免疫细胞分离及NK活性测定

处死小鼠，消毒取脾，去除结缔组织和脂肪组织，放入平皿（ 处死小鼠，消毒取脾，去除结缔组织和脂肪组织，放入平皿（3ml Hanks 液）; 轻轻拉碎脾组织，制成脾细胞悬液，过200目滤网制成单细胞悬液; 目滤网制成单细胞悬液; 轻轻拉碎脾组织，制成脾细胞悬液， 200目滤网制成单细胞悬液 离心（1500转/分 5min），弃去上清; 5min），弃去上清; ），弃去上清 离心（1500转 用Hanks液洗涤2次(加入3ml Hanks液，混匀， 1500转/分 5min，去上 Hanks液洗涤 液洗涤2 加入3ml Hanks液 混匀， 1500转 5min， 最后一次吸尽上清，加入1ml 1640培养液 混匀； 培养液， 清)，最后一次吸尽上清，加入1ml 1640培养液，混匀； 细胞计数：取细胞悬液20微升，加到含有380微升白细胞稀释液的 微升， 细胞计数：取细胞悬液20微升 加到含有380微升白细胞稀释液的 Eppendorf管中 混匀，取适量细胞悬液，加入计数板中。 Eppendorf管中，混匀，取适量细胞悬液，加入计数板中。在显微镜下计 管中， 根据p53公示计算细胞数量 公示计算细胞数量。 数，根据p53公示计算细胞数量。 根据细胞数量，用1640完全培养基配成2×106/ml浓度的细胞悬液。 完全培养基配成2 /ml浓度的细胞悬液 浓度的细胞悬液。 根据细）： 靶细胞的制备（实验员准备）：
取对数生长期YAC- 细胞， Hanks液洗涤 取对数生长期YAC-1细胞， Hanks液洗涤2次，计数， 液洗涤2 计数， 调整至2 调整至2×105/ml。 /ml。
3、细胞毒试验： 细胞毒试验：
实验组 靶细胞 效应细胞 1640培养基 1640培养基 100µ 100µl 100µ 100µl － 靶细胞对照 效应细胞对 组 照组 100µ 100µl － 100µ 100µl － 100µ 100µl 100µ 100µl 空白组 － － 200µ 200µl
实验组OD值 - 效应细胞对照组 值 效应细胞对照组OD值 实验组 值 （1靶细胞对照组OD值 值 靶细胞对照组 ）×100%
4、孵育
二氧化碳培养箱孵育2小时； 二氧化碳培养箱孵育2小时； 加10µl MTT，继续孵育2－3小时。 10µ MTT，继续孵育2 小时。
5、测OD值 OD值
弃上清，加150µl 二甲亚砜，振荡10min，测OD值。 弃上清， 150µ 二甲亚砜，振荡10min， OD值
6、结果分析
NK细胞活性（%）= 细胞活性（ ） 细胞活性
原理： 原理：
活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶使外源性黄色的MTT还原 活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶使外源性黄色的MTT还原 成蓝紫色的Formazan结晶，并沉积在细胞里。 成蓝紫色的Formazan结晶，并沉积在细胞里。而死细胞 结晶 无此功能。
1、小鼠脾细胞悬液的制备： 小鼠脾细胞悬液的制备：
实验四
NK细胞活性测定（MTT比色法） NK细胞活性测定（MTT比色法 比色法） 细胞活性测定
脾脏是重要的免疫器官，内含T细胞、B细胞、NK细胞及 脾脏是重要的免疫器官，内含T细胞、 细胞、NK细胞及 巨噬细胞等多种免疫细胞。 巨噬细胞等多种免疫细胞。 NK细胞在杀伤靶细胞时既不需要特异性抗体参与， NK细胞在杀伤靶细胞时既不需要特异性抗体参与，也不 细胞在杀伤靶细胞时既不需要特异性抗体参与 需要抗原预先致敏的淋巴细胞。在抗肿瘤和抗感染免疫中 需要抗原预先致敏的淋巴细胞。 发挥重要作用。 发挥重要作用。