第二章蛋白质定性定量分析
蛋白质的定性定量分析
二、免疫印迹分析的基本流程
制备蛋白样品
电泳分离蛋白
蛋白质转移
转移至固相膜
封闭非特异结合位点
与第一抗体温育反应
与第二抗体交联物温育反应
抗体检测
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显色
免疫印迹操作流程图
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1. 样品的制备
➢ 组织或细胞中提取
❖ 裂解 ❖ 去污剂 (SDS、Triton X-100、NP-40、Tween-20)
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原理
在碱性环境下蛋白质分子中的肽键能与Cu2
＋生成络合物，同时将Cu2＋还原成Cu＋。而BCA试
剂可敏感特异地与Cu＋结合，形成稳定的有颜色 的复合物，在562 nm处有高的光吸收值。颜色 的深浅与蛋白质浓度成正比，可根据吸收值的 大小来计算蛋白质的含量
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尤其是高浓度蛋白质溶液在酸性条
件下易发生沉淀 • 若选用目的蛋白来做标准曲线或用 另一种方法来校正，所测蛋白浓度
较准确
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三、Lowry检测法
这一标准、快速的蛋白质定量检测方法已得 到广泛应用.
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原理
首先在碱性溶液中形成铜-蛋白复合物，然后这 一复合物还原磷钼酸-磷钨酸试剂(Folin-酚试剂)， 产生钼蓝和钨蓝复合物的深蓝色，这种深蓝色的 复合物在745 ～750 nm处有最大的吸收峰，颜色 的深浅(吸收值)与蛋白质浓度成正比，可根据750 nm的光吸收值大小计算蛋白质的含量
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印迹技术的类别及应用
蛋白质分子的定量分析方法
蛋白质分子的定量分析方法蛋白质是生命活动中不可或缺的分子，广泛参与到生命的各个方面。
蛋白质分子的定量分析是研究生命活动机制的重要手段之一。
本文将介绍蛋白质分子的定量分析方法及其特点。
一、光谱法光谱法是一种常用的蛋白质分子定量分析方法。
蛋白质分子可以通过其吸收特定波长的光线来进行定量分析。
常用的技术包括紫外吸收光谱法（UV）、荧光光谱法和圆二色光谱法。
紫外吸收光谱法是通过测量蛋白质分子在紫外光区域（190-280纳米）的光吸收来定量分析蛋白质。
这种方法可以用于蛋白质含量的测量和结构的表征。
但是，紫外吸收光谱法对于一些蛋白质分子无法提供准确的定量结果。
荧光光谱法是一种敏感的定量方法，它利用蛋白质分子的荧光特性进行定量分析。
这种方法在生物学中的应用越来越广泛，特别是在蛋白质相互作用和药物筛选方面。
圆二色光谱法是一种检测蛋白质分子中手性结构（旋光性）的技术。
蛋白质分子的手性结构对它的功能起着重要作用。
圆二色光谱法可以对不同构象的蛋白质分子进行区分和定量分析。
二、生物传感器法生物传感器法是一种新型的蛋白质分子定量分析方法。
它是将某种特定的生物分子放置在一个传感器表面，当蛋白质分子与生物分子发生相互作用时，传感器中的信号将发生变化。
根据信号的变化可以定量测量蛋白质分子的含量。
常用的生物分子包括抗体、酶、DNA和RNA。
它们可以通过化学修饰或基因工程技术进行改造，以提高传感器的特异性和敏感性。
生物传感器法可以被用于药物筛选、生物安全检测、生命科学和临床诊断等领域。
三、质谱法质谱法是一种高分辨率、高精度的蛋白质分子定量分析方法。
它是利用蛋白质分子的质量和电荷量进行定量分析。
蛋白质分子可以通过质谱仪进行离子化，并用一个或多个检测器进行检测。
蛋白质质谱法包括某些形式的基质辅助激光解析/电离质谱法（MALDI-TOF）和液相色谱/串联质谱法（LC-MS/MS）。
质谱法可检测低至纳摩尔级别的蛋白质含量，因此常用于生物样本的高通量分析。
