医学-各种免疫细胞的分离与检测的方法对比
合集下载
免疫细胞的分离及检测技术课件
Ficoll分离液---聚蔗糖-泛影葡胺溶液
➢2份6%聚蔗糖蒸馏水溶液+1 份34%泛影葡胺生理盐水溶液， 比重为1.077± 0.002
用1.077±0.001的分层液可将细胞分离
二 、淋巴细胞分离
（去单核细胞）
➢ 贴壁粘附法 ➢ 吸附柱过滤法 ➢ 磁铁吸引法 ➢ Percoll 分离液法
二、B细胞表面标志
➢ SmIg、Fc受体、补体受体、EB病毒受体，部 分CD分子是B细胞的重要表面标志，其中以 SmIg为B细胞所特有，是鉴定B细胞可靠的指 标。
➢ CD19/CD5分子：可将B细胞区分为B1细胞和 B2细胞，B1细胞为CD19和CD5双阳性，而 B2细胞仅为CD19阳性，B2细胞为通常所指的
细胞活力的检测
常用方法是台盼蓝染色法。这种染料不能透过活 细胞正常完整的细胞膜，故活细胞不着色，死 亡细胞的细胞膜通透性增高，可使染料进入细 胞而使细胞着色（蓝色）。
第二节 淋巴细胞标志及亚群分类
常用于鉴定和检测淋巴细胞表面标志 是簇分化抗原（Cluster of differentiation，CD）。
➢ 根据T细胞的免疫效应功能和表面CD分 子表达至少可以分为：辅助性T细胞、细 胞毒性T细胞和调节性T细胞；SmIg为B 细胞所特有，是鉴定B细胞可靠的指标， 以CD5和CD19为标志可将B细胞分为B1 和B2两个亚群；目前多以CD3-、 CD16+、CD56+ 作为NK细胞的典型标 志。
三、NK细胞表面标志
人类NK细胞表面标志主要以 CD16、CD56来认定，临床上将 CD3-CD56+CD16+淋巴细胞认定为 NK细胞。
T细胞及NK细胞
第三节 其他的免疫细胞
抗原提呈类细胞表面标志
免疫细胞分离及检测技术
第十三章免疫细胞分离及检测技术本章考点1.免疫细胞的分离2.淋巴细胞表面标志的检测3.淋巴细胞功能检测技术4.免疫细胞检测的临床意义第一节免疫细胞的分离一、外周血单个核细胞的分离1.原理：外周血中单个核细胞（淋巴细胞和单核细胞）的比重与红细胞、多核白细胞及血小板不同，介于1.075～1.090之间，红细胞及粒细胞在1.092左右，血小板在1.030～1.035之间。
因而可利用一种比重介于1.075～1.092之间，而近于等渗的溶液作密度梯度离心，使一定比重的细胞按相应密度梯度分布而加以分离。
2.试剂：常用的分层液有Ficoll与Percoll两种（1）Ficoll分层液法：主要用于分离外周血中单个核细胞，是一种单次密度梯度离心分离法，其分布由上到下依次为：稀释的血浆层，单个核细胞层，粒细胞层和红细胞层。
Ficoll分层液即聚蔗糖-泛影葡胺，是一种较理想的细胞分层液，其主要成分是一种合成的蔗糖聚合物，具有高密度、低渗透压、无毒性的特点。
操作时，将分层液置于试管下层，然后将肝素化的全血或白细胞悬液以Hanks或PBS液稀释后，轻轻铺于分层液面上，经2000rpm15-20min离心后，红细胞与粒细胞因比重大于分层液，故较快沉于管底。
血小板则比重小于分层液而悬浮于血浆中。
唯有与分层液比重相当的单核细胞和淋巴细胞密集于血浆层和分层液的界面中。
其分布由上到下依次为：稀释的血浆层，单个核细胞层，粒细胞层和红细胞层。
见下图。
图聚蔗糖-泛影葡胺分层液密度梯度离心法外周血小分布示意图引自陶义训主编：免疫学和免疫学检验，人民卫生出版社1995年9月第1版第4次印刷（2）Percoll分层液法：是一种连续密度梯度离心分离法，其分布由上至下依次为：死细胞层，富含单核细胞组分层，富含淋巴细胞的组分层及红细胞与粒细胞组分层。
图连续密度梯度离心法分离单个核细胞中各细胞成分的分布示意图引自陶义训主编：免疫学和免疫学检验，人民卫生出版社1995年9月第1版第4次印刷二、淋巴细胞的分离1.纯淋巴细胞群的采集：利用单核细胞在37℃和Ca2+存在时，能主动粘附在玻璃、塑料、尼龙毛、棉花纤维或葡聚糖凝胶的特性，从单个核细胞悬液中除去单核细胞，从而获得纯淋巴细胞群。
疫细胞的分离和功能检测
➢酶释法
细 胞
➢放射性核素释
溶
放法
解
➢流式细胞术
常用靶细胞: K562细胞株
返回章目录
染色计数 离心取上清 测LDH或AKP
测CPM值
测发光强度
THANK YOU FOR YOUR ATTENTION!
