6 第6章 一般毒性作用及其试验与评价方法

粘膜
其它
结膜或口腔中分泌物增多，充血、苍白、黄疸
直肠或脚爪部皮肤温度降低或升高；姿势异常，消瘦等
5、LD50的计算方法：
（1）改进寇氏法 P127
• 改进寇氏法：计算简便，结果可靠。
• 试验设计要求：组内动物数相等、组间剂量等比例 设计、死亡率正态分布、最低剂量组死亡率 <20% ， 最大剂量组死亡率>80% • 计算公式：logLD50=Xκ- i(Σp - 0.5)
‘一次接触’
(P122)
经口接触和各种方式的注射接触，“一次接触”，是指 在瞬间将受试化合物输入实验动物的体内；
而经呼吸道吸入与经皮肤接触，“一次接触”是指在一
个特定的期间内实验动物持续地接触受试化合物的过程; 此外，当化学物毒性较低时，需要给予动物较大剂量时， 可在 24 小时内分多次给予，这时的急性接触即为“多 次”。
第一节
急性毒性作用及其评价
一、基本概念。（P122）
急性毒性（acute toxicity）是指机体(人或实验 动物)一次接触(或24小时内多次接触)受试物后， 在短期内所产生的效应及反应，包括一般行为、 外观改变及形态改变，甚至死亡效应。 观察时间：一般为7天，也可连续观察14～28天。
4日接触总剂量 （LD50）
累积接触总剂 量（LD50）
0.40
1.00
1.90
3.26
5.26
8.26
12.74
蓄积毒性试验的目的：
• 求出外源化学物的蓄积系数，了解蓄积毒性大小
• 为慢性毒性试验和其它有关毒性试验的剂量选择提 供参考依据 • 为制定有毒物质在食品中的卫生限量标准时，为安 全系数的选择提供参考 • 确定该受试物可否用于食品供人类长期食用
三、机体的耐受性
机体对化学物的耐受性：一些化学物在体内蓄积到 应该产生中毒反映的剂量时却没有出现中毒反应，必须 再加大剂量才能出现预期的中毒反应的现象。
机体对化学物的蓄积和耐受往往是同时存在的！
农药、兽药残留！
第三节 亚慢性毒性作用
一、基本概念 定义：亚慢性毒性是指实验动物连续多日接触 较大剂量的外源化学物所出现的中毒效应。
K =ED50(n) /ED50 (1) （以出现生物效应或特异性损伤为指标）
或K =LD50(n) /LD50 (1) （以死亡为指标） n―多次接触受试物时产生预期效应的蓄积剂量的总和 1―一次接触该物质产生相同效应的一次剂量
蓄积系数分级标准：
蓄积系数K K＜1 蓄积毒性分级 高度蓄积
1≤K＜3
Xκ--最高剂量组对数值 i -- 组距（相邻两组剂量对数值之差） Σp -- 死亡率总和
（2）霍恩法
优点：简单易行，使用动物少
缺点：可信范围大，不够精确
特点：
每组动物数是固定的，每组4只或5只
剂量是固定的，有两种系列：
…… 10，21.5，46.4 ，100，215，464，1000 ……
免费茶水的重金属严重超标
一份外国学者的研究指出， 中国13个品牌的香烟重金属含量超标
第二节
一、基本概念
蓄积毒性
P138
当化学毒物连续、反复进入机体，而且进 入的速度（或总量）超过代谢转化与排出的速度 （或总量）时，物质就有可能在体内逐渐增加并 贮留的现象--蓄积作用（accumulation） 化学毒物容易蓄积的组织和器官——贮存库
急性毒性试验的观察内容（P132） • 中毒出现的时间和症状 • 死亡时间及死亡数→计算LD50
• 剖检、生化及病理学检查
• 毒代动力学分析
啮齿类动物急性毒性试验主要的观察项目
器官系统 中枢神经系统 和躯体系统 血液循环系统 呼吸系统 胃肠系统 观察项目或中毒后的一般表现
行为：姿态改变、叫声异常。不安、活动增多或少动 动作：痉挛、震颤、运动失调、麻痹、惊厥、强制性动作 刺激反应：易兴奋，对外界刺激反应过敏或迟钝 肌肉张力：强直，迟缓
2、剂量设计与分组
• 根据受试物或其近似物的物理、化学性质选择与本实 验相同动物物种或品系，相同染毒途径的LD50值作为 参考值，选择剂量系列。 • 一般分四组：高中低三个剂量组及一个阴性对照组
3、确定实验动物染毒方法： 灌胃
