石蜡切片和冷冻切片
石蜡切片VS冰冻切片
石蜡切片V S冰冻切片石蜡切片不仅用于观察正常细胞组织的形态结构，也是病理学和法医学等学科用以研究、观察及判断细胞组织的形态变化的主要方法，而且也已相当广泛地用于其他许多学科领域的研究中。
冰冻切片是一种在低温条件下使组织快速冷冻到一定的硬度，然后进行切片的一种方法。
制作过程较石蜡切片快捷、简便，因而多应用于手术中的快速病理诊断。
实验步骤一、石蜡切片1.?固定：将新鲜组织切成小块，固定于4%多聚甲醛过夜。
凝固组织中的物质成分，尽可能保持其活体时的结构。
同时能使组织硬化，有利于切片的进行。
2.脱水：为了减少组织材料的急剧收缩，应使用从低浓度到高浓度递增的顺序进行经70%、85%、95%直至纯酒精（无水乙醇），每次时间为1小时。
固定后的组织材料需除去留在组织内的固定液及其结晶沉淀，否则会影响后期的染色效果。
3.透明：常用的透明剂有二甲苯，二甲苯是石蜡的溶剂。
纯酒精不能与石蜡相溶，还需用能与酒精和石蜡相溶的溶剂，替换出组织内的酒精。
材料块在透明剂浸渍过程称透明。
?4.浸蜡：先把组织材料块放在熔化的石蜡和二甲苯的等量混合液浸渍1小时。
先后移入2个熔化的石蜡液中浸渍1小时左右。
5.包埋：以少许热蜡液将其底部迅速贴附于包埋盒内上，然后置于速冻台，让石蜡固定。
6.切片：切片刀的锐利与否、蜡块硬度是否适当都直接影响切片质量，可将蜡块至于冷水中改变蜡块硬度。
通常切片厚度为3-5um，用毛笔轻托轻放在37度水浴中展片。
7.贴片与烤片：一般使用恒温水浴锅，温度控制在37-40℃左右，有利于石蜡切片的展开，贴好的切片置于60℃恒温箱内干燥2小时，蛋白质凝固后即可染色。
8.切片脱蜡及水化：干燥后的切片置于二甲苯中进行脱蜡，然后依次使用从高浓度到低浓度递减的顺序进行经纯酒精、95%、85%、70%进行水化。
9.染色：经典的苏木精和伊红：细胞核被苏木精染成紫蓝色，多数细胞质及非细胞成分被伊红染成粉红色。
实验操作简单。
免疫组化：指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应。
石蜡切片与冰冻切片
石蜡切片与冰冻切片一、组织和细胞标本类型：（一）组织标本类：1、石蜡切片：组织形态保存好2、冰冻切片：抗原性保存好（二）细胞标本类：1、组织印片2、细胞培养片（细胞爬片）3、细胞涂片二、组织取材1、脑组织和神经组织应采用灌注固定后，再进行后固定。
2、组织取材注意事项：（1）标本新鲜：组织要求离体后30min~2h内浸入固定液，尤其是开展分子生物学工作。
动物组织取材要求心脏还在跳动时取材。
（2）注意防止人为因素的影响刀和剪要快，避免挤压。
（3）组织块的大小厚为0.1~0.3cm，大小可根据需要而定。
三、活细胞标本的制备法（1）细胞大量培养后，经消化将细胞制成悬液（106）涂在涂有切片粘合剂的载玻片上，凉干后固定。
（2）将细胞直接培养在盖玻片上。
（3）将细胞直接培养在6孔或9孔板上，经固定后可行IHC。
四、石蜡切片的制备1、由于石蜡不溶于水和醇类试剂，只溶解在二甲苯类试剂中。
因而，组织经固定和水洗后含大量水分，需用乙醇类试剂进行脱水，水脱完后，组织内含有大量的乙醇，还必须用能溶解乙醇的二甲苯来置换，最后经浸蜡，组织细胞内被大量石蜡支称，才使组织能用于石蜡切片。
2、小动物组织脱水、透明和浸蜡时间75%乙醇30min，85%乙醇30min，95%乙醇Ⅰ1h，Ⅱ1h，Ⅲ过夜或2h；无水乙醇Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ各30min；二甲苯Ⅰ15min，Ⅱ10min，Ⅲ10min；石蜡Ⅰ30min，石蜡Ⅱ30min，石蜡Ⅲ1~2h。
五、冰冻切片的保存和使用1、冰冻切片固定后-80℃保存备用2 、冰冻切片从-80℃取出，凉干或电吹风吹干后可直接进行免疫组化标记。
