免疫细胞分离及NK活性测定
免疫细胞功能的测定(精)
B细胞产生抗体能力的测定
丝裂原诱导多克隆抗体产生能力的测定
应用实践
1. 用于确定B细胞活化和分化的信号转导机制，以 及细胞因子和其它银子对B细胞分化的影响。 2. 因为B2细胞产生抗原需要T细胞辅助，所以又可 以用于检测T细胞的辅助功能。 3. 临床上用于研究免疫缺陷病和自身免疫病患者B 细胞分化异常的机制。
B细胞产生抗体能力的测定
丝裂原诱导多克隆抗体产生能力的测定
基础理论
人B细胞具有PWM受体，在体外受到PWM刺激 时，发生多克隆激活，产生多克隆抗体。B细胞 产生抗体的能力可以用ELISA测定培养上清中抗 体的量估计，也可以用ELISPOT方法测定产生抗 体的B细胞数量估计。
B细胞产生抗体能力的测定
B细胞产生抗体能力的测定
基础理论
B细胞受到多克隆激活剂或特异性抗原刺激后， 活化、增殖，最后分化成为浆细胞，产生抗体。 抗体可以在血浆和其他体液中检出，检测抗体是 测定B细胞功能的最重要的方法。 B细胞分类：B1细胞和B2细胞。两者发生学不同、 接受刺激的抗原不同，对T细胞的依赖性不同。 由于B2细胞对抗原的应答依赖T细胞，所以， B细胞产生抗体能力的低下，其缺陷也可能起源 于T细胞缺陷。
B细胞产生抗体能力的测定
ELISA测定各类免疫球蛋白
基础理论
B细胞受抗原刺激后，最初产生IgM抗体，然 后在Th细胞产生的各种细胞因子的作用下，可转 类成为IgG、IgA、IgE类抗体。应用不同的单抗， 结合ELISA方法，可以测定B细胞产生的抗体的类 别。
B细胞产生抗体能力的测定
ELISA测定各类免疫球蛋白
T细胞增殖功能测定
抗原诱导的特异性增殖反应
应用实践
1. 丝裂原诱导的增殖反应 临床上用于评估T细胞对多克隆刺激剂的增殖 能力，反映T细胞基本免疫功能，即T细胞群总体 的信息，不能反映个别T细胞克隆的情况 PHA常用于测试人T细胞增殖能力，Con A常 用于测试小鼠T细胞增殖能力。
nk细胞检验标准
nk细胞检验标准NK细胞检验标准NK细胞是一种重要的免疫细胞，它能够识别并杀死病毒感染的细胞和癌细胞。
因此，检测NK细胞的数量和功能状态对于诊断和治疗某些疾病具有重要意义。
下面将介绍NK细胞检验的标准。
1. NK细胞数量检测NK细胞数量检测是通过流式细胞术或细胞计数器进行的。
正常人的NK细胞占外周血淋巴细胞的10%至15%。
如果NK细胞数量低于正常范围，可能表明免疫功能受损，需要进一步检查。
2. NK细胞功能检测NK细胞功能检测是通过测量NK细胞的杀伤活性来进行的。
常用的方法是使用靶细胞，如K562细胞，来评估NK细胞的杀伤能力。
正常人的NK细胞杀伤活性应该在10%至50%之间。
如果NK细胞杀伤活性低于正常范围，可能表明免疫功能受损，需要进一步检查。
3. NK细胞表面标志物检测NK细胞表面标志物检测是通过检测NK细胞表面的分子来评估NK 细胞的功能状态。
常用的标志物包括CD56、CD16、NKG2D等。
正常人的NK细胞应该表达这些标志物。
如果NK细胞表面标志物异常，可能表明免疫功能受损，需要进一步检查。
4. NK细胞基因检测NK细胞基因检测是通过检测与NK细胞功能相关的基因来评估NK 细胞的功能状态。
常用的基因包括KIR、NKG2A等。
正常人的NK 细胞应该表达这些基因。
如果NK细胞基因异常，可能表明免疫功能受损，需要进一步检查。
NK细胞检验是评估免疫功能的重要方法之一。
通过检测NK细胞数量、功能、表面标志物和基因等指标，可以帮助医生诊断和治疗某些疾病，如感染、肿瘤等。
因此，对于需要进行免疫功能检查的患者，建议进行NK细胞检验。
免疫学检测技术及应用
划痕法
细胞因子的检测技术
一、 生物学检测技术 二、 免疫学检测技术 三、分子生物学检测技术
依赖细胞株测定法 ELISA法
分子杂交、PCR 等检测mRNA
细胞因子检测的特点
• 样品含量低 •样品具有时效性 •生物效应特异性差
Figure 14-12
细胞因子的功能
Cell activation
／immunogold staining)
（一）免疫荧光技术(又称荧光抗体技术) 原理：用荧光素(如异硫氰酸荧光素、罗
丹明B200等) 标记抗体(荧光抗体)，用荧光 抗体浸染细胞或组织切片，抗原与荧光抗体 结合，于荧光显微镜下观察荧光，确定被检 抗原的存在。
免疫荧光技术包括：
直接法
间接法
间接补体增强法
ELISA法： 直接法 间接法 双抗体夹心法(双位点法) 竞争法
ELISA
(三) 同位素标记技术(isotope-labelling technique) 放射免疫分析(radioimmunoassay,
RIA) 是一种用放射性同位素分析抗原抗体反应 相结合方法。 优点：灵敏度高, 可检测0.001pg／mL
Direct and indirect immunofluorescence staining of membrane antigen (mAg).
