谷胱甘肽含量测定

【实验目的】

了解植物组中中抗坏血酸-谷胱甘肽循环代谢过程，学习还原型谷胱甘肽含量的测定原理和方法。

【实验原理】

谷胱甘肽是有谷氨酸（Glu）、半胱氨酸（Gly）组成的天然三肽，是一种含巯基（—SH）的化合物，广泛存在于动物组织、植物组织、微生物和酵母中。谷胱甘肽能和5,5’-二硫代-双-（2-硝基苯甲酸）（5,5’-dithiobis-2-nitrobenoic acid，DTNB）反应产生2-硝基-5-巯基苯甲酸和谷胱甘肽二硫化物（GSSG）。2-硝基-5-巯基苯甲酸为一黄色产物，在波长412nm处具有最大光吸收。因此，利用分光光度计法可测定样品中谷胱甘肽的含量。

【器材与试剂】

1.实验仪器与用具

研钵、高速离心机、移液管、离心管、试管、分光光度计

2.实验试剂

还原型谷胱甘肽标准液；偏磷酸溶液；磷酸溶液缓冲液（pH7）；二硫代硝基苯甲酸（5,5’-dithiobis-2-nitrobenoic acid，DTNB）溶液；蒸馏水。

3.实验材料

小麦叶片

【实验步骤】

1.标准曲线制作

取7支试管，编号，按照下表加入各种试剂，混匀，25℃保温反应10min。以1号管为参比调零，测定显色液在412nm处的吸光度。以吸光度为纵坐标，还原型谷胱甘肽物质的量（μmol）为横坐标，绘制标准曲线。

试管号

试剂（ml）

1 2 3 4 5 6 7

10μg/ml GSH标准液0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

蒸馏水 2.0 1.9 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 pH7磷酸缓冲液 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 DTNB试剂0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 GSH浓度μg/2ml 0 1 2 4 6 8 10

2.提取

取材后，称取0.2g样品置于研钵中，加入少量5%偏磷酸研磨成匀浆后，定容至6ml, 8000转离心10min。收集上清液来测定谷胱甘肽含量，测量提取液体积。

3.测定

取上清液2ml，显色，操作同标准曲线。重复3次。

显色反应后，分别记录样品管混合液的吸光度和空白对照管反应混合液的吸光度。根据吸光度差值，从标准曲线上查出相应的还原型谷胱甘肽量，计算还原型谷胱甘肽含量（μmol/g）。

4.计算

GSH含量（μmol/g）=（C x×V t）/ （FW×V S）

式中，C x为2ml样品中GSH的含量（μg）；V t为样品提取液总体积（ml）；V s为显色时样品液体积（ml）；FW为样品质量（g）。

【实验结果】

1.标准曲线

试管编号 1 2 3 4 5 6 7

GSH浓度（μg/2ml）0 1 2 4 6 8 10

吸光度值A 0 0.067 0.134 0.314 0.452 0.579 0.723

以GSH浓度（μg/2ml）为横坐标，吸光度值为纵坐标，建立标准曲线。

2.小麦叶片中GSH含量

实验重复三次，测定结果如下：

重复 1 2 3

样品质量（FW）0.205 0.204 0.206

吸光度0.193 0.192 0.196

C x0.0141 0.0140 0.0143

GSH含量（μmol/g）0.206 0.206 0.208

GSH含量平均值0.207

【注意事项】

1. 在提取样品时，需要沉淀出去蛋白质，以方志蛋白质中所含巯基及相关酶对测定结果的影响。

2.利用本方法还可以测定样品中总谷胱甘肽（GSSG+GSH）和氧化型谷胱甘肽（GSSG）的含量。在谷胱甘肽还原酶（GR）作用下，将GSSG还原成GSH再进行测定和计算。

3. 建议在第一次测定时先做2或3个样品本底对照，如果样品中本底对照和空白对照非常接近，则说明样品液中不存在干扰物质，可以不再检测样品本底对照。