第八讲 农药生物测定
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C. 生理指标的测定方法
a、浮萍法 • 基本原理是季胺盐类除草剂可以干扰植物细胞光合作用中 的电子传导系统,使植物失水失绿枯死; • 将药剂配成一定的浓度后,利用水中浮萍的失绿程度可以 作为评判药剂活性的指标; • 用乙醇提取被处理的浮萍中的叶绿素,以叶绿素的含量作 为评判指标。 b、单细胞藻类法 • 此法对抑制光合作用和呼吸作用的除草剂特别灵敏; • 一般选用小球藻作为指示植物,将供试药液跟有小球藻的 培养液混匀后,恒温培养一段时间,甲醇提取叶绿素,用 分光光度计测定叶绿素的透光率,推算出药剂的EC50。
c. 熏蒸作用
• 要求:必须在密闭的条件下进行。 • 仪器装置:有静止气体的测定装置和有气流出入 控制的熏蒸器。
d.内吸作用 • 直接测定法: • 间接测定法:用药液处理植物的局部,一定时间后取未处 理的部位加以研磨,稀释成不同浓度的汁液,再放入一定 数量的水蚤等观察其死亡情况,利用此法间接测定药剂是 否有内吸作用。 e.拒食作用 • 以昆虫的取食量或昆虫对食物的所食部位和昆虫体重的变 化等做的分析,作为药剂对供试昆虫是否有拒食活性的依 据。 • 选择性拒食活性测定:在同一培养皿中交错放入处理叶碟 与对照叶碟的方法; • 非选择拒食活性测定:在培养皿中仅放入对照或处理叶碟 的方法。
4、室内毒力测定的方法
(1)杀虫剂的毒力测定
• • • • • • • • • 杀虫剂的毒力测定方法要根据作用方式来设计。 A、常规活体生物测定 a. 触杀作用 喷雾法 如Potter喷雾塔 喷粉法 适用于水生昆虫、储粮害虫、介壳虫及蚜虫、供试昆虫的 卵等。 浸液法 点滴法 一般用冷冻法、乙醚处理法、二氧化碳处理法将试虫麻醉。 注射法 药膜法 将定量的药剂均施于滤纸、玻璃板或蜡纸上,形成一个均 匀的药膜,再将供试昆虫放在上面爬行一定的时间,然后再转移到 正常的环境下,一定时间后观察记录昆虫死亡情况。适用于一切爬 行的昆虫和某些飞翔的昆虫(如蚊、蝇等成虫)。
c. 希尔反应法 • 基本原理是叶绿体在光照条件下,使水光解产生H+和电子, 同时放出氧气,产生的电子使电子受体(氧化剂)还原, 可筛选光合作用抑制剂; • 如铁氰化钾,在光下可以发生从水中释放氧气的反应,同 时氧化剂被还原变色,利用这一反应,用分光光度计对底 物Fe(CN)6 3-的减少量或产物Fe(CN)6 4-及O2的形成量进行 测定,就可以定量测定希尔反应活力,判定药剂的活性。 d、酶水平测定方法 • 如通过测定植物体内莽草酸的累积量,作为评价草甘膦活 性的衡量指标; • 根据磺酰脲类除草剂可抑制乙酰乳酸合成酶ALS活性的原 理,可用乙酰乳酸合成酶活性的变化测定植物对磺酰脲类 除草剂的活性。
b.胃毒作用
①饲喂法:饲喂的方法分为无限制给食法及定量给食法;根 据饲喂的方式又分为叶片夹毒法及单叶饲喂法。 • 叶片夹毒法:吞食药量的计算是以试虫吞食叶面积乘以单 位面积叶片的剂量(μg/g)。 • 叶面积计算:方格纸法、叶面积测定仪法、电脑扫描法。 • 致死中量的求法:按每头虫吞食剂量的大小顺序排列,并 标明该剂量下试虫的死活情况,从而将虫划分成生存组、 生死组和死亡组。生死组中既有生存的又有死亡的,分别 计算生死组中生存个体和死亡个体平均吞食的药量,记为 A和B。 • A=(生死组活虫剂量总和)/生死组活虫总数 • B=(生死组死虫剂量总和)/生死组死虫总数 • LD50=(A+B)/2
B. 植株生长量的测定方法
• 主要针对已经发芽的除草剂,尤其是抑制光合作用的除草 剂的常规室内生物测定方法。 a、去胚乳小麦幼苗法 • 此法是测定抑制光合作用除草剂的专用方法; • 先挑选出长势一致的幼苗,摘除胚乳后,用供试药液处理 幼苗,培育一定的时间,测定幼苗的株高,以株高抑制率 来衡量药剂的活性。 b、萝卜子叶法 • 此法适用测定触杀性及影响氮代谢的除草剂; • 先将萝卜籽催芽成幼苗后切下子叶,并用不同浓度的供试 药液处理子叶,保持恒温,并在一定的光强下培养一段时 间,称量鲜重及测定叶绿素的含量,计算IC50。