（二）免疫酶技术(immunoenzymatic techniques)
是将抗原抗体反应与酶催化底物的作用 相结合的一种方法。
主要有两种类型： 1.免疫酶染色 2.酶免疫测定（enzyme immunoassay, EIA）
•3H-胸腺嘧啶核苷参入法（3H-TdR）: 间接观察DNA 合成含量。灵敏度高，具有放射性。 •四甲基偶氮唑盐法（MTT）: MTT商品名为噻唑蓝。 原理：活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶可将外源性 MTT还原成蓝紫色结晶-甲瓒（formazan）, DMSO使 其溶解，酶标分析仪检测。简便，灵敏度高，稳定性 差。
临床免疫学检验-第十三章细胞免疫学技术
Ficoll分离法
聚蔗糖-泛影葡胺分层液的制备
6%聚蔗糖溶液 (Ficoll溶液)密度1.020
34%泛影葡胺溶液 (Hypaque溶液)密度1.2
酸性磷酸酶测定 非特异性酶的测定
巨噬细胞功能检测
炭粒廓清试验
正常小鼠肝中枯否细胞可吞噬清除90% 炭粒，脾巨噬细胞约吞噬清除10%炭粒。据 此给小鼠定量静脉注射印度墨汁(炭粒悬液)， 间隔一定时间反复取静脉血，测定血中炭粒 的浓度，根据血流中炭粒被廓清的速度，判 断巨噬细胞的功能。
吞噬功能检测
鸡RBC
l液 密度1.135
细胞混悬液
高速离心 密
度
6小时
梯 度
低速离心 密 度 梯 度
死细胞残片和血小板 富含单核细胞的组分
富含淋巴细胞的组分 红细胞与粒细胞组分
淋巴细胞亚群的分离
T细胞和B细胞的分离
E花环分离法 尼龙棉分离法
E花环分离法
E受体
T
SRBC
B
E花环 T
离心
B
E花环
聚蔗糖-泛影
形成溶血空斑
可以检测致敏红细胞的各种抗原所对应的抗体,临 床应用比较广泛
反向空斑形成试验
反应物: 琼脂凝胶
SPA致敏的SRBC B细胞 补体 抗Ig抗体
形成溶血空斑
体外检测人类Ig分泌细胞的方法,与抗体的特异性 无关
酶联免疫斑点法
反应物:
包被在固相载体上的抗原 B细胞 酶标二抗
加底物显色
计数斑点形成细胞
乳腺癌患者T淋巴细胞免疫功能及NK活性检测分析
乳腺癌患者T淋巴细胞免疫功能及NK活性检测分析
齐红;单征;于宏波
【期刊名称】《中国实验诊断学》
【年(卷),期】2007(011)001
【摘要】目的本实验旨在比较乳腺癌患者细胞免疫功能与正常人群的差异,以了解细胞免疫功能对肿瘤患者治疗及预后的影响.方法对35例乳腺癌患者外周血T淋巴细胞及NK活性进行检测,并测定了部分患者T淋巴细胞亚群变化,比较其与正常人群对照组的差别.结果肿瘤患者二项指标均低于正常对照组,CD3、CD4阳性细胞数减少,CD8+数增加,Th/Ts比例下降或倒置.结论肿瘤患者均存在不同程度的免疫抑制或功能缺陷.