蛋白质定量分析及其生物学意义研究
蛋白质定量分析及其生物学意义研究蛋白质是构成生物体的一种复杂有机化合物，它在细胞内发挥着重要的作用。
在许多生物学研究领域，蛋白质定量分析是必不可少的技术之一。
本文将简要介绍蛋白质定量分析的原理和方法，并探讨其在生物学研究中的意义。
一、蛋白质定量分析原理和方法蛋白质定量分析是一种测定样品中蛋白质含量的方法。
蛋白质含量的确定对于许多研究都非常重要，如蛋白质质量分析、蛋白质结构研究、生物学功能研究等。
蛋白质定量分析的原理基于蛋白质与某些化合物之间的化学反应，例如凝集反应、酵素反应和光学反应等。
其中最常用的方法是比色法和荧光法。
比色法是测定蛋白质含量的常用方法之一。
这种方法基于蛋白质与特定化学试剂的化学反应，该试剂可以与蛋白质中的氨基酸结合，产生一个明显的吸收峰。
在试剂浓度和蛋白质浓度相同的情况下，吸收的强度和蛋白质的浓度成正比。
一般情况下，用尿素、酸、盐等使蛋白质与试剂发生反应，并通过紫外线分光光度计来测定吸收强度，计算蛋白质的浓度。
荧光法是一种灵敏的、分辨力强的蛋白质定量方法。
该方法是利用荧光染料与蛋白质结合后的荧光强度来测定蛋白质的含量。
在荧光法中，利用荧光染料在特定的波长下与蛋白质结合，形成荧光复合物，通过荧光光度计测定所形成的荧光强度，计算蛋白质的浓度。
二、蛋白质定量分析在生物学研究中的意义蛋白质定量分析在许多生物学研究中都有重要的应用。
一方面，它可以帮助研究人员确定蛋白质的浓度和量，从而在测定蛋白质活性、构象、交互作用、酶反应速率等方面提供有用的信息。
例如，在研究肿瘤发生和发展过程中，蛋白质的定量可以用来判断肿瘤细胞内的代谢状态和生长状态，并且可以发现与癌症有关的特定蛋白质。
另一方面，蛋白质定量分析是许多生物学实验的必要步骤之一。
例如，用于制备体外培养细胞所需的培养基，需要确保其含有足够高的蛋白质量。
此外，在免疫学研究中，通过测定蛋白质的浓度，可以确定抗体和病原体之间的亲和力。
总之，蛋白质定量分析在生物学研究中具有重要的应用价值。
蛋白质定性定量分析ppt课件
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2、利用微电极直接测定凝胶表面的p H而得知样品的等电点；
3、将凝胶切成等距离(5nm)的小块， 浸于水中，用精密试纸测定pH。以凝 胶块距正极的距离为横坐标，pH为纵 坐标作用图得出胶的pH梯度曲线。根 据待测样品在凝胶中的位置而得出蛋
白质样品的等电点。
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与标准蛋白比较，得出样品蛋白的含量。
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免疫印迹技术的基本操作(例PKC)
1、细胞裂解物的制备 2、细胞裂解液蛋白含量测定 3、细胞裂解物SDS－PAGE电泳 4、蛋白质转膜 5、目的蛋白的检测
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转变为硫酸铵。
Pr＋H2SO4
CO2＋H2O＋(NH4)2SO4
(NH4)2SO4+2NaOH NH4OH+HCl
NH4OH+H2SO4 NH4Cl+H2O
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凯氏法的评价： 优点：
1、适用于一切形态的样品； 2、不用比色，对混浊不透明的样品也可 进行分析； 3、结果的精、准度较高。
其它蛋白质定性定量分析技
术
蛋白质的电泳染色定量分析
特定蛋白质在总蛋白中所点比例的分析：最
早应用于血浆蛋白电泳分离后白蛋白和球蛋
白的比例测定。其方法有二，其一是将染色
后的蛋白区带剪下，用适当的溶剂提取后比
色测定；其二用反射扫描仪处理后，计算各
蛋白质的定量分析方法
蛋白质的定量分析方法1．蛋白质的常规检测方法1.1 凯氏定氮法一种最经典的蛋白质检测方法。
原理：样品中含氮有机化合物与浓硫酸在催化剂作用下共热消化，含氮有机物分解产生氨，氨又与硫酸作用变成硫酸铵。
然后加碱蒸馏放出氨，氨用过量的硼酸吸收，再用盐酸标准溶液滴定求出总氮量换算为蛋白质含量。