e、高通量筛选方法
(a)活体筛选方法 • 以各种病原物为筛选靶标的直接筛选方法:首先将一定浓度样品用移 液器移至微量滴定板上,再用另一移液器将均匀的供试菌菌丝体或孢 子悬浮液接种到每一孔上,混匀后用分光光度计测定混合液的初始光 密谋值Ⅰ,然后置适宜条件下振荡培养一定时间,再测定光密度值Ⅱ, 如果二者相等或光密度值Ⅱ降低,说明菌体不能生长,判定被测物有 活性,否则无活性。 • 以酿酒酵母菌为模型菌的筛选方法:在控制条件下,将酿酒酵母菌与 待测化合物相互作用一定时间后,观察化合物对酵母菌生长的抑制情 况。 (b)离体筛选方法 • 靶标酶的测定方法:如将菌体悬浮液与牛心线粒体及待测化合物分别 加入微量滴定板孔中,混匀,控制条件下反应一定时间后,在340nm 下测定光密度值,计算NADH的含量,如果NADH含量降低,说明待测物 抑制了电子传递过程,化合物有活性。 • 全细胞测试:用于筛选真菌甾醇生物合成抑制剂。
(2)组织筛选测定法
• 介于活体与离之间的筛选方法; • 测定药剂的保护作用:取小块寄主植物的主要寄 生部位经过供试药剂处理后,再接种病原菌,通 过一段时间的培养后,观察药剂是否对病原菌有 防治效果;如测药剂是否有治疗作用,则先接种 病原菌,然后再将药液处理植物组织。
Fra Baidu bibliotek (4)除草剂的毒力测定方法
(1)对种子萌发的测定方法 A、培养皿法 • 药剂处理种子后培育一段时间,观察敏感植物根 长抑制率或芽长抑制率。 B、黄瓜幼苗形态法 • 是每隔一定时间观察黄瓜幼苗的形态,与事先已 经用2,4-D系列浓度处理后的黄瓜幼苗形态作对照 的标准图谱进行对比,推测药剂活性的大小。 C、琼脂测定法 • 是将药剂定量的倒入融化的琼脂液中,混匀后倒 入培养皿中冷却凝固,之后接入供试植物的种子, 观察发芽后的情况。
d.生物芯片
• 生物芯片技术,采用光导原位合成或微量点样等 方法,将大量生物大分子,如核酸片段、多肽分 子等生物样品有序地固化于支持物(如玻片、硅 片等)的表面,组成密集二维分子排列,然后与 已标记的待测生物样品中靶分子杂交,通过特定 的仪器,如激光共聚焦扫描等对杂交信号的强度 进行高效、快速地检测分析,从而判断样品中靶 标分子数量。
(2)必须设立对照 • 空白对照:不做任何处理的对照; • 不含药剂对照:与药剂处理所用溶剂或乳化剂 完全一样,只是不含药剂; • 标准药剂对照:用标准药剂作对照。 (3)处理必须设重复 • 一般至少重复3次。 (4)运用生物统计分析试验结果
3、供试材料
• 应参考的原则:
• 在室内人为环境条件下,应用较简便、快速的繁 殖技术,可保证全年定时大量供应,不受季节限 制; • 应是广泛发生为害的主要农林有害生物,具有重 要的经济意义,而且在分类地位上有一定的代表 性; • 对药剂的敏感性符合要求,试验时易操作。
• 我国常用的生物种类:
(1)昆虫和螨类 • 粘虫、棉铃虫、玉米螟、二化螟、小菜蛾、褐飞 虱、棉蚜、豆蚜、米象、杂拟谷盗、家蝇、淡色 库蚊、朱砂叶螨等。 (2)病原菌 • 稻瘟病菌、水稻纹枯病、小麦条锈病菌、甘薯黑 疤病菌、黄瓜霜霉病菌、柑桔青霉病菌等。 杂草 • 野燕麦、稗草、看麦娘、苋、荠菜、播娘蒿、藜 等。
(2)杀螨剂的毒力测定
A、玻片浸渍法 B、叶片残毒法 • 是在培养皿中放入已经用药液处理并晾干 的叶片,然后接入长势一致的成螨,放入 培养箱,一定时间后观察其死亡率。 C、叶碟浸渍法 • 是将带有成螨的叶片直接浸渍在药液中5s 后取出,一段时间后,观察螨的死亡率。
(3)杀菌剂的毒力测定方法
A. 基于离体平板培养的毒力测定方法 a、孢子萌发测定法 • 其原理是在载玻片或平板上,通过滴加或喷施等 方法将药液施于其上,然后滴加一定浓度的孢子 悬浮液,经过一定时间培育后,在显微镜下观察 孢子的萌发率。 b、抑菌圈法 • 先将病原菌孢子或菌丝的悬浮液与培养基混匀, 待混合物冷却后,放入吸有不同浓度药液的纸片 (或圆环中加药液),经过一定时间培育后,观 察以纸片为圆心的抑菌圈的大小。