石蜡切片、冰冻切片实验技术服务
石蜡切片、冰冻切片实验技术服务
石蜡切片不仅用于观察正常细胞组织的形态结构，也是病理学和法医学用以研究、观察及判断细胞组织的形态变化的主要方法，而且也已相当广泛地用于其他许多学科领域的研究中。
冰冻切片是一种在低温条件下使组织快速冷冻到一定的硬度，然后进行切片的一种方法。
制作过程较石蜡切片快捷、简便，因而多应用于手术中的快速病理诊断。
【技术原理】
组织经固定后，含有大量水分，使用乙醇从低浓度到高浓度将组织内的水分逐渐置换出来，以利于透明剂和石蜡的进入，这个过程称为脱水。
组织脱水后，必须经过一种既能与乙醇相结合，又能溶解石蜡的溶剂，通过这种溶剂的媒介作用使石蜡浸入组织，这种溶剂使组织呈现出不同程度的透明状态，这个过程称为透明。
组织经过脱水、透明后用石蜡作为支持剂浸入组织内，使组织变硬并将组织包裹在内，有利于切片，这个过程称为浸蜡。
浸蜡后的组织块用石蜡包成块，使组织达到一定的硬度和韧度有利于切片。
【实验流程】
案例展示
技术总结
【常见问题】
1、切片上卷或皱起
切片刀角度过大或过小，调整角度以5°为宜。
2、切片有空洞及破碎不齐
切片时慢一点，轻削组织。
3、切片有褶皱
切片时对准蜡块表面轻轻哈气。
【注意事项】
1、组织硬度较大，容易发生切片碎裂，需经软化或脱钙；
2、摊片时间过长，组织中心易开裂；
3、摊片时间过短，组织有褶皱，影响后续染色拍照；
4、特殊组织的切片，在后续染色过程中容易出现掉片的情况，比如皮肤、脑组织；
5、切片太厚，容易导致染色程度过深。
病理切片储存与管理规范
病理切片储存与管理规范病理切片是病理学研究和临床诊断的重要依据，对于疾病的准确诊断、治疗方案的制定以及医学研究都具有极其重要的意义。
因此，规范的病理切片储存与管理至关重要，它不仅能够保证切片的质量和完整性，还能提高工作效率，为医疗工作提供可靠的支持。
一、病理切片的分类病理切片通常分为石蜡切片、冰冻切片和细胞学涂片等。
石蜡切片是经过固定、脱水、透明、浸蜡和包埋等一系列处理后制成的，具有较好的组织结构保存效果，是最常见的病理切片类型。
冰冻切片则是在手术中快速制作，用于术中病理诊断，但其保存时间相对较短。
细胞学涂片主要用于细胞形态学的观察，如宫颈涂片、胸水涂片等。
二、储存环境要求1、温度和湿度病理切片的储存环境应保持温度在 18-25℃，相对湿度在 40%－60%。
过高或过低的温度和湿度都会影响切片的质量，导致切片变形、干裂或发霉。
2、通风与防尘储存室应保持良好的通风，以防止有害气体的积聚。
同时，要采取有效的防尘措施，避免灰尘污染切片。
3、光照应避免切片直接暴露在阳光下或强光照射，以免导致切片褪色。
三、储存设备1、切片柜切片柜应采用防火、防潮、防虫的材料制作，内部结构合理，便于切片的分类存放。
每个抽屉应标明切片的编号、患者姓名、病理诊断等信息。
2、玻片盒玻片盒应选用质量良好、无腐蚀性的材料，能够有效保护切片不受损伤。
玻片盒上也应标注相关信息。
四、切片的编号与标识1、编号系统建立科学合理的编号系统，确保每个切片都有唯一的编号。
编号应包含患者的基本信息、取材部位、病理类型等，以便于查找和识别。
2、标识内容切片上的标识应清晰、准确，包括患者姓名、病历号、取材日期、切片类型等。
同时，在切片的包装和储存位置上也应标注相应的信息。
五、切片的入库与登记1、入库检查切片制作完成后，在入库前应进行质量检查，确保切片完整、无损坏、染色清晰。
2、登记信息详细记录切片的入库信息，包括编号、患者信息、诊断结果、储存位置等，建立完善的入库登记台账。
石蜡切片和冷冻切片制作流程
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1. 固定，将组织浸泡在固定液中（如福尔马林），使组织蛋白凝固。