优点：范围广泛、测定结果准确、重现性好。
缺点：操作复杂费时、试剂消耗量大。
1.2 双缩脲法常用于需要快速但并不需要十分精确的蛋白质检测。
原理：双缩脲是三分子的脲经180℃左右加热，放出一份子氨后得到的产物，在强碱性溶液中，双缩脲与硫酸铜形成紫色络合物（肽链中的氮原子和铜离子配价结合），称为双缩脲反应。
紫色络合物颜色的深浅和蛋白质浓度成正比，因此可用来测定蛋白质含量。
优点：较快速、干扰物质少、不同蛋白质产生的颜色深浅相近。
缺点：灵敏度差、三羟甲基氨基甲烷、一些氨基酸和EDTA等会干扰该反应。
1.3 Folin酚试剂法原理：与双缩法大体相同，利用蛋白质中的肽键和铜离子结合产生双缩脲反应。
同时也由于Folin酚试剂中的磷钼酸-磷钨酸试剂被蛋白质的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深蓝色的钼蓝和钨蓝的混合物。
在一定条件下，蓝色深度与蛋白的量成正比，由此可测定蛋白质的含量。
优点：灵敏度高、对水溶性的蛋白质含量的测定很有效。
缺点：费时，要精确控制操作时间；Folin酚试剂的配制比较繁琐，且酚类和柠檬酸、硫酸铵、Tris缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油、还原剂（二硫代苏糖醇、巯基乙醇）、EDTA和尿素均会干扰反应。
1.4 紫外吸收法原理：蛋白质中的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基使其在280nm处具有紫外吸收，其吸光度与蛋白质含量成正比。
此外，蛋白质溶液在280nm处的吸光值与肽键含量成正比。
利用一定波长下蛋白质溶液的吸光值与蛋白质含量的正比关系可以测定蛋白质含量。
优点：简便、灵敏、快速、不消耗样品，测定后能回收。
缺点：测定蛋白质含量的精确度差、专一性差；干扰物质多，若样品中含有嘌呤、嘧啶等能吸收紫外光的物质会出现较大的干扰。
蛋白质的定量和定性分析方法
蛋白质的定量和定性分析方法蛋白质是生物体内最重要的功能分子之一，对于研究生物体的结构和功能具有重要意义。
为了准确地了解蛋白质的含量和性质，在科学研究和实际应用中，我们需要使用定量和定性分析的方法来研究蛋白质。
一、定量分析方法1. 低里德伯法（Lowry method）低里德伯法是一种经典而广泛应用的蛋白质定量方法。
该方法利用蛋白质与碱式铜络合物在碱性条件下反应生成蓝色产物，通过比色法测定溶液的吸光度来计算蛋白质含量。
这是一种灵敏且相对简单的方法，适用于大多数蛋白质样品的定量分析。
2. 比色法（Colorimetric assay）比色法是一种常用的蛋白质定量方法，通过蛋白质与染料的结合来测定蛋白质浓度。
常用的染料有布拉德福蓝（Bradford）、库吉铃蓝（Coomassie Brilliant Blue）、BCA法（Bicinchoninic Acid assay）等。
这些染料与蛋白质结合后形成一种复色物，通过比色法测定溶液的吸光度可以定量分析蛋白质。
比色法具有操作简便、灵敏度高等特点，被广泛应用于蛋白质定量领域。
3. 分子标记法（Molecular tagging method）分子标记法是一种新兴的蛋白质定量方法，利用特定的分子标记物（如荧光染料、放射性示踪剂等）标记蛋白质，然后通过测定标记物的荧光强度或放射性信号来计算蛋白质浓度。
分子标记法具有高灵敏度、高特异性等优点，适用于微量蛋白质的定量测定。
二、定性分析方法1. SDS-PAGE（Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis）SDS-PAGE是一种常用的蛋白质定性分析方法，通过电泳将蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中分离出来。
在电泳过程中，蛋白质在SDS（十二烷基硫酸钠）的作用下具有相同的电荷密度，只受到大小的限制而移动。
蛋白质在凝胶中的分离程度取决于其分子量大小，可以通过对比标准品的迁移距离来估计样品中蛋白质的相对分子量。
蛋白质2-Bradford定量分析.