c、生长速率测定法 • 是趁热在培养基中加入药液,混合均匀后 冷却,然后在无菌条件下将病原菌接入装 有培养基的培养皿中央,经过一定时间培 育后,观察病原菌菌丝的生长情况。 d、对峙培养法 • 是将天然提取物及病原菌同时放在同一有 培养基的培养皿的两边,经过一定时间培 育后,观察菌丝生长的情况。如果提取物 有抑菌作用,则病原菌的生长会受到一定 的限制。
②饲饮法 此法适用于蝇、蝽类等有吸食习性的昆 虫。 • 又分为自由饲饮法和强制饲饮法 • 自由饲饮法:是一种无限制的饲饮方法,让昆虫 自己取食配好的混有药剂的糖液,通过测定吸食 前后昆虫的重量或药液的体积计算昆虫吸食药剂 的量; • 强制饲饮法:是将昆虫固定后,将装有药液的移 液管口放在昆虫的口边,昆虫吸食到一定的体积 后就移开移液管,保证每头虫体吸取药剂的量相 同。
f.引诱作用
• 分性引诱剂、食物引诱剂和产卵引诱剂。
g.驱避作用
• 其原理与引诱作用相类似。
h.生长发育与生育干扰作用
• 通过胃毒、接触、熏蒸、内吸等处理方法,观察 昆虫蜕皮、化蛹、羽化的变化及其形态的变化、 产卵量及卵的孵化率等指标来观察药剂作用的效 果。
B.细胞水平及分子水平的生物测定
a.预期作用靶标抑制活性的测定 • 可以简化生物筛选测定的步骤与时间。 b.MTT(四噻唑蓝)法 • 活细胞中的琥珀酸脱氢酶可使MTT分解产生紫色结晶状颗 粒积于细胞内和细胞周围,其量与细胞数及细胞活力呈正 比。药剂处理细胞后,加入MTT,再测出所有混合液体的 吸光值,可推断细胞的活力,衡量供试药剂的毒力大小。 c.生物传感器 是一种以生物的部分活性物质作为敏感部件, 结合物理化学分析仪器,对特定种类化学物质或生物活性 物质具有选择性和可反应的分析装置。 • 按照识别元件可分为:基于分子(酶、抗原或抗体、受体、 核酸、脂质体等)的传感器、基于细胞的传感器和基于组 织切片的传感器。
C.高通量筛选
a.活体筛选 • 只对个体较小、对药剂敏感而且容易培养和操作的供试昆 虫,如鳞翅目低龄幼虫、水蚤等较为适用; • 操作步骤:将一定量的待测药液和昆虫人工饲料或营养液 分别加入微量滴定板的孔中,混匀;然后将单头供试昆虫 或者卵置于每一孔内,用透明盖封好,放置在温度、湿度、 光照等适宜的控制条件下培养一定时间,后检查结果,观 察记录供试昆虫的生命指标,如生存或死亡、生长取食情 况等,推测判断供试药剂的生物活性。 b.离体筛选 • 受体结合试验:适用筛选对供试昆虫神经受体有抑制活性 的化合物; • 靶标酶活性测定:用于筛选对昆虫靶标酶有活性的化合物。
第八讲 农药生物测定与田间药效试验
主要内容: 1、农药的生物测定 2、农药田间药效试验
一、农药的生物测定
1、概述
• 农药的生物测定:是指利用生物(动物、植物、微生物等) 的整体或离体组织、细胞以及细胞中的活性物质(如靶标 酶、细胞膜等)对某些化合物的反应如死亡率、抑制率等, 作为评价他们生物活性的量度,运用特定的实验设计,以 生物统计为工具,测定供试对象在一定条件下的效应。 • 生物测定涉及的内容和范围: • (1)活性筛选的常规测定; • (2)农药残留的微量生物分析; • (3)抗性毒力测定; • (4)药害毒性测定。
2、生物测定试验设计的基本原则
基本要求:
• 室内测定的药品应该是纯品,至少要有确切的有 效成分含量; • 供试生物应该是纯种,个体差异小,生理标准较 为均一; • 确定的环境条件。
(1)相对的控制环境条件 • 室内应该尽量保持与田间环境条件的一致性; • 测定农药的毒力,原则上要求只有两个变数,一 个是药剂的剂量或浓度作为自变数,另一个是死 亡率或抑制率作应变数; • 室内测定:要控制温度和湿度;使用精密的测试 仪器及严格的测试方法;供试虫种或菌种要用室 内饲养标准化的纯种; • 小区试验:应尽量力求所选地区土壤肥力、病虫 害分布、作物长势及管理水平等条件均匀相似。