常用的经典组织学技术
常用的经典组织学技术经典组织学技术是研究细胞和组织学形态结构的重要手段，是现代生命科学中不可或缺的一部分。
随着科技的发展和进步，组织学技术不断创新和完善，但是一些经典的组织学技术仍然广泛应用于生命科学的研究领域。
下面将对常用的经典组织学技术进行介绍。
一、石蜡切片技术石蜡切片技术是组织学研究中最常用的技术之一。
它可以将组织切成非常薄的切片，使得组织的形态结构可以在显微镜下观察和研究。
石蜡切片技术的步骤大致如下：首先将组织固定、脱水处理，然后将组织浸入蜡中进行渗透处理，最后将渗透好的组织切出薄片。
石蜡切片技术具有较高的分辨率和生物安全性，因此广泛应用于组织形态学研究、诊断和治疗。
二、冰冻切片技术冰冻切片技术是一种较新的组织学技术，其基本原理是将组织迅速冷冻，然后切成薄片。
与石蜡切片技术相比，冰冻切片技术可以得到更好的组织微观结构和细胞内的亚细胞结构信息，尤其适合于一些对生物体很敏感的组织，如神经组织。
冰冻切片技术可以直接应用于某些特殊的生命科学领域，如蛋白质晶体学和冷冻电镜技术等。
三、光学显微镜技术光学显微镜技术是组织学研究中应用最广泛的技术之一，也是组织学技术学习中最基础的技术之一。
这种技术可以通过灯光和透镜将显微镜下的物体放大，并且在不破坏样品的情况下识别和分析不同的细胞和组织结构。
光学显微镜技术在诊断学、细胞学、解剖学、生物学和化学等领域均有广泛应用。
四、免疫组化技术免疫组化技术是一种基于抗体-抗原相互作用原理的组织学技术，将特定抗原标记着色分析。
通过在组织或细胞上添加合适的抗体，对该抗原特定位置进行标记，从而在显微镜下较为清晰地观察到抗原的位置、形态和分布情况，是现代生命科学中极为重要的分析方法之一，特别适用于组织病理学、免疫学和肿瘤学等领域。
五、原位杂交技术原位杂交技术是一种能够检测基因或RNA等核酸分子的组织学技术。
利用标记着色质和探针的互动，把探针寡核苷酸序列与样品中的核酸混合，然后目视观察其在细胞或组织中的位置、分布和数量来检测其在样品中的表达情况和作用机制的过程。
冰冻切片与石蜡切片的区别
1．冰冻切片是免疫构造化教染色中最时常使用的一种切片要领.其最超过的便宜是不妨较完佳天保存多种抗本的免疫活性，越收是细胞表面抗本更应采与冰冻切片.新陈的构造及已牢固的构造均可做冰冻切片.之阳早格格创做冰冻时，构造中火份易产死冰晶，往往做用抗本定位.普遍认为冰晶少而大时，做用较小，冰晶小而多时，对于构造结构益伤较大，正在含火量较多的构造中上述局面更易爆收.冰晶的大小与其死少速率成正比，而与成核率（产死速率）成反比，即冰晶产死的数量愈多则愈小，对于构造结构做用愈宽沉.果此，应尽管落矮冰晶的数量.Fish认为冰冻启初时，冰晶成核率较缓，以来渐渐减少，其临界温度为-33.C,从-30.C 落至-43.C之间，成核率慢遽减少达1018，而后再减缓.鉴于上述表面可采与以下步伐缩小冰晶的产死.（1）速冻，使构造温度骤落，支缩从-33.C43.C的时间，缩小冰晶的产死.其要领有二：①搞冰-丙酮（酒粗）法：将150-200ml丙酮（酒粗）拆进小保温杯内，渐渐加进搞冰，曲至鼓战呈粘稀状，再加搞冰出有再昌泡时，温度可达-70℃C，用一小烧杯（50-100ml）内拆同戊烷约50ml，再将烧杯缓缓置进搞冰丙酮（杂酒粗）鼓战液内，至同戊烷温度达-70℃时即可使用.将构造（大小为1cm×0.8cm×0.5cm）加进同戊烷内速冻30-60s后与出，或者置恒热箱内以备切片，或者置-80℃矮温冰箱内贮存.②液氮法：将构造块仄搁于硬塑瓶盖或者特造小盒内（曲径约2cm），如构造块小可适量加OCT包埋剂浸出构造，而后将特造小盒缓缓仄搁进衰有液氮的小杯内，当盒底部交触液氮时即启初气化沸腾，此时小盒脆持本位切勿浸进液氮中，约莫10-20s构造即赶快冰结成块.与出构造冰块坐时置进-80℃冰箱贮存备用，或者置进恒热箱切片机冰冻切片.