【总页数】2页(P51-52)
【作者】齐红;单征;于宏波
【作者单位】吉林省肿瘤防治研究所,吉林,长春,130012;吉林省肿瘤防治研究所,吉林,长春,130012;吉林省中医院
【正文语种】中文
【中图分类】R73
【相关文献】
1.新辅助化疗对局部进展期乳腺癌患者T淋巴细胞亚群及NK细胞免疫功能的影响[J], 白海亚;马秀芬
2.31例乳腺癌患者外周血T淋巴细胞及NK活性检测分析 [J], 齐红;单征;刘玉侠;
王英丽;张耿月
3.新辅助化疗对局部进展期乳腺癌患者近期疗效及T淋巴细胞免疫功能的影响 [J], 卢曼曼;叶松;冯其柱;杨怀成;王琦;李怀玉
4.54例老年COPD患者红细胞免疫功能与T淋巴细胞亚群检测分析 [J], 赵湘;张锦铭
5.老年人红细胞免疫功能及T淋巴细胞亚群检测分析 [J], 王中东;黄麦华;李忠培因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
免疫系统检查项目
免疫系统检查项目第一篇：免疫系统检查项目免疫系统是人体防御外来病原体的重要系统，它的健康与否关系到人体的免疫力，免疫力高，则对疾病的抵御能力增强；反之，免疫力低，则容易受到各种疾病的侵袭。
因此，免疫系统的检查十分重要，可以帮助我们及早发现免疫不良，及早预防、治疗疾病。
1. T细胞子集检查T细胞是免疫系统的一种重要细胞，可以帮助人体识别外来的病原体，并进行攻击。
在T细胞中，CD4+和CD8+细胞是两个重要的子集，它们的相对比例可以反映人体免疫状态。
T细胞子集检查通常采用流式细胞术，可以对血液样本中的T细胞进行分离、筛选和鉴定，从而了解CD4+和CD8+细胞的相对比例、功能以及活力等方面的信息。
2. NK细胞活性检查自然杀伤（NK）细胞是一种特殊的淋巴细胞，具有强烈的杀菌、抗病毒和抗肿瘤作用，是人体免疫系统的重要组成部分。
NK细胞活性检查可以测量NK细胞的活力，判断人体免疫系统的抗病能力。
NK细胞活性检查通常采用靶细胞溶解实验或细胞流式术等方法，通过测量NK细胞对靶细胞的溶解作用来评估NK细胞活性。
3. 免疫球蛋白检查免疫球蛋白是人体免疫系统的重要成分，具有抗体形成和免疫应答等功能。
在临床上，可以通过检测血液中的不同种类免疫球蛋白的水平来评估免疫系统的功能状态。
免疫球蛋白检查可以通过血清免疫电泳、放射免疫测定和酶联免疫吸附试验等方法来进行。
4. 淋巴细胞亚群检查淋巴细胞是免疫系统的重要成分，包括B细胞、T细胞和NK细胞等，它们在免疫应答中起着不同的作用。
淋巴细胞亚群检查可以评估血液中的淋巴细胞比例和功能，反映免疫系统的整体状态。
淋巴细胞亚群检查通常采用流式细胞术和细胞荧光染色等方法，可以对不同亚群淋巴细胞进行鉴定和分离，从而评估免疫系统的功能状态。
5. 细胞因子检测细胞因子是免疫系统中的重要信号分子，可以调节细胞增殖、分化和功能，发挥抗炎、抗肿瘤等重要生物学活性。
细胞因子检测可以评估免疫系统中不同细胞因子的水平变化，反映细胞因子的稳态和免疫系统的功能状态。
nk细胞标准
nk细胞标准【NK细胞标准】一、定义自然杀伤(NK)细胞是一种具备杀伤能力的淋巴细胞，无需特异性抗原识别即可杀伤多种肿瘤细胞和感染细胞。
二、特点1. 膜表型：CD56+CD3-，无T细胞受体(TCR)。
2. 杀伤方式：NK细胞通过分泌细胞毒素(granzyme、perforin)和靶细胞表面受体的结合来实现杀伤作用。
3. 不依赖免疫记忆：NK细胞杀伤作用不需预先暴露于特定抗原，无需免疫记忆，故对新出现的肿瘤细胞和感染细胞也具有杀伤能力。
三、活化机制NK细胞的活化取决于抑制性和激活性受体的动态平衡。
当激活性受体的信号占优势时，NK细胞活化；当抑制性受体的信号占优势时，NK细胞被抑制。
这一平衡有赖于激活性受体和抑制性受体与靶细胞上的配体结合，从而决定NK细胞的活性。
四、标准化由于NK细胞具有杀伤特性，临床上可应用于免疫治疗。
为确保治疗效果的稳定性和可比性，对NK细胞的标准化十分重要。
1. NK细胞来源a. 供体：供体来源包括外周血、骨髓、胎盘和胎儿脐血等。
b. 细胞分离：采集后需通过梯度离心法或免疫磁珠法分离出单个NK细胞。