4、观察周期及观察内容
观察周期：一般为14天或24h，但计算出LD50时应注明
…… 10，31.6，100，316，1000，3160，……
即每个剂量组之间的剂量差距只能是2.15倍或3.16倍
应用程序：
① 确定每组动物数，一般大小鼠5只，家兔4只 ② 确定剂量系列，常用的系列为： 1.00×10t(t=0、±1、±2) 2.15×10t 4.64×10t 10.0×10t
5、为在其它试验中发现的或未发现的毒作用提供新的信息，比较 不同动物物种毒效应的差异，为受试物毒作用机制研究和将研 究结果外推到人提供依据。
二、亚慢性毒性试验设计的要点
（一）试验动物的选择
1、物种品系：啮齿类、非啮齿类
2、性别：雌雄各半 3、年龄/体重：断乳不久的动物
如大鼠80～100g（21-23日龄），小鼠15g左右（18-21日龄）
二、急性毒性试验目的
1、测定和计算出急性毒性评价参数
• 1927 年 Trevan 引入了半数致死量的概念来评价急
性毒性，此后，该指标得到广泛应用，并成为急性 毒性的主要指标。
2、找出受试物的剂量-效应和剂量-反应关系
3、为毒作用机制研究提供线索。
急性毒性试验可以得到的毒性参数：
①绝对致死剂量或浓度(LD100或LCl00) ②半数致死剂量或浓度(LD50或LC50) ③最小致死剂量或浓度(MLD，LD01或MLC，LC01) ④最大耐受剂量或浓度(MTD，LD0或MTC，LC0) 或称为最大非致死剂量(MNLD)
• 急性毒性LD50大于人可能摄入量的10倍→该受 试物可进入下一阶段的试验
• 急性毒性LD50在人可能摄入量的10倍左右→重 复试验
•
LD50虽然是评价急性毒性的最重要指标，但仅凭LD50 进行急性毒性评价是不完善的。因为仅仅LD50一个指 标只能反映急性毒性的大小，并不能反映毒性的其他 特征。因此，在评价和报告化学物急性毒性时，除 LD50外，还应报告LD5095%可信限范围、急性毒作用 带等指标，并尽可能详尽描述中毒特征、症状表现、 出现时间、死亡前兆、毒性作用的发生、发展、恢复 经过，以及体重、剖检和病理学变化等。从而较全面 地对急性毒性做出评价。
物质蓄积（material accumulation）：
指机体少量反复多次接触毒物后，该毒物在
蓄积 作用
机体内逐渐积累。
功能蓄积（functional accumulation）：
指机体少量反复多次接触毒物后，每次引起
的轻微功能损害逐渐积累，当积累到一定程度时
出现毒性效应。
蓄积作用的毒理学意义：
3≤K＜5 K≥5
明显蓄积
中等蓄积 轻度蓄积
K =ED50(n) /ED50 (1) 或K =LD 50(n) /LD50 (1)
蓄积系数法常用的实验方案：
• 固定剂量法
• 剂量递增法 • 剂量固定的20天蓄积法
试 验 方 法
分
组
染毒时间
剂 量 （LD50）
染毒 终 止
观察期 25 ∼ 100天
4、动物数：大小鼠每组≥20只，犬猴每组≥6只； 5、环境要求：应使用SPF及以上等级动物；符合国家 实验动物标准的实验环境。
（二）染毒方式
一般采用经口、经呼吸道、经皮肤染毒
经口染毒多采用掺入饲料法
两个基本原则： –尽量模拟人类在环境中接触该化学物的 途径或方式； –应与预期进行慢性毒性试验的接触途径 相一致。
（三）剂量分组
至少设四组：3个剂量组和1个阴性对照组
高剂量组
• 以急性毒性试验的阈剂量或以LD50为参考 • 应能引起明显的毒性或少量动物死亡（<10%）
2 - 4组 固 定 （含对照组） 剂量法 雌雄各半 剂 量 递增法 实验组 对照组
每日一次 同一时间
同上 4天为一期 每日一次 同一时间 连续20天
1/20∼ 1/5
见表
染毒剂量累计达到 5个LD50剂量
实验组累积半数死 亡或21天结束
21天Leabharlann 随机分5组 20 天 （含对照组） 蓄积法 雌雄各半
对照 1/20 1/10 1/5 1/2
③ 预试验：如采用10，100，1000mg/kg的剂量
↓ ↓ ↓ 全部死亡 LD50可能在100-1000mg/kg 不见死亡
