真，已经成为不可忽略的问题。
本文提出了一个亚纳米精度，低成本的抗样本漂移的方法。
该方法同时记录荧光图像和明场图像，通过最小化明场图像之间的归一化均方根误差(normalized root-mean-square error，NRMSE)，得到样品的漂移量，该方法不仅可以用于测量完成后的漂移修正，也可以用于测量中的实时漂移补偿。
【推荐下载】超分辨光学成像中的高密度荧光分子定位方法
超分辨光学成像中的高密度荧光分子定位方法
荧光分子定位是该技术不可缺少的一步，其荧光分子定位的精度和被定位的荧光分子数决定了超分辨成像的空间分辨率
光学显微镜的分辨率受到衍射效应的限制。
自1873年以来，200纳米的阿贝极限一直被认为是光学显微镜理论上的分辨率极限。
近年，人们在超越衍射极限的成像方法研究中取得了令人瞩目的进展，其中，基于单分子定位的超分辨光学成像技术（即：单分子定位显微成像技术），获得了高达30~50 nm的空间分辨率，为科学研究的诸多领域，尤其是活细胞内动态过程的研究，提供了前所未有的工具。
单分子定位显微成像技术是一种依赖于单分子荧光成像和定位来实现超分辨成像的宽场荧光成像技术。
从原理可知，荧光分子定位是该技术不可缺少的一步，其荧光分子定位的精度和被定位的荧光分子数决定了超分辨成像的空间分辨率。
目前的荧光分子定位方法在速度和精度方面得到不断发展，但是这些方法仅考虑荧光分子充分分离的情形（即稀疏定位），即它们的艾利斑不相互重叠。
而在实际的单分子成像中，一个艾利斑内存在两个甚至更多个待定位分子的情形不可避免。
因此，发展高密度荧光分子定位方法，在不损失所需定位荧光分子总数情况下，减少荧光分子成像次数，有利于扩展单分子定位显微成像技术的应用领域。
武汉光电国家实验室（筹）Britton Chance生物医学光子学研究中心现代显微光学成像研究团队黄振立教授、全廷伟博士生等，与我校数学系刘小茂副教授、生命科学与技术学院丁久平教授等合作，根据单分子定位显微成像技术的原理，建立了一种高密度荧光分子定位方法SSM_BIC。
数值分析和实际实验结果表明，相比于稀疏定位方。
光学工程中超分辨成像技术的研究与应用
光学工程中超分辨成像技术的研究与应用在今天科学技术日新月异的时代，光学成像技术更是朝着高清晰度、高精确度、高速度的方向不断发展，而超分辨成像技术作为光学成像技术的高端产品，一直备受科学家和工程师的重视和研究。
本文将从基本原理到应用实践，全面介绍超分辨成像技术的研究和应用。
一、超分辨成像技术的基本原理超分辨成像技术是指利用一些特殊的成像原理或者技术手段，将物体的微小细节信息呈现出来，从而达到超越传统光学分辨极限的图像清晰度和精确度。
在光学领域，超分辨成像技术最核心的原理就是“突破衍射极限”。
1. 衍射极限的基本概念在光学领域，衍射极限是指在理想条件下，可分辨两个形态不同但空间位置非常近的物体时，两者之间的最小距离，也叫做“最小可分辨距离”。
在底片放大成像时，这个距离通常被表示为空间频率（即一个典型的线数/mm）。
根据基本物理原理，可分辨距离的最小值约等于半个光波长。
2. 突破衍射极限的方法为了实现超越传统光学分辨极限的图像清晰度和精确度，科学家和工程师们通过各种手段来突破衍射极限，如：（1）双光子激发显微术（TPM）：这种技术是基于二次激光的原理，通过激发样本的荧光信号，在三维空间内重建出样本的一个高分辨率的图像。
（2）双片方法：双片方法利用一种迭代算法来分析和优化成像系统中的点扩散函数，从而超越传统光学分辨极限。
这种方法通常需要校准成像系统的点扩散函数，因此对计算机和软件的要求比较高。
（3）固体光学自旋陀螺磁共振成像（SOLID）：这种技术结合了光学和磁共振成像的优点，可以在超过传统光学分辨极限的情况下对样品进行高精度成像。
（4）单分子荧光成像：这种方法可以实现单个分子的成像，可以用来研究生物分子之间的相互作用和位置关系。
二、超分辨成像技术的应用实践超分辨成像技术在生物学、材料科学、化学等领域有着广泛的应用，可以为研究者提供更加全面、高清晰的实验数据和结果。
下面将介绍超分辨成像技术在这些领域的应用实践。
超分辨显微成像中荧光单分子定位算法的研究进展
39卷2期 2020年4月中国生物医学工程学报Chinese Journal of Biomedical EngineeringVol. 39 No. 2 April 2020超分辨显微成像中荧光单分子定位算法的研究进展林婉妮金璐红许迎科>(浙江大学生物医学工程系，生物医学工程教育部重点实验室， 浙江省心脑血管检测技术与药效评价重点实验室，杭州310027)摘要：超分辨显微成像技术的发展，可为生物医学的研究提供前所未有的机会。