返回总目录
感谢下 载
第十章 免疫细胞的分离和功能检测
吴正吉 副教授 重庆医药高等专科学校医学技术系
目录
1 吞噬细胞的分离和收集 2 外周血单个核细胞的分离和纯化 3 淋巴细胞及其亚群的分离
返回总目录
免疫细胞的分离及检测
免疫细胞的分离 是指将各种参与免疫反应的 细胞从血液或组织中分离出来
※检测：各类免疫细胞及其亚群的数量和功能测定 ※方法：体外法为主 ※目的：判断机体免疫状态 ※意义：探讨疾病的发病机制、发展、预后、疗效
有或无
无
增多、嗜碱 增多、嗜碱
有或无
有或无
有或无
有或无
未转化的淋巴细胞
6～8
不增大、密集 无 无 极少、天青色 无 无
3H-TdR掺入法
原理：
刺激物
外周血（T）G0期 37℃56h
G1期→ S1期
3H-TdR
合成DNA↑
DNA- 3H-TdR
37℃16h
测淋巴细胞内放射量（cpm）
计算SI
判断淋巴细胞转化程度
免疫磁珠分离法
（二）巨噬细胞的分离
☆斑蝥敷贴法分离人巨噬细胞 ☆动物的巨噬细胞直接从腹腔渗出液中获取
（三）中性粒细胞的分离
• 聚合物加速沉降法 可从外周血中分离出白细胞
WBC
• Ficoll分离法 可从白细胞中分离出纯化的中性粒细胞
免疫细胞的分离及检测课件
5
免疫磁珠分离法
6
（二）巨噬细胞的分离
☆斑蝥敷贴法分离人巨噬细胞 ☆动物的巨噬细胞直接从腹腔渗出液中获取
7
（三）中性粒细胞的分离
聚合物加速沉降法 可从外周血中分离出白细胞
WBC
• Ficoll分离法 可从白细胞中分离出纯化的中性粒细胞
血浆
RBC
RBC
(抗凝血)
8
Ficoll-Hypaque密度梯度离心分离中性粒细胞
有或无
无
增多、嗜碱 增多、嗜碱
有或无
有或无
有或无
有或无
未转化的淋巴细胞
6～8
不增大、密集 无 无 极少、天青色 无 无
3H-TdR掺入法
原理:
刺激物
外周血（T）G0期 37℃56h
G1期→ S1期
3H-TdR
合成DNA↑
DNA- 3H-TdR
37℃16h
测淋巴细胞内放射量（cpm） 判断淋巴细胞转化程度
34
淋巴细胞转化的检测方法
形态学检查法 3H-TdR掺入法 MTT比色法
35
形态学检查法
36
未转化和转化淋巴细胞的形态特征
细胞大小(直径 μm) 核大小、染色质 核仁 有丝分裂 胞质、着色 浆内空泡 伪足
37
转化的淋巴细胞
淋巴母细胞
过渡型
12～20
12～16
增大、疏松 增大、疏松
清晰、1～4个 有或无
目录
第一节 吞噬细胞的分离和收集 第二节 外周血单个核细胞的分离和纯化 第三节 淋巴细胞及其亚群的分离
1
免疫细胞的分离及检测
免疫细胞的分离 是指将各种参与免疫反应的 细胞从血液或组织中分离出来
免疫磁珠分离法
6
（二）巨噬细胞的分离
☆斑蝥敷贴法分离人巨噬细胞 ☆动物的巨噬细胞直接从腹腔渗出液中获取
7
（三）中性粒细胞的分离
聚合物加速沉降法 可从外周血中分离出白细胞
WBC
• Ficoll分离法 可从白细胞中分离出纯化的中性粒细胞
血浆
RBC
RBC
(抗凝血)
8
Ficoll-Hypaque密度梯度离心分离中性粒细胞
有或无
无
增多、嗜碱 增多、嗜碱
有或无
有或无
有或无
有或无
未转化的淋巴细胞
6～8
不增大、密集 无 无 极少、天青色 无 无
3H-TdR掺入法
原理:
刺激物
外周血（T）G0期 37℃56h
G1期→ S1期
3H-TdR
合成DNA↑
DNA- 3H-TdR
37℃16h
测淋巴细胞内放射量（cpm） 判断淋巴细胞转化程度
34
淋巴细胞转化的检测方法