2. NK细胞培养a. 培养基：含有足够的营养物质和生长因子的培养基。
b. 杂交细胞株的辅助：杂交细胞株可作为辅助细胞提供必要的细胞因子。
3. 活化a. 细胞因子：外源性细胞因子（如白细胞介素2、白细胞介素12）可用于活化和扩增NK细胞。
b. 共刺激信号：尽可能提供足够的共刺激信号（如来源于杂交细胞的共刺激分子）。
4. 扩增a. 细胞密度：培养基中的细胞密度需适中，过低或过高都会影响细胞增殖。
b. 培养时间：培养时间应掌握在能够获得足够数量NK细胞的情况下，避免过度扩增导致细胞老化。
5. 质量控制a. 活性检测：NK细胞的活性需通过诸如CD107a脱颗粒实验、IFN-γ释放试验等进行测定。
b. 纯度检测：明确NK细胞的比例以及其他杂质细胞的数量，如CD3+ T细胞。
c. 活存检测：检测细胞的活存状态，确保细胞存活率和功能稳定。
nk细胞提取及培养方法
nk细胞提取及培养方法以nk细胞提取及培养方法为标题，本文将介绍NK细胞的提取和培养方法。
NK细胞（Natural Killer cell）是一种重要的免疫细胞，具有杀伤肿瘤细胞和感染病原体的能力。
NK细胞的提取和培养是进行相关研究和应用的前提，下面将详细介绍相关步骤。
一、NK细胞的提取方法1. 从外周血中提取：外周血中富含NK细胞，因此是提取NK细胞的常用来源。
首先，收集供体的外周血样本，并进行离心，分离出白细胞。
然后，使用比重梯度离心法，将白细胞层分离出来。
最后，使用磁珠或流式细胞术等方法，选择性地富集NK细胞。
2. 从脐带血中提取：脐带血中的NK细胞数量相对较多，因此也是提取NK细胞的常用来源。
提取方法与外周血类似，首先收集脐带血样本，并进行离心，分离出白细胞。
然后，使用比重梯度离心法，将白细胞层分离出来。
最后，使用磁珠或流式细胞术等方法，选择性地富集NK细胞。
二、NK细胞的培养方法1. 培养基的准备：选择适合NK细胞生长的培养基，如RPMI 1640培养基。
将培养基加热至37摄氏度，并加入适量的胎牛血清、抗生素和生长因子等。
2. 细胞的接种和培养：将提取到的NK细胞接种在含有培养基的培养皿中。
细胞密度一般为1-2×10^6个/ml。
将培养皿放入培养箱中，保持37摄氏度和5%二氧化碳的恒定环境。
每2-3天更换新的培养基，以保持细胞的正常生长。
3. 细胞的扩增：为了获得足够数量的NK细胞，可以进行细胞的扩增培养。
在细胞密度达到80%左右时，将细胞进行传代，即将细胞从原来的培养皿中移至新的培养皿中，继续进行培养。
每次传代时，可根据需要调整细胞的密度和培养时间。
4. 细胞的活化：为了增强NK细胞的杀伤能力，可以进行细胞的活化处理。
常用的活化方法包括使用细胞因子（如IL-2、IL-15等）刺激细胞，或使用特定的抗体与细胞表面的激活受体结合。
活化后的NK细胞可以更好地发挥其免疫功能。
三、NK细胞的质量控制1. 细胞形态观察：在培养过程中，定期观察NK细胞的形态变化，如细胞的形状、大小、颜色等。
免疫细胞分离及检测技术
第十三章免疫细胞分离及检测技术本章考点1.免疫细胞的分离2.淋巴细胞表面标志的检测3.淋巴细胞功能检测技术4.免疫细胞检测的临床意义第一节免疫细胞的分离一、外周血单个核细胞的分离1.原理：外周血中单个核细胞（淋巴细胞和单核细胞）的比重与红细胞、多核白细胞及血小板不同，介于1.075～1.090之间，红细胞及粒细胞在1.092左右，血小板在1.030～1.035之间。
因而可利用一种比重介于1.075～1.092之间，而近于等渗的溶液作密度梯度离心，使一定比重的细胞按相应密度梯度分布而加以分离。
2.试剂：常用的分层液有Ficoll与Percoll两种（1）Ficoll分层液法：主要用于分离外周血中单个核细胞，是一种单次密度梯度离心分离法，其分布由上到下依次为：稀释的血浆层，单个核细胞层，粒细胞层和红细胞层。
Ficoll分层液即聚蔗糖-泛影葡胺，是一种较理想的细胞分层液，其主要成分是一种合成的蔗糖聚合物，具有高密度、低渗透压、无毒性的特点。
操作时，将分层液置于试管下层，然后将肝素化的全血或白细胞悬液以Hanks或PBS液稀释后，轻轻铺于分层液面上，经2000rpm15-20min离心后，红细胞与粒细胞因比重大于分层液，故较快沉于管底。