基于单分子定位的超分辨显微 成像技术由于其相对简单的硬件结构，在生物医学领域的应用较为广泛。
单分子定位的超分辨成像巧妙利用荧光 发光的特点，针对少量离散的随机发光的荧光分子进行成像，再通过拟合分析实现单分子的高精度空间定位。
在 这一过程中，荧光单分子的定位算法及图像处理速度显得尤其关键。
对单分子定位成像算法的基本原理进行阐 述，包括模型和估计器的选择以及重建结果的评估等内容。
同时针对拟合方法和功能的不同，对10余种算法进行 分类和比较，并选取具有代表性的算法展开讨论和分析，希望对未来开展相关研究提供一定的参考。
关键词：单分子定位；算法；超分辨显微成像；点扩散函数；图像处理中图分类号：R318文献标志码：A文章编号：0258-8021( 2020) 02-0229-09Lin WanniJin LuhongXu Yingke *(Department o f Biomedical Engineering , Key Laboratory for Biomedical Engineering o f Ministry of Education ,Zhejiang Provincial Key Laboratory of Cardio-Cerebral Vascular Detection Technology and Medicinal Effectiveness Appraisal ,Zhejiang University, Hangzhou 310027, China)A b stra c t ： The development of super-resolution microscopy has provided an unprecedented opportunity for biomedical research. The single-molecule localization based super-resolution imaging has been widely used in biomedical field due to its relatively simple hardware structure. Single-molecule localization microscopy utilizes the characteristics of fluorescence molecules to randomly activate and image a small number of discrete distributed fluorophores, and then achieves high-precision spatial localization of single molecules by fitting analysis. In this p rocess, the algorithms for single-molecule localization and the speed of image processing are particularly critical. This review briefly elaborated the single-molecule localization algorithms according to their basic principles, including model selection, estimator selection and reconstruction result evaluation methods. Based on that, we classified and compared the capabilities of more than ten developed algorithms, and also selected a few representative algorithms to discuss and introduce their functions. We hope this review would provide reference for future related research.K ey w o r d s ： single-molecule localization ； algorithm ； super-resolution microscopy ； point spread function ； image processingdoi ： 10. 