形态学检查法 3H-TdR掺入法 MTT比色法
35
形态学检查法
36
未转化和转化淋巴细胞的形态特征
细胞大小(直径 μm) 核大小、染色质 核仁 有丝分裂 胞质、着色 浆内空泡 伪足
37
转化的淋巴细胞
淋巴母细胞
过渡型
12～20
12～16
增大、疏松 增大、疏松
清晰、1～4个 有或无
目录
第一节 吞噬细胞的分离和收集 第二节 外周血单个核细胞的分离和纯化 第三节 淋巴细胞及其亚群的分离
1
免疫细胞的分离及检测
免疫细胞的分离 是指将各种参与免疫反应的 细胞从血液或组织中分离出来
免疫细胞的分离和检测
第一节 中性粒细胞功能的检测 Assays for Polymorphonuclear Function
一、细胞运动功能的检测
（一）体内实验法 （二）体外试验法 二、吞噬和杀菌功能的检测 （一）细胞内杀菌功能的检测
吞噬率 =
吞噬细菌的白细胞数
计数的白细胞数
吞噬细菌总数 计数的白细胞数
X 100%
4. 吞噬细胞的功能检测
第一节 免疫细胞的分离与纯化 Separation and Purification of Immunocyte
• 实验的目的；
• 所需细胞的种类、纯度和数量； • 方法简便可行，尽量保持活性、 纯度和收获率。
一、白细胞的分离
（一）自然沉降法 （二）聚合物加速沉降法
某些高分子聚合物（如明胶、 右旋糖酐、甲基纤维素和聚乙烯吡 咯烷酮等）可使红细胞凝聚成串， 加速红细胞沉降，使之更易与白细 胞分离。
第三节
淋巴细胞功能检测技术
Assays for Lymphocyte
Function
一、T细胞功能检测
（一）T细胞增殖试验
T细胞在体外受有丝分裂原或抗原刺激后，
细胞代谢和形态发生变化，主要表现为胞内蛋白
质和核酸合成增加，发生一系列增殖反应。如细
胞变大、胞质增多、出现空泡、核质疏松、核仁
明显并转化为淋巴母细胞，又称淋巴细胞转化试
密度梯度分离单个核细胞 （Ficoll分层液）
密度梯度分离单个核细胞 （Ficoll分层液）
Percoll (商品名） 经过聚乙烯吡咯烷酮（polyvinyl pyrolidone,PVP)处理的硅胶颗粒大小 不一的混悬液。 高速离心后，形成连续密度梯度， 可将密度不同的细胞分离纯化。分离淋 巴细胞纯度达98% ，单个核细胞纯度达 78% 。流程长、烦琐、费用高。
免疫细胞的分离与检测
2×(上清cpm—本底cpm)
×100%
(上清cpm-本底cpm)＋( 沉淀cpm-本底cpm)
❖ 51Cr 特异释放率（%）
试验释放率—自然释放率 ×100%
最大释放率－自然释放率
41
3、NK细胞活性测定
❖ NK细胞是具有天然杀伤靶细胞活性的淋巴样细胞， 其杀伤作用不需要抗体、补体的参加，所杀伤靶细 胞通常指肿瘤细胞和病毒感染或转化的细胞。这样， 可以将来源于同种动物的肿瘤细胞系或病毒转化的 细胞系，作为检测NK细胞活性的指示细胞。
可溶性MHC-肽四聚体法：mhc-肽四聚体复合物
的原理是通过增强t细胞受体与mhc-肽复合物亲和力，达 到可直接特异性检测t细胞的目的。 作为临床诊断工具，定量检测外周血及组织中抗原特异 性CTLs的比率，并进行表型及功能分析。 用于过继性肿瘤免疫治疗 用于疫苗疗效的监测
17
抗原肽-MHC分子四聚体技术
57
机制 诱因
凋亡
坏死
基因调控的程序化细胞死亡， 意外事故性细胞死亡，被动进行
主动进行（自杀性）
（他杀性）
生理性或轻微病理性刺激因子 病理性刺激因子诱导发生，如缺氧、 诱导发生，如生长因子缺乏 感染、中毒