0
1 ml
0
2(mg/ml) × 0.25 (ml) 0.75 ml
0.5
2(mg/ml) × 0.5 (ml)
0.5 ml
1.0
2(mg/ml) × 0.75 (ml) 0.3 ml
1.4
• 2. Sample dilution (150X) • 0.01 g+ 1.49 ml ddH2O • or 0.1 g+ 1.49 ml ddH2O
• 實驗方法：
• 各組分別取未知濃度之樣品，加入Bradford reagent混合，靜置約15分鐘反應後，以分光光 度計測其595 nm之吸光值。各樣品需作三重複 試驗，平均後比對Standard curve找出未知樣 品的蛋白質濃度。
BSA (ml)
ddH20 (ml) Final Conc. (mg/ml)
Hale Waihona Puke • 3. Standard & Sample 分別取0.01 ml加 • 入3 ml Bradford reagent 混合均勻後 • 室溫下避光靜置15分鐘
• 4. 測595 nm 吸光值
蛋白質2－Bradford定量分析
• 實驗原理： • 利用呈色劑Coomassie Blue會與蛋白質結合，
結合後最大吸光位置會由465 nm移到595 nm， 因此偵測595 nm處的吸光強度就可以量出蛋白 質的濃度。此法較傳統的Lowry assay精確，試 劑的使用也較簡易。
• 實驗材料： • Bradford reagent、不同濃度酪蛋白溶液。 • 儀器：分光光度計。
第二章蛋白质的定性定量分析【共54张PPT】
2. SDS-PAGE凝胶的制备
制备分离胶
制备浓缩胶
装板
加样
电泳
卸板并进行凝胶染色
3. SDS-PAGE基本原理
➢ 影响迁移率的因素
➢ SDS 十二烷基硫酸钠 (Sodium Dodecyl Sulfate) 十二烷基磺酸钠 (Sodium Dodecyl Sulfonate )
SDS作用：与蛋白牢固结合，当其浓度大 于1 mmol/L 时，SDS与蛋白质的结合比例为 1.4g
4g SDS/1g蛋白质，由于十二烷基硫酸根带负电荷，使得样品中各种蛋白质与SDS形成的SDS-蛋白质复合物都带有相同密度的负电荷，掩盖了蛋白质分子间天然的 电荷差异
该法是基于考马斯亮蓝G-250有红、蓝两种不同颜色的形式。
对各种纯化蛋白质反应不同
这是一种迅速、可靠的通过染色法测定
SDS与蛋白质之间的结合程度
SDS-PAGE基本原理
封闭非特异结合位点 注意：设立阳性对照和阴性对照，阴性对照可用免疫前血清、非相关单克隆抗体；
Watch SDS-PAGE原理
Watch SDS-PAGE原理
80-100 ug/cm2
4g SDS/1g蛋白质，由于十二烷基硫酸根带负电荷，使得样品中各种蛋白质与SDS形成的SDS-蛋白质复合物都带有相同密度的负电荷，掩盖了蛋白
+
pH 3
pH 7.5
Isoelectric Focusing
–
pH 10
–
pH 10
–
pH 10
–
pH 10
3–10
3–10NL 4–7 3–6
5–8
7–10
ReadyStripTM IPG Strips
蛋白质定量与定性分析报告
蛋白质定量与定性分析报告蛋白质定量分析与定性分析报告此次“蛋白质定量分析与定性分析”报告总共包括蛋白定量、蛋白简单定性、蛋白功能定性三个部分组成。
师兄的报告内容翔实，介绍生动，让我受益匪浅。
1. 蛋白质定量分析蛋白质定量分析是确定样品中总蛋白含量，或者某种单一蛋白的含量。
蛋白质的定量分析一般可从三个方面入手，一是基于蛋白质的元素组成特点，二是基于蛋白质的化学显色反应，三是基于蛋白质的光吸收特性。
蛋白质定量分析的方法有:280紫外吸光比色法、经典Bradford与Lowry检测法、BCA(二喹啉加酸)检测法、疏基测定检测法。