3969/j.issn.0258-8021. 2020. 02.12 收稿日期：2019-07-18,录用日期：2020-01-16基金项目：科技部重点研发计划（2018Y FE0119000);国家自然科学基金（ 31571480);中央高校科研业务费专项（2019FZJD005, 2019XZZX003-15)* 通信作者（Corresponding author)，E-mail: yingkexu@文中彩图请见电子版（Please refer to the online version for the color pictures in this article)，website: Progress on Single-Molecule Localization Algorithmsfor Super-Resolution Imaging230中国生物医学工程学报39卷引百生物医学显微成像对于细胞生命活动的探索和人体疾病发生机理的探究具有十分重要的作用。
生物大分子的高分辨率荧光显微镜成像
生物大分子的高分辨率荧光显微镜成像随着生命科学的不断发展和进步，生物学的研究越来越多地涉及到生物大分子和生物发生学过程的研究，尤其是在分子生物学和细胞生物学领域。
而对于分子生物学和细胞生物学领域的研究，高分辨率荧光显微镜成像是一个非常有用的方法。
高分辨率荧光显微镜成像是利用荧光素和荧光标记蛋白等技术，对生物大分子进行成像和观察的方法。
由于荧光素分子和荧光标记蛋白分子具有高度的特异性和亲和力，可以实现针对生物大分子的高效成像。
同时，荧光显微镜的高倍率放大和高分辨率成像技术，能够将生物大分子的微小结构和空间分布显示出来，从而有助于研究生物大分子的行为和功能。
在高分辨率荧光显微镜成像中，有多种技术被广泛应用于生物大分子成像，如构象光学显微镜（SIM）、闪烁显微镜（STORM）、融合球镜光学显微镜（PALM）、多光子显微成像和超分辨率立体显微成像等。
其中，SIM技术是一种能够利用计算机算法将高频次的图像重叠起来，形成比原始图像更清晰的一幅图像的技术。
这种技术可以将原始图像的分辨率提高至原来的两倍，从而可以用来分析许多生物大分子的微观结构和空间关系。
SIM技术相对较为简单，不需要复杂的光学系统，操作也相对较为简单。
STORM和PALM技术则是两种超分辨率显微技术，这两种技术可以将生物大分子的空间分辨率提高至几十纳米级别，可以用来观察生物大分子的结构和行为。
这两种基于单分子显微镜的技术，需要对样品进行荧光标记和与荧光成像相关的光学设备的特殊优化，操作比较复杂，但是能够提供更高分辨率的成像结果。
多光子显微成像是一种非常优秀的三维成像技术，它可以通过对样品进行逐层扫描，来获得样品三维结构和空间分布信息。
另外，多光子显微成像技术中可以选择不同波长的光线来激发不同的荧光探针，从而可以实现对多种不同生物大分子的成像。
最近，又出现了一种新的高分辨率荧光显微镜成像技术，就是超分辨率立体显微成像。
这种技术基于高效的样品标记和高度优化的三维成像方案，可以实现对大分子的近原位成像。
几种光学超分辨技术研究
几种光学超分辨技术研究光学超分辨技术是一类用于克服传统光学成像分辨率极限的方法和技术。
在传统光学成像中，受到波长的限制，光的衍射现象会限制图像的分辨率。
为了获得更高分辨率的图像，人们提出了多种光学超分辨技术。
下面将介绍几种常见的光学超分辨技术。
1.稳态荧光衍射光学显微术（STED）稳态荧光衍射光学显微术是由德国科学家Stefan Hell和EricBetzig等人在20世纪80年代末至90年代初提出的一种超分辨显微技术。
STED显微镜利用激光束对样品进行扫描，通过对激光束进行调制，使样品中只有少数发射的荧光分子处于激活状态，从而实现超分辨成像。
STED技术可以获得亚微米级的分辨率，有助于研究生物学领域的微观结构和功能。
2.结构光干涉显微术（SIM）结构光干涉显微术是一种在传统显微镜基础上改进的超分辨技术。
它通过对待测样品照射特殊的结构光图案（通常为酒吧码或网格图案），然后利用计算机处理信号，将不同方向的图像叠加，从而获得比传统显微镜更高的分辨率。
SIM技术可以实现亚微米级的分辨率，并且适用于多种样品类型。
3.单分子定位显微术（SMLM）单分子定位显微术是利用荧光显微镜观察单个荧光染料分子的显微技术。