死亡范围 形态特征 生化特征
周围反应
多为散在的单个细胞
多为聚集的大片细胞
细胞固缩，核染色质边集，细 细胞肿胀，核染色质絮状或边集，
38
（1）原理 ❖ 将靶细胞用51Cr标记后，再与特异性的IgG抗体
结合，加入K细胞后即可发生ADCC效应，引起靶 细胞的溶解并释放51Cr。用计数仪分别检测上清 和细胞沉淀中的cpm，根据上清中释放的51Cr的 多少，可判断K细胞活性的高低。
39
食品免疫学 免疫细胞分离和检测技术
胞受到刺激后增殖、转化，既由静止的T细胞向淋巴母细 胞转化，根据其增殖转化能力评定T细胞功能。
丝裂原 抗原
信号转导 DNA复制 基因转录 蛋白合成
形态改变
丝裂原：Con A, PWM, PHA ，佛波脂(TPA)
刺激物 抗原：结核菌素，纯蛋白衍生物, 细菌毒素
超抗原：金黄色葡萄球菌肠毒素
淋巴细胞转化的检测方法
PHA刺激管cpm 均 刺激指数(SI)= 空值白对照管cpm 均值
2.T细胞分泌的细胞因子检测 ELISA 试剂盒,放免试剂盒
3.51Cr释放实验（检测CTL功能）
原理：用Na251CrO4标记靶细胞（如肿瘤细胞），将CTL与 标记的靶细胞共同孵育，靶细胞被杀伤后， Na251CrO4释 放，检测培养上清液中γ射线的强度，反应CTL的功能。
免疫细胞分离和 功能检测
第一节 免疫细胞分离技术
免疫细胞种类
淋巴细胞 :T细胞 B细胞 NK 细胞
单核-吞噬细胞 (树突细胞) 其他细胞 :中性粒细胞
嗜酸性粒细胞 嗜碱性粒细胞 肥大细胞
淋巴细胞 嗜酸性粒细胞
中性粒细胞 嗜碱性粒细胞
外周血中免疫细胞 单核细胞
红细胞 血小板
一、外周血单个核细胞分离 二、淋巴细胞的分离 三、T细胞和B细胞的分离 四、T细胞亚群的分离
采用聚苯乙烯等高分子材料包裹三氧化二铁等金属铁颗粒 形成微球体，微球体表面与抗原、抗体和核酸等生物大分 子结合后，即成为兼有免疫配基和磁性的免疫磁株。
免疫磁株与细胞结合后可采用以下两种方法分离细胞
①磁力架法 ②流式细胞分选法
➢分离细胞的保存与活力测定
1.分离细胞的保存
对保存液的要求：等渗，具pH 缓冲作用，并对细胞无毒性 （Hanks、Tc-199、RPMI 1640 ）。如需短期保存，置4℃ 放置较好，可减低细胞代谢活动。如需长期保存，应放入液氮 罐中在深低温(-196℃)条件下保存细胞。
丝裂原 抗原
信号转导 DNA复制 基因转录 蛋白合成
形态改变
丝裂原：Con A, PWM, PHA ，佛波脂(TPA)
刺激物 抗原：结核菌素，纯蛋白衍生物, 细菌毒素
超抗原：金黄色葡萄球菌肠毒素
淋巴细胞转化的检测方法
PHA刺激管cpm 均 刺激指数(SI)= 空值白对照管cpm 均值
2.T细胞分泌的细胞因子检测 ELISA 试剂盒,放免试剂盒
3.51Cr释放实验（检测CTL功能）
原理：用Na251CrO4标记靶细胞（如肿瘤细胞），将CTL与 标记的靶细胞共同孵育，靶细胞被杀伤后， Na251CrO4释 放，检测培养上清液中γ射线的强度，反应CTL的功能。
免疫细胞分离和 功能检测
第一节 免疫细胞分离技术
免疫细胞种类
淋巴细胞 :T细胞 B细胞 NK 细胞
单核-吞噬细胞 (树突细胞) 其他细胞 :中性粒细胞
嗜酸性粒细胞 嗜碱性粒细胞 肥大细胞
淋巴细胞 嗜酸性粒细胞
中性粒细胞 嗜碱性粒细胞
外周血中免疫细胞 单核细胞
红细胞 血小板
一、外周血单个核细胞分离 二、淋巴细胞的分离 三、T细胞和B细胞的分离 四、T细胞亚群的分离