④ 正式试验：选择100，215，464，1000mg/kg（t=2）四个剂量组
观察并记录死亡数、死亡时间及中毒症状等。 如 死亡数为1，1，3，4 ⑤ 查表：根据动物死亡数查表（P366）求得LD50 LD50＝2.78×102＝278（125-619）mg/kg
四、急性毒性的分级与评价（P134）
急性毒性评价的最主要的依据就是LD50
急性毒性评价
• 剂量达10g/kg体重以上，仍不引起死亡→认为 该受试物的急性毒性试验是安全的
• 急性毒性LD50或7天在喂养试验的最小有作用剂 量小于人的可能摄入量的10倍→表面该受试物 急性毒性较大，应予以放弃，不再继续试验
第六章
一般毒性作用及其
试验与评价方法
一般毒性作用
（急性毒性、亚慢性毒性、慢性毒性）
毒性作用
特殊毒性作用
（ 致突变作用、致癌作用、 致畸作用、遗传毒性）
• 一般毒性作用(general toxicity)，也称基础 毒性(basic toxicity) ：是人和动物单次或 反复接触食品毒物或有害因素后在躯体及靶部 位所发生或表现出的急性或长期的一般性中毒 症状、生理生化变化、组织病变及死亡现象。 即毒物对动物机体产生的综合毒效应。 • 根据毒物接触次数和效应发生时间长短，一般 毒性作用可划分为急性毒性、（蓄积毒性）、 亚慢性毒性和慢性毒性。
• 品种、品系的选择 • 健康状况：健康成年动物
小鼠、大鼠测半数致死量，狗观察毒性反应。
• 年龄：大鼠180-240g，小鼠18-25g（35-50日 龄），家兔2-2.5kg，豚鼠200-250g，狗10-15kg。 • 性别：雌、雄各半，雌性实验动物要求是未 经交配和受孕的。 • 各剂量组动物数： 小动物数量为每组 10 只，大动物也应每组 6 只。
20天
20 ∼27 天
剂量递增法使用剂量表：
接触天数（天） 每日接触剂量 （LD50）
1～ 4 0.10 0.40
5～ 8 0.15 0.60
9～12 13～16 17～20 21～24 25～28 0.22 0.90 0.34 1.36 0.50 2.00 0.75 3.00 1.12 4.48
较大剂量 ---- 没有明确的剂量范围下限
但剂量上限<急性LD50。
较长时间 ---- 通常为3～6个月，由试验的目的而定。
亚慢性毒性试验目的： 主要是为慢性毒性试验做准备！
1、确定其观察到有害作用的最低剂量（LOAEL）和未观察到有害作 用的剂量（NOAEL），初步提出这种受试物的安全限量参考数值。 2、确定受试物亚慢性毒性的效应谱，毒作用特点和靶器官。 3、研究受试物亚慢性毒性损害的可逆性。 4、为慢性毒性试验的剂量设计及观察指标选择提供依据。
• 发生慢性中毒的物质基础
• 评价该毒物能否引起慢性中毒的依据之一
• 制订卫生标准时选择安全系数的主要依据
如：有机氯农药DDT和六六六、重金属铅的危
害主要是它们的蓄积作用所造成的慢性毒性。
二、蓄积毒性试验方法 • 蓄积系数法 • 生物半减期法
蓄积系数法
蓄积系数是指多次染毒使半数动物出现效应 （或死亡）的蓄积剂量[ED50(n)]与一次染毒使半 数动物出现相同效应（或死亡）的剂量[ED50 (l)] 的比值。
心动过速或过缓、心律不齐、血管收缩或舒张 呼吸深缓、呼吸过速、喘息、张口和腹式呼吸
恶心、呕吐、腹泻；便血、尿血、大小便失禁，便秘；粪便 不成型，呈黑色或灰色 阴户、乳腺膨胀、分泌物增多；阴茎突出、遗精；会阴部污 生殖泌尿系统 秽有分泌物 瞳孔放大或缩小，瞳孔对光反射；流泪，上眼脸下垂；眼球 眼 突出、充血，眼球震颤；角膜浑浊 皮肤和被毛 出现红斑、皮疹、水肿、坏死、脱毛、竖毛、松驰
急 以性 死毒 亡性 为的 终上 点限 参 数 急 非性 作致毒 性 用死 的 为性 下 终急 限 点性 毒参 性数 ，
⑤急性毒性LOAEL(观察到有害作用的最低剂量) ⑥急性毒性NOAEL(未观察到有害作用的剂量)
通过病理组织学和中毒症状观察等手段测定
三、急性毒性试验设计要点
1、实验动物的选择和要求