该技术通过一系列的成像和定位过程，可以沿着不同的方向精确定位单个荧光标记的分子，并将它们的位置叠加，从而获得超分辨率的图像。
SMLM技术可以实现几十纳米甚至更高的分辨率，广泛应用于生物学的研究。
4.增强型受限光学显微术（STORM）增强型受限光学显微术是一种基于单分子定位显微术的超分辨技术。
STORM通过控制荧光标记分子的发光过程，利用闪烁或蓝色激光等方法，可以将分子的亚微米级位置信息以高精确度记录下来，并重建出超分辨率的图像。
STORM技术具有非常高的分辨率和灵敏度，被广泛应用于生物学、生物医学和纳米材料科学的研究中。
光学超分辨技术在生物学、材料科学、纳米科学等领域起到了重要作用。
随着技术的不断发展，相信未来还会涌现出更多的光学超分辨技术，为科学研究和实际应用提供更强的解析能力。
光学显微镜中的超分辨成像技术研究
光学显微镜中的超分辨成像技术研究光学显微镜是物理学、生物学和化学分析等领域中必要的测量和分析工具。
与传统显微镜技术相比，光学显微镜中的超分辨成像技术不仅改善了成像的质量，还扩大了其研究的范围和应用场景。
本文将从成像理论、超分辨率成像技术和应用等方面进行讨论。
一、成像理论光学显微镜是一种基于光学成像原理的显微镜。
传统显微镜基于线性成像原理，即根据物体和像之间的像比例来确定像的大小和位置。
但这种成像是受到光学衍射极限的制约。
在实际成像中，光线通过样品后受到光学衍射的影响，形成一个模糊的像。
在衍射极限范围内，即物体和像之间的距离少于1/2波长，成像会变得非常困难。
这一现象被称为光学衍射极限。
超分辨率成像技术的出现解决了这一问题。
超分辨率成像技术利用了非线性光学成像原理，即根据光子数量和能量的分布来确定像的大小和位置。
二、超分辨率成像技术超分辨率成像技术包括单分子成像技术、受限发射成像技术、受限焦点技术等。
这些技术的主要目的是克服成像限制。
单分子成像技术是一种成像方法，它通过在样品中引入单分子级别（几百纳米以下）的荧光标记来实现超分辨成像。
单分子成像技术已被应用于细胞膜、神经细胞及细胞器的成像，成为生命科学和药学领域研究的重要分支。
受限发射成像技术通过限制样品中发射光子的数量和位置来实现超分辨成像。
这种技术基于发射光子的原理，通过在样品表面上加上聚合物、纳米颗粒等能够受限制发射的物质，限制发射光子数量和位置，最终实现超分辨成像。
受限焦点技术是基于受限原理，即通过物质的制造或设计，限制光线到达焦点的范围，最终实现超分辨成像。
通过像空间光调制、透镜配合和多孔膜等手段，可以实现受限焦点技术。
三、应用光学显微镜中的超分辨成像技术在生命科学、材料科学和工业生产等领域中得到广泛应用。
以下是具体应用的一些案例：1. 生命科学超分辨率成像技术被广泛应用于生命科学研究中。
比如，在细胞呼吸、细胞内分子交互和细胞受体功能方面，超分辨率成像技术对进一步深入研究起到了重要作用。
超分辨荧光成像技术
受激发射损耗显微技术（STED）
原理：通过受激发射损耗的方式来改变荧光基团发射荧光的区域，借助受激 辐射过程中的非线性效应，压缩 PSF，突破衍射极限对分辨率的限制实现超 分辨成像。
受激发 能级图
xy 平面STED 显微镜压缩 PSF的示意图
STED 显微 L1 镜的结构
L0
A. S1最低能级的荧光分子遇到 波长与基态和激发态能级差相匹 配的光子就会发生受激辐射回到 基态，失去发荧光的能力。 B.STED 显微镜借助波长相对于 激发光红移的STED 光来压缩 PSF。 C.STED 光产生的圆环光斑是中 心强度为零而中心以外区域强度 不为零的圆环光斑。
2.彩色成像。用不同颜色的荧光分子对标记研究对象，选 取恰当的激发光，就能区分细胞内的不同结构，分析结构 间的相互作用。
3. 3D成像：借助像散成像技术获得观测对象的Z轴信息， 可获得生物大分子的STORM3D图像。
STORM的缺点
由于需要反复激活-猝灭荧光分子，所以使得实验大多数在 固定的细胞上完成。即使是在活细胞上进行的实验，也不 易获得足够高的时间分辨率。
超分辨荧光显微镜术
分辨率
光激活定位显微技术
1nm
随机光学重构显微技术
20-30nm
受激发损耗显微技术
大约50nm
饱和结构照明显微技术 径向 100 nm 、轴向 约200 nm
可逆饱和线性荧光跃迁（RESOLFT）
原理：可逆光饱和转移过程。
转移截面大小
图 1 RESOLFT过程的原理图