采用聚苯乙烯等高分子材料包裹三氧化二铁等金属铁颗粒 形成微球体，微球体表面与抗原、抗体和核酸等生物大分 子结合后，即成为兼有免疫配基和磁性的免疫磁株。
免疫磁株与细胞结合后可采用以下两种方法分离细胞
①磁力架法 ②流式细胞分选法
➢分离细胞的保存与活力测定
1.分离细胞的保存
对保存液的要求：等渗，具pH 缓冲作用，并对细胞无毒性 （Hanks、Tc-199、RPMI 1640 ）。如需短期保存，置4℃ 放置较好，可减低细胞代谢活动。如需长期保存，应放入液氮 罐中在深低温(-196℃)条件下保存细胞。
第十四章免疫细胞的分离与检测
检测免疫细胞的数量和功能，观察机体免疫状态 免疫细胞的细胞生物学研究 免疫细胞的培养和建株
分离免疫细胞的一般原理
物理学和生物学特征 密度大小 表面标志 其它活性：吞噬、黏附等
本章主要内容
1. 免疫细胞的分离与纯化 2. 淋巴细胞的数量检测 3. 淋巴细胞的功能检测 4. 吞噬细胞功能检测
1. mIg的检测: 酶免疫法、荧光免疫法 2. CD抗原检测
酶免疫组织化学法
间接荧光免疫法 流式细胞术 3. 受体检测（FcR、CR…） EA花环 EAC花环 小鼠红细胞花环
EA花环形成试验
＋
＋
B cell
Fc受体
B cell
EAC花环形成试验
＋
B cell
B cell
补体受体
小鼠红细胞受体： 慢性B细胞白血病 方法简单，鉴定类型
全自动细胞分选仪
MACS法
（magnetic activated cell stoter）
N
S
阴性选择
（负选法）
阳性选择 （正选法）
主要组成: MACS微珠 MACS分选柱
MACS分选器
评价
高纯度（95％～99％） 高回收率（90％～95％） 高活性（99％～100％） 效果可与流式细胞仪媲美， 但更经济、省时、简便、快速
T细胞增殖试验
• 形态学法
• 3H-TdR掺入法 • MTT比色法 • CFSE标记染色法
形态学法
PBMC
5％CO2 、 37℃ 培养72h
细胞涂
片染色
PHA/ConA
显微镜检 查
未转化淋巴细胞
转化的淋巴母细胞
转化的淋巴细胞数
转化率（％） ＝
计数的淋巴细胞总数
分离免疫细胞的一般原理
物理学和生物学特征 密度大小 表面标志 其它活性：吞噬、黏附等
本章主要内容
1. 免疫细胞的分离与纯化 2. 淋巴细胞的数量检测 3. 淋巴细胞的功能检测 4. 吞噬细胞功能检测
1. mIg的检测: 酶免疫法、荧光免疫法 2. CD抗原检测
酶免疫组织化学法
间接荧光免疫法 流式细胞术 3. 受体检测（FcR、CR…） EA花环 EAC花环 小鼠红细胞花环
EA花环形成试验
＋
＋
B cell
Fc受体
B cell
EAC花环形成试验
＋
B cell
B cell
补体受体
小鼠红细胞受体： 慢性B细胞白血病 方法简单，鉴定类型
全自动细胞分选仪
MACS法
（magnetic activated cell stoter）
N
S
阴性选择
（负选法）
阳性选择 （正选法）
主要组成: MACS微珠 MACS分选柱
MACS分选器
评价
高纯度（95％～99％） 高回收率（90％～95％） 高活性（99％～100％） 效果可与流式细胞仪媲美， 但更经济、省时、简便、快速
T细胞增殖试验
• 形态学法
• 3H-TdR掺入法 • MTT比色法 • CFSE标记染色法
形态学法
PBMC
5％CO2 、 37℃ 培养72h
细胞涂
片染色
PHA/ConA
显微镜检 查
未转化淋巴细胞
转化的淋巴母细胞
转化的淋巴细胞数
转化率（％） ＝