280紫外吸光比色法这一方法可用来快速检测溶液中是否含有蛋白质成分及其含量，通常用于柱层分析过程中检测蛋白质的洗脱峰。
如下图，蛋白质中的Trp、Tyr、Cys残基含有共轭双键，在280nm有一紫外吸收高峰。
在一定浓度范围内，蛋白质的A280与其浓度成正比，所以测定蛋白质溶液280nm的光吸收值是分析溶液中蛋白质含量的快速简便的方法。
可以通过A280与A260的差值来计算出蛋白质浓度，如:蛋白质浓度(mg/l)=1.45×A280-0.74×A260。
蛋白质的第二吸收峰在240nm以下，214nm最大，此峰是由肽键引起。
可通过214nm与225nm的差值来计算出蛋白质的含量。
较为精确的公式为: ε(280) (M-1 cm-1)= (#Trp)(5,500) + (#Tyr)(1,490) + (#cystine)(125).1.2 经典Bradford与Lowery检测法1.2.1 Bradford检测法这是一种迅速、可靠的通过染色法测定溶液中蛋白质含量的方法。
该法基于考马斯亮蓝G-250有红、蓝两种不同颜色的形式。
在一定浓度的乙醇及酸性条件下，可配成淡红色溶液，当于蛋白质结合后，产生蓝色化合物，反应迅速而稳。
蓝色复合物在595nm波长处具有最大光吸收值，并与溶液中蛋白质浓度成正比，因此可检测595nm的光吸收值大小计算蛋白的含量。
蛋白质组学定量分析的方法
蛋白质组学定量分析的方法
蛋白质组学定量分析的方法主要有两种：定性分析和定量分析。
1. 定性分析：常用的定性分析方法有蛋白质质谱技术，如蛋白质液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）。
这些方法能够对样品中的蛋白质进行分离、鉴定和定性分析，可以确定蛋白质的氨基酸序列和特定的修饰情况。
2. 定量分析：常用的定量分析方法有标记蛋白质定量和非标记蛋白质定量。
标记蛋白质定量方法包括同位素标记法和化学标记法。
同位素标记法主要包括稳定同位素标记法（如氘代谱标法）和放射性同位素标记法（如放射性同位素测量法）。
化学标记法主要包括功能分子标记法（如荧光标记法和生物素标记法）和反应性标记法（如对硝基苯甲酸标记法和丙煮醛标记法）。
非标记蛋白质定量方法常用的有相对定量法和绝对定量法。
相对定量法主要通过蛋白质相关的性质，在样品中不同蛋白质的含量所具有的差别来进行定量。
常用的相对定量方法有比较蛋白质的荧光标记法、差减荧光凝胶法和差异凝胶电泳法等。
绝对定量法主要使用内标法，通过加入已知浓度的内标蛋白质来计算目标蛋白质的浓度。
常用的绝对定量方法有多重反应监测法（MRM）和定量蛋白质标准曲线法等。
蛋白质定量分析方法
蛋白质定量分析方法蛋白质定量是蛋白质研究中非常重要的一项工作，它用于确定样品中蛋白质的浓度。
在蛋白质研究中，常常需要确定样品中蛋白质的浓度，以便进行后续的实验和数据分析。
当前常用的方法包括光谱法、比色法、生物学活性测定法和质谱法等。
下面将对这些方法进行详细阐述。
光谱法是一种常用的蛋白质定量方法，它是通过测量蛋白质溶液在特定波长下的吸光度来确定蛋白质的浓度。
在这种方法中，常用的波长是280nm，因为大部分蛋白质在这个波长下有较高的吸光度。
通过测量蛋白质溶液的吸光度值，可以使用比色法或者标准曲线法来计算蛋白质的浓度。
光谱法的优点是操作简单，不需要复杂的设备和试剂，而且可以同时测定多种蛋白质。
但是，光谱法对于一些特殊蛋白质和杂质的检测有一定的局限性。
比色法是蛋白质定量中常用的一种方法，它是通过比较样品和标准溶液的颜色差异来确定蛋白质的浓度。
比色法的原理是，蛋白质与某些特定试剂反应后，可以形成有颜色的复合物。
一般来说，蛋白质和某种染料或金属离子反应会产生特定的吸光峰，通过测量这个吸光峰的强度，可以确定蛋白质的浓度。
比色法的优点是快速、准确，适用范围广，且可以同时测定多种样品。