血小板则比重小于分层液而悬浮于血浆中。
唯有与分层液比重相当的单核细胞和淋巴细胞密集于血浆层和分层液的界面中。
其分布由上到下依次为：稀释的血浆层，单个核细胞层，粒细胞层和红细胞层。
见下图。
图聚蔗糖-泛影葡胺分层液密度梯度离心法外周血小分布示意图引自陶义训主编：免疫学和免疫学检验，人民卫生出版社1995年9月第1版第4次印刷（2）Percoll分层液法：是一种连续密度梯度离心分离法，其分布由上至下依次为：死细胞层，富含单核细胞组分层，富含淋巴细胞的组分层及红细胞与粒细胞组分层。
图连续密度梯度离心法分离单个核细胞中各细胞成分的分布示意图引自陶义训主编：免疫学和免疫学检验，人民卫生出版社1995年9月第1版第4次印刷二、淋巴细胞的分离1.纯淋巴细胞群的采集：利用单核细胞在37℃和Ca2+存在时，能主动粘附在玻璃、塑料、尼龙毛、棉花纤维或葡聚糖凝胶的特性，从单个核细胞悬液中除去单核细胞，从而获得纯淋巴细胞群。
免疫细胞功能检测技术
免疫细胞功能检测技术疫细胞是指参与机体免疫应答的细胞，大致可分为两类，一类能识别特异性抗原，一旦被激活则显示出特异性应答的功能，主要指淋巴细胞群，包括T细胞、B细胞、NK细胞、K细胞等；另一类能捕获抗原，处理抗原，以一定方式提呈给淋巴细胞或表现其他免疫功能，包括中性粒细胞、巨噬细胞、树突状细胞等。
淋巴细胞的功能检测淋巴细胞功能测定可分为体内试验和体外试验。
体内试验主要是进行迟发型超敏反应；体外试验主要包括淋巴细胞对抗原或有丝分裂原刺激后的增殖反应、细胞毒性试验及淋巴细胞分泌产物的测定。
一、T细胞功能检测T细胞具有多种免疫生物学功能，如直接杀伤靶细胞、辅助或抑制B细胞产生抗体，对特异性抗原或丝裂原刺激产生增殖反应及产生各种细胞因子。
T细胞增殖试验体外刺激T细胞增殖反应的刺激物包括植物血凝素（PHA）、刀豆素A（ConA）和美洲商陆（PWM）、白喉类毒素、破伤风类毒素、纯化蛋白衍生物（PPD）和白色念珠菌等。
非特异性增殖-丝裂原：PHA、ConA、PWM特异性增殖-抗原：破伤风类毒素、PPD、白色念珠菌T细胞增殖试验形态学检查法：形态学方法简便易行，普通光学显微镜便能观察结果，适于基层实验室应用。
缺点是依靠肉眼观察形态学变化，判断结果易受主观因素影响，重复性和准确性较差。
3H-TdR掺入法（最标准）：3H-TdR掺入法敏感性高，客观性强，重复性好，但需一定设备条件，同时还存在放射性核素污染问题。
MTT比色法（最常用）：本方法的敏感性虽不及3H-TdR掺入法，但操作简便，无放射性污染。
T细胞分泌功能测定体外培养的T细胞经各种丝裂原或抗原刺激后，分泌各种细胞因子，可借助免疫学、细胞生物学及分子生物学技术分别检测细胞因子的含量、生物学活性和基因表达水平，以反映T细胞功能。
T细胞介导的细胞毒试验T细胞介导的细胞毒试验时细胞毒性T细胞（CTL）的特征，凡致敏T细胞再次遇相应白细胞抗原，可表现出破坏和溶解包细胞，他使评价机体细胞免疫水平的一种常用指标。
nk细胞检测方法
nk细胞检测方法NK细胞检测方法引言：自然杀伤细胞（Natural Killer cell，NK cell）是一类重要的免疫细胞，具有杀伤肿瘤细胞和感染细胞的能力。
NK细胞检测方法是一种重要的检测手段，可以帮助医生评估患者免疫功能，及时发现异常情况并采取有效的治疗措施。
本文将详细介绍NK细胞检测的常用方法及其原理。
一、流式细胞术流式细胞术（Flow cytometry）是一种常用的NK细胞检测方法。
它通过单细胞悬浮液中细胞表面或细胞内的特定标记物进行定量分析和定性鉴定。
在NK细胞检测中，可以将特定的抗体与细胞表面的CD56和CD16等标记结合，然后通过流式细胞术进行检测和分析。
利用流式细胞仪可以精确计算NK细胞的数量，并评估其功能状态。
二、酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）是一种常用的免疫学检测方法，也可以用于NK细胞检测。
ELISA方法可以通过特异性抗体与待测样品中的NK细胞结合，然后通过酶标记二抗的作用，产生荧光或颜色反应，从而定量测定NK细胞的含量。
ELISA方法具有灵敏度高、操作简便等优点，被广泛应用于NK细胞的检测与研究。