计数的淋巴细胞总数
免疫细胞分离与免疫细胞功能检测及应用
因此，1972年世界卫生组织正式提出了单 核 吞 噬 细 胞 系 统 的 概 念 （ mononuelear phagocyte system，MPS）。它指出：该系统 是指分散在许多器官和组织中的一些形状不同、 名称各异、但都来源于骨髓的单核细胞，且具 有吞噬能力和活体染色反应的一类细胞。
中性粒细胞虽有吞噬能力，但无活体染色反 应，更非由单核细胞转变而来，故不属此系统。
（连续密度梯度离心）
1. 贴壁黏附法
将已制备的单个核细胞悬液倾于玻璃或 塑料平皿或扁平小瓶中，移至37℃温箱静置 1h左右，单核细胞和粒细胞均贴于平皿壁上， 而未贴壁的非粘附细胞几乎为纯淋巴细胞， 继用橡皮刮下贴壁的细胞即为纯单核细胞群。 因B细胞也有贴壁现象，用本法分离的淋巴 细胞群中B细胞有所损失。
存在于几乎所有的次级淋巴组织， 包括脾脏、淋巴结、扁桃体和肠道的 Peyer’s结节，位于B细胞区（淋巴结 浅皮质滤泡内生发中心或脾白髓淋巴 小结） 能有效地捕捉复合物形式的抗原，将抗原长期保留 在细胞表面并能保持其免疫原性，避免其在体内降 解并维持次级滤泡的记忆功能；FDC能将抗原结合 到B细胞上，经B细胞加工处理后提呈给Th，启动再 次免疫应答。
一般认为单核吞噬细胞系统的成员有如下几种细胞：
骨髓：多能干细胞→单核母细胞→前单核细胞
↓
骨髓和血液：
单核细胞（血液）
各种组织：组织细胞（结缔组织）
枯否氏细胞（肝）
尘细胞（肺）
巨噬细胞（淋巴结、脾、骨髓）
破骨细胞（骨组织）
小胶质细胞（神经组织）
郎格罕细胞（皮肤）
单核吞噬细胞系统功能： 1、吞噬清除 2、参与免疫应答 3、分泌功能
并指状树突状细胞IDC
IDC位于淋巴组织T细胞区
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
人类血液有形成分的平均密度与直径
密度
直径（）
血小板 淋巴细胞 粒细胞 红细胞
1.04—1.06 1.06—1.08 1.08—1.09 1.09—1.10
8—10 13 7.5
黏附分离法
尼龙毛法 贴壁法 亲和板法 吸附柱法
样品
流体护套
喷嘴 偏转板
接物镜
透镜
滤光片
荧光检测器
激光束
细胞收集管
荧光激活分离法（FACS）
方法：提取总DNA DNA凝胶电泳 观察DNA ladder现象
原位末端标记法（TUNEL）
原理：利用标记的dUTP，在TdT作用 下结合DNA断片的3’末端羟基， 显示断链DNA，提示凋亡
方法：制备组织切片 标记物结合 标记物显色 镜检
二苯胺分光光度法
原理：细胞凋亡可产生低分子量DNA，通过 超速离心可与细胞核的高分子量DNA分离， 分别测定两种DNA，即可得出凋亡百分率。 方法：裂解细胞
细胞凋亡的检测方法
1、形态观察法 2、生化检测法 3、流式细胞仪检测法
形态观察法
普通光镜检测——HE染色 甲基绿-派诺宁染色
荧光显微镜检测——溴化丙锭染色
透射电镜检测——典型形态改变
生化检测法
凝胶电泳法 原位末端标记法 二苯胺分光光度法
凝胶电泳法
原理：断裂DNA在凝胶中呈梯形排列 （DNA ladder）
丝裂原（抗原）刺激
淋
巴
细
胞
转
3H-TdR
化
试
验
原
理
示
放射性测定
意
细胞毒检测试验
1、T细胞介导的细胞毒试验 2、NK活性测定 3、ADCC作用测定
细
胞
毒
靶细胞
效应细胞
试
验
原
分离上清
理
示
意
放射性测定
抗体形成试验
1、直接溶血空斑试验 2、间接溶血空斑试验 3、SPA-SRBC溶血空斑试验