然而，比色法也存在一些问题，比如可能受到样品中其他物质的干扰，以及对试剂的选择和操作有一定的要求。
生物活性测定法是一种基于蛋白质的生物学活性特性来确定蛋白质浓度的方法。
在这种方法中，通过测定蛋白质的生物学活性，如酶活性、生物修复能力等，来推断蛋白质的浓度。
生物活性测定法在一些特定情况下非常有用，比如检测蛋白质的功能状态或者酶的活性。
但是，生物活性测定法也存在一些问题，如操作复杂、结果受到其他因素的干扰等。
质谱法是一种高灵敏度的蛋白质定量方法，它是通过测定样品中蛋白质产生的质荷比来确定蛋白质的浓度。
质谱法可以使用质谱仪来进行分析，通过电离和分离蛋白质，然后测定质荷比，计算样品中蛋白质的浓度。
质谱法具有高灵敏度、高分辨率和高通量的优点，能够检测到非常低浓度的蛋白质。
蛋白质定性、定量分析
蛋白质定性、定量分析蛋白质定性定量分析（图片来源：百泰派克生物科技）蛋白质定性、定量分析随着质谱技术的飞速发展，利用质谱技术进行蛋白质（组）的定性和定量分析得到更为广泛的应用和研究。
1. 蛋白质定性分析：确定样品中是否有蛋白质存在，以及存在的是何种蛋白质。
蛋白质定性分析通常是指利用质谱法进行蛋白质鉴定和序列分析。
蛋白质定性分析分为top-down分析和bottom-up分析两种策略。
目前，bottom-up分析策略被更广泛的应用于蛋白质定性分析工作。
Bottom-Up（自底向上）和Top-Down（自顶向下）两种策略“自底向上”策略是指通过分析由蛋白质酶解生成的肽段来鉴定蛋白质。
当应用该策略来分析蛋白质组混合物时，因其类似于基因组测序的鸟枪法，所以又被称为鸟枪法蛋白质组学（Shot-gun Proteomics)。
“自顶向下”策略直接鉴定完整蛋白质，在翻译后修饰和蛋白质同素异构体鉴定方面有一些潜在的优势。
可是该策略的缺陷是蛋白质在气相中分离、电离及碎裂都十分困难。
而鸟枪法蛋白质组学由于将蛋白质酶解成肽段，使其在气相中更容易被分离、电离和碎裂。
2. 蛋白质定量分析：确定样品中总蛋白含量，或者某种单一蛋白成分的含量。
蛋白质相对定量分析相对定量的目的是测定目的蛋白在两个或多个样本中的表达量的相对比例，而不需要知道它们在每个样本中的表达量。
例如，如果研究项目中包括处理过的和未经处理的对照样本，通常可以将未经处理的样本做为对照组，经处理的样本的定量结果除以对照样品的定量结果，就可以计算各个处理样本的蛋白含量相对于对照组样品的百分比。
蛋白质绝对定量分析目前基于质谱的绝对定量蛋白质组学研究主要是指靶向蛋白质组学。
靶向蛋白质组学分析，是指对目标蛋白质（或修饰肽段）进行定性和/或定量分析，或者用于验证大规模蛋白质组学的结果。
基于质谱的靶向蛋白质组学分析方法，由于没有物种限制并具备多目标同时分析能力等优势，受到越来越多的关注和应用。
蛋白质质谱定性定量
百泰派克生物科技
蛋白质质谱定性定量
对蛋白质进行定性定量鉴定即对目标蛋白的种类和含量进行鉴定是蛋白质组学研究中最基本的研究内容。
质谱技术是目前常用的蛋白质组学分析技术，它基于蛋白肽段离子的质荷比（m/z）和离子峰强度信息可实现蛋白质的定性和定量鉴定。
在质谱分析中，蛋白质先被酶解消化为小分子的肽段，小分子肽段在离子源中电离成肽段母离子，再利用质量分析器检测肽段母离子的质荷比和离子峰强度。
将肽段离子的质荷比数据与理论数据库进行比较、匹配可以确定其分子质量，进而获得该肽段的氨基酸组成，通过各肽段之间的拼接最后确定完整蛋白的分子量和氨基酸组成信息以实现定性鉴定。
肽段母离子的浓度与样品量成正相关，样品量越多，其产生的肽段离子就越多，相应的离子峰信号强度就越大，因此可以利用离子峰信号强度进行蛋白的含量测定。
若引入已知浓度的标准品（内标肽）还可以对蛋白进行精确的含量测定。