三、实时荧光定量PCR实时荧光定量聚合酶链反应（Real-Time Quantitative Polymerase Chain Reaction，qRT-PCR）是一种高灵敏度、高特异性的核酸检测方法，也可以用于NK细胞的检测。
通过选择特异性引物和探针，可以在样品中扩增和定量检测NK细胞特定基因的表达水平。
实时荧光定量PCR方法具有高灵敏度、高准确性和高通量的特点，被广泛用于NK细胞的鉴定和研究。
四、细胞毒性测定细胞毒性测定是一种常用的NK细胞功能检测方法。
该方法通过将待测NK细胞与靶细胞共同培养，观察和测定NK细胞对靶细胞的杀伤作用。
常用的细胞毒性测定包括荧光素钠酸盐释放试验（Lactate Dehydrogenase Release Assay，LDH）和Cr^51释放试验。
NK细胞活性检测的原理及应用
NK细胞活性检测的原理及应用引言自然杀伤细胞（NK细胞）作为一种重要的免疫细胞，在机体的免疫防御中扮演着重要的角色。
NK细胞不仅可以杀死肿瘤细胞和感染病原体的细胞，还可以调节和激活其他免疫细胞的功能。
因此，研究NK细胞的活性对于预防和治疗肿瘤、感染疾病等免疫相关疾病具有重要的意义。
本文将详细介绍NK细胞活性检测的原理及其在临床和科研中的应用。
原理NK细胞的活性可以通过多种方法进行检测，其中最常用的方法是使用细胞毒性检测。
细胞毒性检测主要分为两种方法：靶细胞直接杀伤法和溶血/变性法。
靶细胞直接杀伤法靶细胞直接杀伤法是通过将靶细胞与NK细胞一起培养，观察并计算靶细胞的存活率来评估NK细胞的活性。
具体步骤如下： 1. 将靶细胞和NK细胞分别培养在细胞培养基中。
2. 将培养好的NK细胞与靶细胞按照不同的比例混合。
3. 经过一定时间的培养后，观察并计算靶细胞的存活率，即可评估NK细胞的杀伤活性。
溶血/变性法溶血/变性法是通过观察和测量NK细胞对溶血红细胞的溶血能力来评估NK细胞的活性。
具体步骤如下： 1. 准备一定浓度的溶血红细胞悬液。
2. 将溶血红细胞悬液与NK细胞按照不同的比例混合。
3. 经过一定时间的孵育，离心沉淀红细胞。
4. 通过测量上清液的吸光度来计算溶血率，即可评估NK细胞的杀伤活性。
应用NK细胞活性检测在临床和科研中都具有广泛的应用。
临床应用在临床中，检测患者的NK细胞活性可以帮助医生评估患者的免疫状态和疾病进展情况，从而制定更合理的治疗方案。
常见的临床应用包括： - 评估抗肿瘤免疫治疗的疗效：通过监测患者的NK细胞活性，可以评估抗肿瘤免疫治疗的疗效，指导治疗方案的调整。
- 检测传染病的免疫性：通过检测患者的NK细胞活性，可以评估患者对于传染病的免疫性，指导预防和治疗。
- 评估移植排斥反应：通过监测移植患者的NK细胞活性，可以评估移植排斥反应的发生和程度，指导治疗和预防。
科研应用在科研领域，NK细胞活性检测可以帮助研究人员深入了解NK细胞的免疫功能和机制，从而为免疫治疗的研发提供理论依据和实验数据。
免疫学实验 ——淋巴细胞分离计数及活性
淋巴细胞的分离
实验原理：
根据各类血细胞的比重不同，采用分层液提取淋巴细胞。PBMC （外周血单个核细胞）与血液中的其它成分存在密度差异，利用密 度在1.077 ± 0.001g/L之间而且近于等渗的淋巴细胞分层液作密度 梯 度离心，离心时，各种血液成分按密度梯度重新分布聚集，血浆和 血小板由于密度较低分布于分层液上部，红细胞和粒细胞由于密度 较大分布于分层液底部，PBMC密度稍低于分层液，故位于分层液层 面上，这样就可以分离得到PBMC了。
小鼠六只，用FITC标记的抗CD69抗体，抗CD3抗体， 流式细胞仪，抗Fc受体抗体，FACS缓冲液，仪器缓冲 液，FACS清洁剂，FACS洗净剂
操作步骤：
1.提取纯的淋巴细胞:将小鼠随机分为A、B、C三组，每组两只，给A组注射该 产品和抗CD3抗体，B组只注射抗CD3抗体，C组不注射任何试剂。然后在相同
6.此时可见液体分为四层，最下层是红细胞和粒细胞，分离液在它 的上层，最上层是血浆层，淋巴细胞在血浆层和分离液之间。