（2）将构造置于20%-30%蔗糖溶液1～3天，利用下渗吸支构造中火分，缩小构造含火量.做用冰冻切片的果素较多，果此，技能易度较大，采用佳的冰冻切片机是包管切片品量的关键.久时冰冻切片机有二类：①恒缓冰冻切片机（Cryastat）：为较理念的冰冻切片机，型号很多，但是其基础结构是将切片机置于-30℃C矮温稀关室内，故切片时出有受中界温度战环境做用，可连绝切薄片至2-4μm，真足能谦脚免疫构造化教标记表记标帜央供.切片时，矮温室内温度以-15℃～18℃为宜，温度过矮构造易破碎，抗卷板的位子及角度要适合，载玻片附揭构造切片，切勿上下移动.②启搁式冰冻切片机：包罗半导体致热切片机战甲醇致热切片以及老式的CO2、氯乙烷等热冻切片机.切片时表露气氛中，温度出有简单统造，切片技能易度大，正在下温季节，切片越收艰易，且切片薄8～15μm，出有简单连绝切片，但是其便宜是价廉，海内有死产.冰冻切片后如出有染色，必须吹搞，贮存矮温冰箱内，或者举止短促预牢固后贮存冰箱保存.2．石蜡切片其便宜是构造结构保存良佳，正在病理战回瞅性钻研中有较大的真用价格，能切连绝薄片，构造结构浑晰，抗本定位准确.用于免疫组化技能的石蜡切片造备与惯例造片略有分歧：①脱火、透明等历程应正在4℃.C下举止，以尽管缩小构造抗本的益坏.②构造块大小应限于2cm×1.5cm×0.2cm，使构造充分脱火、透明、浸蜡.③浸蜡、包埋历程中，石蜡应脆持正在60℃以下，以溶面矮的硬蜡最佳（即矮温石蜡包埋）.构造块脱火、透明、浸蜡时间参照表1-3：表1-3 构造块处理时间表1 70%乙醇4℃ 3～4h2 80%乙醇4℃ 3～4h3 90%乙醇4℃ 2～3h4 95%乙醇Ⅰ 4℃ 2～3h5 95%乙醇Ⅱ 4℃ 1～2h8 二甲苯Ⅰ 4℃ 0.5～1h9 二甲苯Ⅱ 4℃ 0.5１～1h10 石蜡Ⅰ 60℃ 1h11 石蜡Ⅱ 60℃ 2h以上齐历程为18-24h，也可正在室温内使用自动脱火机代替.如构造块小，曲径小于0.5cm，可用赶快石蜡包埋切片，齐历程只需4h安排.石蜡切片为惯例造片技能，切片机多为轮转式，切片薄度2～7μm，应用范畴广，出有做用抗体的脱透性，染色匀称普遍.由于甲醛牢固、有机熔剂战包埋剂对于组抗本有一定的益伤及遮蔽，使抗本特性爆收改变.有人报告经蛋黑酶消化，不妨革新光镜免疫组化染色强度，时常使用的有胰蛋黑酶、链霉蛋黑酶及胃蛋黑酶等消化法.石蜡切片应进37℃恒温箱过夜，那样烤片可缩小染色中脱片局面.切片如需少久贮存，可存搁于4℃冰箱内备用.石蜡切片便宜较多，但是正在造片历程中要通过酒粗、二甲苯等有机溶剂处理，构造内抗本活性得来较多，有人采与热冻搞燥包埋法（Freeze drying embedding methed），不妨保存构造内可溶性物量，预防蛋黑变性战酶的得活，进而缩小了抗本的拾得.该法是将新陈构造矮温速冻，利用热冻搞燥机（Freezing dryer）正在真空、矮温条件下排除构造内火分，而后用甲醛蒸气牢固搞燥的构造，末尾将构造浸蜡、包埋、切片.此法可用于免疫荧光标记表记标帜、免疫酶标记表记标帜及搁射自隐影.。
石蜡切片和冷冻切片
石蜡切片和冷冻切片——傻傻分不清楚系列之迟辟智美创作在组织实验中，组织切片和冷冻切片是最罕见的两种切片方法，两种优缺点明显，在实验的应用上也年夜有分歧.而两个实验的相同点都是应用免疫学基来源根基理——即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标识表记标帜抗体的显色剂显色来确定组织细胞内卵白质，对其进行定位、定性及相对定量的研究.一、石蜡切片组织学惯例制片技术中最为广泛应用的方法.石蜡切片不单用于观察正常细胞组织的形态结构，也是病理学和法医学等学科用以研究、观察及判断细胞组织的形态变动的主要方法，而且也已相当广泛地用于其他许多学科领域的研究中.1、固定：将新鲜组织切成小块，固定于4%多聚甲醛过夜.