百泰派克生物科技采用Thermo Fisher的Q ExactiveHF质谱平台结合Nano-LC色谱，提供快速高效的蛋白质质谱定性定量鉴定服务技术包裹，您只需要将您的实验目的告诉我们并将您的细胞寄给我们，我们会负责项目后续所有事宜，包括细胞培养、细胞标记、蛋白提取、蛋白酶切、肽段分离、质谱分析、质谱原始数据分析、生物信息学分析，欢迎免费咨询。
蛋白质的定量分析方法
蛋白质的定量分析方法
检测蛋白质含量的方法有多种，常见的包括凯氏定氮法、生物素标记法、吸光光度法等。
1.凯氏定氮法（Kjeldahlmethod）：这是一种经典的蛋白质定量方法，主要通过测定样品中氮元素的含量来计算蛋白质含量。
凯氏定氮法包括消解、蒸馏和滴定三个步骤，其原理是将样品中的氮元素转化为氨氮，然后通过滴定测定氨氮的含量，进而计算蛋白质含量。
2.生物素标记法（Biotin-labelingmethod）：这是一种利用生物素（Biotin）与蛋白质特异性结合的方法来检测蛋白质含量。
首先将生物素标记到目标蛋白质上，然后利用亲和层析法（如生物素-亲和素系统）进行定量分析。
3.吸光光度法（Absorbancemethod）：这是一种基于蛋白质在紫外光区域的吸收特性进行定量分析的方法。
蛋白质中的芳香族氨基酸（如酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸）具有在紫外光区域（如
280nm）的吸收特性，通过测量样品在这一波长处的吸光值，可以计算蛋白质含量。
各种方法适用于不同的实验条件和要求，选择合适的方法需要根据实际情况来判断。
在实际操作过程中，还需注意遵循实验规程，确保实验结果的准确性。
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第二章蛋白质定性定量分析
一、SDS-PAGE测定蛋白质的相对分子量 1. 不连续系统原理 2. SDS-PAGE凝胶的制备
制备分离胶 制备浓缩胶 装板 加样 电泳 卸板并进行凝胶染色
第二章蛋白质定性定量分析
Hale Waihona Puke 3. SDS-PAGE基本原理
➢ 影响迁移率的因素 ➢ SDS
十二烷基硫酸钠 (Sodium Dodecyl Sulfate) 十二烷基磺酸钠 (Sodium Dodecyl Sulfonate )
第二章 蛋白质的定性定量分析
第二章蛋白质定性定量分析
➢ 蛋白质定性分析 (qualitative analysis)
确定样品中是否有蛋白质存在，以及存在的 是何种蛋白质
➢ 蛋白质定量分析 (quantitative analysis)
确定样品中总蛋白含量，或者某种单一蛋 白成分的含量
第二章蛋白质定性定量分析
SDS-蛋白质复合物分子构型也几乎相同(雪茄 烟形的长椭圆棒状的复合物)，而且具有相同的 荷质比，因此在SDS-PAGE中，SDS-蛋白质复 合物的电泳迁移率只与其分子量有关，而不再受 所带电荷及分子形状的影响，且在一定条件下， 迁移率与分子量呈对数线性关系
Watch SDS-PAGE原理
1/16%
一、紫外光谱 (A280)吸收法
这一方法可用来快速检测溶液中是否含有 蛋白质成分。通常用于柱层析过程中检测蛋 白质的洗脱峰
第二章蛋白质定性定量分析
原理
色氨酸、酪氨酸的最 大吸收峰在280 nm附近
大多数蛋白质含有这两 种氨基酸残基，所以测定蛋 白质溶液280 nm的光吸收 值是分析溶液中蛋白质含量 的快速简便的方法
注意事项 • 石英比色杯 • 调零所用溶液 • 配制标准蛋白所用溶液 • 光密度范围
第二章蛋白质定性定量分析
二、考马斯亮蓝G-250检测法
这是一种迅速、可靠的通过染色法测定 溶液中蛋白质含量的方法
第二章蛋白质定性定量分析
原理
该法是基于考马斯亮蓝G-250有红、蓝两种 不同颜色的形式。在一定浓度的乙醇及酸性条 件下，可配成淡红色溶液，当与蛋白质结合后， 产生蓝色化合物，反应迅速而稳。蓝色复合物 在595 mn波长处具有最大光吸收值，并与溶液 中蛋白质浓度成正比，因此可检测595 mn的光 吸收值大小计算蛋白的含量