7.将淋巴细胞放入含有Hanks液5ml的E、F的两只试管中，充 分混匀，1000转/分离心10分钟，弃去上清液，即获得纯淋巴 细胞 8.比较E、F两只试管中淋巴细胞的体积，若E、F两只试管中体积 相同，则没有免疫增强作用;若E试管中体积小于F试管中的体积， 则说明该产品确有免疫增强作用。
免疫细胞功能的测定
免疫细胞功能的测定
第26页
ELISPOT法
B细胞产生抗体能力测定
技术方法
1. 抗原包被: 37C°2h，或4C°过夜。固相载 体可用聚苯乙烯平皿、亚硝酸纤维膜、96 孔板。
2. 抗体生成细胞培育: 加入适量抗体生成细胞， 37C°，5％CO2，3～4h，或过夜。洗涤， 去除为与固相结合细胞。
3. 测定斑点产生细胞: 加二抗， 37C°，5％ CO2，2～3h。加辣根过氧化物酶或碱性磷 酸酶和底物显色。
免疫细胞功能的测定
免疫细胞功能的测定
第1页
免疫细胞功效测定
T细胞增殖功效测定
基础理论
本技术用于评定T细胞对各种刺激增殖能力。T 细胞增殖能力是反应T细胞功效一个主要指标。
免疫细胞功能的测定
第2页
T细胞功效测定
刺激T细胞增殖原因及意义 1. 特异性抗原: 引发寡克隆活化增殖。 克用于判断抗原免疫效果（疫苗接种）和回 想反应能力，也能反应T细胞总体功效。 2. 丝裂原: 多克隆。 3. 刺激信号转导分子: 多克隆。
免疫细胞功能的测定
第29页
B细胞产生抗体能力测定
ELISA测定各类免疫球蛋白
方法
1. 包板: 96孔板用浓度为10µg/ml特异性单抗 包被。盖上盖板，37C°，5％CO2，2h， 或4C°过夜。常规洗板，封闭。
2. 上样: 每孔内加入1:10或1:20 稀释细胞培养 上清液100µl。阳性对照为标准品，阴性对 照为培养液。每试验设2复本。室温培育2h， 或4C°过夜。
2. 培养液中添加血清: 有些血清可能激活或抑 制细胞增殖。如欲测定人体细胞增殖能力， 可采取灭活AB血清。
3. 细胞培养板类型: 依据细胞数量采取不一样 形状底部培养板。
NK细胞活性测定
（5）吸上清过120目或200目滤网，滤液滤入试管；
（6）滤液1500转/min离心5min，倒去上清；
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（7）脾细胞沉淀用Hanks液洗2次（加入3ml Hanks液，混匀，1500r/min，离心5min，倒去 上清；重复上述步骤1次）； （8）用1ml 1640培养液溶解脾细胞沉淀，混匀， 配成脾细胞悬液（原液），计数（吸取20ul加入 780ul白细胞稀释液中，稀释40倍，用血球计数 板在显微镜下计数，根据P53页公式计算脾细胞 悬液原液中脾细胞浓度）； （9）吸取一定量脾细胞悬液原液，用1640培养 液配制2×106/ml浓度的脾细胞悬液1毫升至2毫 升，待用。 3、细胞毒试验 按表7-3加样，
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4、孵育 二氧化碳培养箱孵育2小时； 加MTT，继续孵育2小时。 5、测OD值 轻轻吸弃上清，加二甲亚砜150ul ， 振荡5min，测OD值。 6、结果分析
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表7-3 MTT法测NK细胞活性试验各组成分(3复孔/组) 实验组 靶细胞 效应细胞 1640培养基 100ul 100ul
——
靶细胞对 照组 100ul
——
效应细胞 对照组
——
空白对照
—— ——
100ul 100ul
100ul
200ul
NK细胞活性（%）= （1实验组OD值 - 效应细胞对照组OD值 靶细胞对照组OD值
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）×100%
NK细胞活性（%）=
实验组OD值 - 效应细胞对照组OD值 （1靶细胞对照组OD值
）×100%
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附：P53细胞计数公式：
细胞浓度（细胞数/ml原液）=
细胞表型检测 nk实验流程