A→B的转移过程可以由入射光来驱动。而反转移过程 B→A 可以由任 意形式的能量来驱动，如光、化学反应、热能，甚至是自发辐射等。
PALM成像方法的点扩散函数成像仍与传统显微成像一致，时间 分辨率低。
超分辨率荧光显微技术的原理和进展
超分辨率荧光显微技术的原理和进展姓名：曹宁学号：104753141002专业：药理学2015年2月超分辨率荧光显微技术的原理和进展摘要：在生命科学领域，人们常常需要在细胞内精确定位特定的蛋白质以研究其位置与功能的关系。
多年来，宽场/共聚焦荧光显微镜的分辨率受限于光的阿贝/瑞利极限，不能分辨出200 nm以下的结构。
近年来，随着新的荧光探针和成像理论的出现，研究者开发了多种实现超出普通共聚焦显微镜分辨率的三维超分辨率成像方法•主要介绍这些方法的原理、近期进展和发展趋势。
史蒂芬•赫尔 (Stefan w. Hell)、埃里克•本茨格 (Eric Betzig)和威廉•默尔纳(William E.Moerner)因在超分辨率荧光显微技术方面的贡献共享了2014年的诺贝尔化学奖。
他们使用荧光分子和特殊的光物理原理，巧妙地突破了普通光学显微镜无法突破的“阿贝极限”，其开创性的成就使光学显微技术发展为“显纳”技术，能够窥探纳米世界。
关键词：超分辨率荧光显微技术，光激活定位显微技术，随机光学重构显微技术，点扩散函数现代生物医学研究中为了更好地理解人体生命的作用过程和疾病的产生机理，需要观察细胞内细胞器、病毒、寄生虫等在三维细胞空间的精确定位和分布.另一方面，后基因组时代蛋白质科学的研究也要求阐明：蛋白质结构、定位与功能的关系以及蛋白质-蛋白质之间发生相互作用的时空顺序；生物大分子，主要是结构蛋白与RNA及其复合物，如何组成细胞的基本结构体系；重要的活性因子如何调节细胞的主要生命活动，如细胞增殖、细胞分化、细胞凋亡与细胞信号传递等.反映这些体系性质的特征尺度都在纳米量级，远远超出了常规的光学显微镜(激光扫描共聚焦显微镜等)的分辨极限(xy向分辨率：200 nm， z向分辨率：500 nm)⑴应用传统的电子显微镜(EM)可以达到纳米量级的分辨率，能够观察到细胞内部囊泡、线粒体等细胞器的定位，但是由于缺乏特异性的探针标记，不适合定位单个蛋白质分子，也不适合观察活细胞和细胞膜的动态变化过程. 因此，生物学家迫切希望有一种实验显微方法，它既具有亚微米甚至纳米尺度的光学分辨本领，又可以连续监测生物大分子和细胞器微小结构的演化，而并不影响生物体系的生物活性.近年来，随着新型荧光分子探针的出现和成像方法的改进，光学成像的分辨率得到极大的改进，达到可以与电子显微镜相媲美的精度，并可以在活细胞上看到纳米尺度的蛋白质［2~5］・这些技术上的进步势必极大地推动生命科学的发展，为了增强生物学家对于超分辨率荧光显微成像（super-resolution fluoresce nt microscopy）机理的理解，以下我们将介绍传统的荧光显微成像的极限，突破此极限超分辨率成像的原理以及目前国际上的最新进展•1■光学显微镜与阿贝极限最简单的光学显微镜由2个凸透镜组成，它利用的就是凸透镜能将物体的像放大的原理。
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(a)TIRF图像；（b）由稀疏定位方法得到超分辨图像；（c）由SSM_BIC方法分析得到的超分辨图像；(d)-(e)单分子的信息统计。(标尺: 2 μm )。
超分辨光学成像中的高密度荧光分子定位方法
光学显微镜的分辨率受到衍射效应的限制。自1873年以来，200纳米的“阿贝极限”一直被认为是光学显微镜理论上的分辨率极限。近年，人们在超越衍射极限的成像方法研究中取得了令人瞩目的进展，其中，基于单分子定位的超分辨光学成像技术（即：单分子定位显微成像技术），获得了高达30~50 nm的空间分辨率，为科学研究的诸多领域，尤其是活细胞内动态过程的研究，提供了前所未有的工具。
单分子定位显微成像技术是一种依赖于单分子荧光成像和定位来实现超分辨成像的宽场荧光成像技术。从原理可知，荧光分子定位是该技术不可缺少的一步，其荧光分子定位的精度和被定位的荧光分子数决定了超分辨成像的空间分辨率。目前的荧光分子定位方法在速度和精度方面得到不断发展，但是这些方法仅考虑荧光分子充分分离的情形（即稀疏定位），即它们的艾利斑不相互重叠。而在实际的单分子成像中，一个艾利斑内存在两个甚至更多个待定位分子的情形不可避免。因此，发展高密度荧光分子定位方法，在不损失所需定位荧光分子总数情况下，减少荧光分子成像次数，有利于扩展单分子定位显微成像技术的应用领域。