第二章蛋白质定性定量分析
优 点 • 一种可靠的蛋白质定量方法 • 不同蛋白质之间差别很小
缺 点 • 干扰物质多 • 某些试剂不稳定 • 使蛋白质发生不可逆变性
第二章蛋白质定性定量分析
计算方法 • 标准曲线法 注意事项 • 在加入试剂30 min后呈色达到饱
和，时间延长颜色信号减弱 • 许多干扰物质降低颜色反应 • 高盐浓度可引起沉淀
第二章蛋白质定性定量分析
四、BCA (二喹啉甲酸)检测法 这是近年来新研制的一种改进的Lowry
测定法
第二章蛋白质定性定量分析
原理
在碱性环境下蛋白质分子中的肽键能与 Cu2＋生成络合物，同时将Cu2＋还原成Cu＋。 而BCA试剂可敏感特异地与Cu＋结合，形成 稳定的有颜色的复合物，在562 nm处有高的 光吸收值。颜色的深浅与蛋白质浓度成正比， 可根据吸收值的大小来计算蛋白质的含量
第二章蛋白质定性定量分析
SDS作用：与蛋白牢固结合，当其浓度大 于1 mmol/L 时，SDS与蛋白质的结合比例为 1.4g SDS/1g蛋白质，由于十二烷基硫酸根带 负电荷，使得样品中各种蛋白质与SDS形成 的SDS-蛋白质复合物都带有相同密度的负电 荷，掩盖了蛋白质分子间天然的电荷差异
第二章蛋白质定性定量分析
第二章蛋白质定性定量分析
优 点 • 终产物稳定 • 检测敏感性高
缺 点 •巯基试剂和去垢剂干扰 • 蛋白质发生不可逆的变性
第二章蛋白质定性定量分析
第二节 蛋白质相对分子量测定
分子量测定 (molecular weight, MW)
质谱 (ESI-MS)
沉降平衡超速离心 排阻层析
动态弹性光散射 孔径梯度电泳
第二章蛋白质定性定量分析
所需时间 • 10 min 优 点 • 快速（反应时间仅需2 min）
• 敏感，几乎没有蛋白质损失 缺 点 • 对各种纯化蛋白质反应不同
• 用这种测定方法对蛋白质引起不 可逆的变性
第二章蛋白质定性定量分析
计算方法 • 标准曲线法 注意事项 • 反应10～15 min后开始出现沉淀，
➢ 蛋白质含量的测定方法（重点掌握） ➢ 蛋白质相对分子量测定 (SDS-PAGE) ➢ 等电聚焦电泳 (IEF)（一般了解） ➢ 蛋白质的免疫印迹分析 (western blot)
第二章蛋白质定性定量分析
第一章 蛋白质的含量测定
蛋白质的含量测定
基于蛋白质的 基于蛋白质的 基于蛋白质的 元素组成特点 化学显色反应 光吸收特性
芳香族氨基酸的紫外吸收
第二章蛋白质定性定量分析
优 点 • 快速 • 对蛋白质无破坏性
缺 点 • 不是严格的定量，适用于测定蛋 白质粗提液
• 核酸可引起强干扰作用 •芳香族氨基酸含量差异可以起 误差
第二章蛋白质定性定量分析
计算方法 • 标准曲线法
• 蛋白质浓度 (mg/ml) =1.45×A280-0.74×A260
尤其是高浓度蛋白质溶液在酸性条 件下易发生沉淀 • 若选用目的蛋白来做标准曲线或用 另一种方法来校正，所测蛋白浓度 较准确
第二章蛋白质定性定量分析
三、Lowry检测法
这一标准、快速的蛋白质定量检测方法已 得到广泛应用.
第二章蛋白质定性定量分析
原理
首先在碱性溶液中形成铜-蛋白复合物，然 后这一复合物还原磷钼酸-磷钨酸试剂(Folin酚试剂)，产生钼蓝和钨蓝复合物的深蓝色， 这种深蓝色的复合物在745 ～750 nm处有最大 的吸收峰，颜色的深浅(吸收值)与蛋白质浓度 成正比，可根据750 nm的光吸收值大小计算 蛋白质的含量
第二章蛋白质定性定量分析
➢ 蛋白质元素组成的特点
各种蛋白质的含氮量很接近，平均为16％ 由于体内的含氮物质以蛋白质为主，因此 只要测定生物样品中的含氮量，就可以根据 以下公式推算出蛋白质的大致含量：
100克样品中蛋白质的含量 ( g % ) = 每克样品含氮克数× 6.25×100
第二章蛋白质定性定量分析