细胞表型检测 nk实验流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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C8.免疫细胞的分离与功能测定
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
㈢ B细胞的分离 1 .负性B细胞分离法 ⑴用密度梯度离心法分离PBMC ⑵用L-亮氨酸甲酯法去除单核细胞、NK细 胞、细胞毒性T细胞 ⑶用花环形成法去除T细胞 用此法分离B细胞，240ml 全血中可得 1×107～2×107个B细胞，纯度﹥90﹪， 2﹪～3﹪的单核细胞，﹤1﹪的其他细胞
注意事项
1 严格无菌操作 2 操作应轻柔，细胞悬液应充分混匀 3 淋巴细胞分层液应4℃避光保存，取出后 待温度升至室温使用 4 如须保存血浆作他用，则不能稀释血液 5 离心最适温度18～20℃ 6 分离组织中的单个核细胞也可采用上法
二 淋巴细胞的纯化
㈠红细胞的去除 1 低渗裂解法 1ml蒸溜水加入沉淀的PBMC中，轻摇 （﹤1min） 立即加入1.8﹪NaCl, 洗涤 2 氯化铵处理法 沉淀的PBMC中加入1ml 0.83﹪氯化铵溶液， 轻摇2 min，洗涤
于白细胞计数板中每孔各计数100个细胞， 记录死 细胞及活细胞数，求出各组NK细胞活性的 均值
实验组靶细胞死亡数－对照组靶细胞死亡数
NK细胞活性%﹦
100
×
100﹪
㈡ 同位素释放法 1 . 51Cr释放试验 2. 125I-UdR释放试验 3. 全血NK细胞活性同位素检测法
七 单核-巨噬细胞的分离与功能测定
靶细胞 人NK细胞 K562细胞（靶细胞） 鼠NK细胞 YAC-1细胞（靶细胞）
㈠ 形态学方法 原理 靶细胞被NK细胞杀伤后细胞膜通透 性改变而使台盼蓝染料透入细胞，细胞呈 蓝色，无折光性
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取对数生长期YAC- 细胞， Hanks液洗涤 取对数生长期YAC-1细胞， Hanks液洗涤2次，计数， 液洗涤2 计数， 调整至2 调整至2×105/ml。 /ml。
3、细胞毒试验： 细胞毒试验：
实验组 靶细胞 效应细胞 1640培养基 1640培养基 100µ 100µl 100µ 100µl － 靶细胞对照 效应细胞对 组 照组 100µ 100µl － 100µ 100µl － 100µ 100µl 100µ 100µl 空白组 － － 200µ 200µl
实验组OD值 - 效应细胞对照组 值 效应细胞对照组OD值 实验组 值 （1靶细胞对照组OD值 值 靶细胞对照组 ）×100%
4、孵育
二氧化碳培养箱孵育2小时； 二氧化碳培养箱孵育2小时； 加10µl MTT，继续孵育2－3小时。 10µ MTT，继续孵育2 小时。
5、测OD值 OD值
弃上清，加150µl 二甲亚砜，振荡10min，测OD值。 弃上清， 150µ 二甲亚砜，振荡10min， OD值
6、结果分析
NK细胞活性（%）= 细胞活性（ ） 细胞活性
原理： 原理：
活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶使外源性黄色的MTT还原 活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶使外源性黄色的MTT还原 成蓝紫色的Formazan结晶，并沉积在细胞里。 成蓝紫色的Formazan结晶，并沉积在细胞里。而死细胞 结晶 无此功能。
1、小鼠脾细胞悬液的制备： 小鼠脾细胞悬液的制备：
实验四
NK细胞活性测定（MTT比色法） NK细胞活性测定（MTT比色法 比色法） 细胞活性测定
脾脏是重要的免疫器官，内含T细胞、B细胞、NK细胞及 脾脏是重要的免疫器官，内含T细胞、 细胞、NK细胞及 巨噬细胞等多种免疫细胞。 巨噬细胞等多种免疫细胞。 NK细胞在杀伤靶细胞时既不需要特异性抗体参与， NK细胞在杀伤靶细胞时既不需要特异性抗体参与，也不 细胞在杀伤靶细胞时既不需要特异性抗体参与 需要抗原预先致敏的淋巴细胞。在抗肿瘤和抗感染免疫中 需要抗原预先致敏的淋巴细胞。 发挥重要作用。 发挥重要作用。