直接溶血空斑试验
间接溶血空斑试验
SPA-SRBC溶血空斑试验
细胞吞噬与杀伤功能试验
1、细胞吞噬功能试验 2、细胞杀菌功能试验
吞有颗粒的吞噬细胞数 吞噬百分率 =
计数的吞噬细胞数
吞噬细胞吞噬的总颗粒数
吞噬指数 =
计数的吞噬细胞数
NBT还原试验
原理：
N-N-
C
+ H+
N=N-R-
四氮唑基（淡黄色）
N-NH2 C N=NH
流式细胞仪
磁性分离法
磁铁吸引法 磁式细胞分类术法
N
S
MACS (阳性选择法）
N
S
MACS (阴性选择法）
其他分离法
花环沉降法 细胞活化克隆法 MHC分子四聚体法
抗原肽-MHC分子四聚体技术
细胞的冻存与复苏
细胞冻存的原理与方法 细胞复苏的原理与方法
细胞冻存罐
第二节 免疫细胞膜分子的检测
一、免疫细胞膜分子检测的原理与类型 二、免疫细胞膜分子的检测方法
免疫细胞膜分子检测的原理与类型
1、以抗体识别抗原 2、以配体识别受体
免疫细胞膜分子的主要检测方法
1、免疫标记检测方法 荧光抗体法 酶免疫检测法 免疫金银染色法
2、补体依赖的细胞毒试验（CDC） 3、花环形成试验
SmIg的荧光抗体检测法
细胞凋亡 （apoptosis）
细胞在内源性基因调控下 发生的主动死亡过程，也称程 序性死亡。
细胞凋亡的过程
凋亡信号——凋亡受体——信号传导— —凋亡基因启动——编码程序性死亡蛋 白——细胞结构解体——细胞凋亡
细胞凋亡机制
细胞凋亡的特点
1、细胞皱缩 2、染色质边集 3、凋亡小体出现
细胞凋亡
SmIg的酶免疫检测法
染料
补体
补体依赖的细胞毒试验（CDC）
E-花环
花环形成细胞 B细胞
绵羊红细胞 T细胞
EA-花环
EAC-花环
第三节 免疫细胞功能测定
一、转化、增殖试验 二、细胞毒试验 三、抗体形成试验 四、细胞吞噬与杀伤试验
转化、增殖试验
1、淋巴细胞转化试验 2、混合淋巴细胞培养
甲月簪基（紫黑色）
NBT还原试验
方法： 1、抗凝血 + 硝基蓝四氮唑（NBT），37。C孵育25min。
2、推片染色、镜检。 正常值： NBT阳性细胞 7.5-15%
第四节 免疫细胞凋亡测定
一、细胞凋亡的概念与原理 二、细胞凋亡的检测方法
细胞凋亡的概念与原理
1、细胞凋亡的概念 2、细胞凋DNA 使DNA显色，测定
凋亡百分率 =
上清液OD值 上清液OD值+沉淀OD值
流式细胞仪法
原理：PI标记凋亡细胞，通过FACS可 显示凋亡细胞的特征性亚二倍体 峰。并可经计算分析得出凋亡百 分率。
方法：制备细胞悬液 PI染色 FACS检测
本章小结
1、免疫细胞的类型与分离技术 2、细胞的冻存与复苏 3、免疫细胞膜分子的检测原理与方法 4、免疫细胞功能测定的原理与方法
第一节 免疫细胞的分类与分离
一、免疫细胞的种类与特征 二、免疫细胞的分离技术 三、细胞的冻存与复苏
免疫细胞的特征
1、免疫细胞的形态学特征 理化性状 生物学特性
2、免疫细胞的膜分子特征 CD分子
免疫细胞的起源与分化
红细胞 血小板 肥大细胞 中性粒细胞 巨噬细胞 树突状细胞 浆细胞 T细胞 NK细胞
免疫细胞的分离技术
1、密度梯度离心法 2、黏附分离法 3、荧光激活分离法 4、磁性分离法 5、其他分离法
密度梯度离心法
稀释抗凝血
血浆
淋巴细胞分离液 离心前
单个核细胞
粒细胞 红细胞 离心后
沉降速度 =
2r2（Q—Q0） x g 9
Q =颗粒比重 Q0 =溶质比重 r =颗粒半径 = 形状因子 = 颗粒摩擦系数/同体积球型颗粒摩擦系数 = 粘稠度 g = 相对离心力