GSH含量的测定SOP

主要目的：

——测定物质还原性谷胱甘肽（GSH）的含量。

主要原理：

参照GSH检测分析试剂盒说明书，5,5’–二硫代–双–（2–硝基苯甲酸）能和谷胱甘肽（GSH）反应产生2–硝基–5–巯基苯甲酸和谷胱甘肽二硫化物（GSSG），由于2–硝基–5–巯基苯甲酸是一黄色产物，通过测定其在412 nm处的最大吸收可确定样品中谷胱甘肽的含量用纯化的谷胱甘肽（GSH）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中加入谷胱甘肽（GSH），再与HRP标记的谷胱甘肽（GSH）抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB 显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的谷胱甘肽（GSH）呈正相关。用酶标仪在412 nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中谷胱甘肽（GSH）的含量。

实验室签章

一、试剂

——谷还原性胱甘肽（GSH）测定试剂盒（南京建成生物研究所）

二、仪器设备

——96孔酶标板

——UV-Vis可见多功能酶标仪

——旋涡混匀器

——离心机

——移液枪及其相应量程枪头

三、实验方法

根据试剂盒说明书具体操作步骤如下:

1.上清液的制备：取稀释后的血清或组织匀浆液0.5 mL，加试剂一应用液

2 mL 混匀，4000 rpm离心10分钟，取上清液1 mL进行显色反应。

2.显色反应：空白管中加入1 mL试剂一，标准管加入20μmol/LGSH标准液

1 mL，测定管加入上步骤得到的上清液1 mL，然后各管中分别加入1.25 mL试剂

二、0.25ml试剂三、0.05 mL试剂四。

3.混匀，室温静置5分钟后，在412 nm处将酶标板空板进行扫描，准确吸取0.2 mL各管反应液加入到新的96孔板中，酶标仪测定各孔吸光度（OD值）。

4.血清中GSH含量计算公式

GSH含量（mg/L）

-

-

OD OD

=

测定OD值空白OD值

标准值空白值

×标准品浓度（20×10-3mmol/L）×GSH

分子量（307）×样本测试前稀释倍数组织中GSH含量公式

GSH含量（mg/gprot）

-

-

OD OD

=

测定OD值空白OD值

标准值空白值

×标准品浓度（20×10-3mmol/L）

×GSH分子量（307）×样本测试前稀释倍数÷待测组织匀浆液蛋白浓度（gprot/L）

参考文献

Lapshina E A, Sudnikovich E J, Maksimchik J Z, et al. Antioxidative enzyme and glutathione S-transferase activities in diabetic rats exposed to long-term ASA treatment [J]. Life sciences, 2006, 79(19): 1804-1811.