凝固组织中的物质成份，尽可能坚持其活体时的结构.同时能使组织硬化，有利于切片的进行.2、脱水：为了减少组织资料的急剧收缩，应使用从低浓度到高浓度递增的顺序进行经70%、85%、95%直至纯酒精（无水乙醇），每次时间为1小时.固定后的组织资料需除去留在组织内的固定液及其结晶沉淀，否则会影响后期的染色效果.3、透明：经常使用的透明剂有二甲苯，二甲苯是石蜡的溶剂.纯酒精不能与石蜡相溶，还需用能与酒精和石蜡相溶的溶剂，替换出组织内的酒精.资料块在透明剂浸渍过程称透明.4、浸蜡：先把组织资料块放在熔化的石蜡和二甲苯的等量混合液浸渍1小时.先后移入2个熔化的石蜡液中浸渍1小时左右.5、包埋：以少许热蜡液将其底部迅速贴附于包埋盒内上，然后置于速冻台，让石蜡固定.6、切片：切片刀的锐利与否、蜡块硬度是否适当都直接影响切片质量，可将蜡块至于冷水中改变蜡块硬度.通常切片厚度为5微米，用毛笔轻托轻放在37度水浴中展片.7、贴片与烤片：将水浴中展片捞至玻片上铺正，然后将载玻片放入37℃温箱中干燥.8、切片脱蜡及水化：干燥后的切片置于二甲苯中进行脱蜡，然后依次使用从高浓度到低浓度递加的顺序进行经纯酒精、95%、85%、70%进行水化.9、染色：经典的苏木精和伊红：细胞核被苏木精染成紫蓝色，大都细胞质及非细胞成份被伊红染成粉红色.实验把持简单.免疫组化：指带显色剂标识表记标帜的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应.二、冰冻切片：冰冻切片是一种在高温条件下使组织快速冷冻到一定的硬度，然后进行切片的一种方法.制作过程较石蜡切片快捷、简便，因多应用于手术中的快速病理诊断.一、取材：应尽可能快地采用新鲜的资料，防止组织发生死后变动.二、速冻：1、将组织块平放于软塑瓶盖或特制小盒内（直径约2cm）.2、如组织块小可适量加OCT包埋剂浸没组织，然后将特制小盒缓缓平放入盛有液氮的小杯内.3、当盒底部接触液氮时即开始气化沸腾，此时小盒坚持原位切勿浸入液氮中，年夜约10-20s组织即迅速冰结成块.4、在制成冻块后，即可置入恒冷箱切片机冰冻切片.5、若需要保管，应快速以铝箔或塑料薄膜封包，立即置入-80℃冰箱贮存备用.三、固定：1、样品托上涂一层OCT包埋胶，将速冻组织置于其上，4℃冰箱预冷5-10min让OCT胶浸透组织.2、取下组织置于锡箔或者玻片上，样品托速冻.3、组织置于样品托上，其上再添一层OCT胶，以完全覆盖为宜，速冻架（PE）上30min.四，切片：1、恒温冰冻切片机为较理想的冰冻切片机，其基本结构是将切片机置于高温密闭室内，故切片时不受外界温度和环境影响，可连续切薄片至5-10μm.2、切片时，高温室内温度以-15℃ ~ -20℃为宜，温渡过低组织易破碎，抗卷板的位置及角度要适当，载玻片附贴组织切片，切勿上下移动.3、切好室温放置30min后，入4℃丙酮固定5-10min，烘箱干燥20min.PBS洗5min×3.4、进行抗原热修复，微波热修复也可，室温自然冷却.可用3%H2O2孵育5-10min，消除内源性过氧化物酶的活性.五、免疫荧光染色：1、冰冻切片室温晾干15min，可用含10%正常山羊血清的PBS室温封闭切片1小时（此步可不洗）.2、滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液（抗体的量视组织年夜小而定，原则是可以均匀覆盖组织面，且保证整个过程中不会使组织干涸）.3、将切片放在加了PBS的免疫组化湿盒，室温孵育2小时或4℃过夜.4、第二天先将湿盒放到37℃回温1h，然后吸取片上的一抗进行回收，将切片拔出到小染缸PBS冲刷.5、滴加用PBS稀释好的二抗（避光）置于分子杂交箱中37℃孵育1小时.回收二抗，切片置于染缸内，PBS洗5min×3次.6、滴加DAPI工作液染核，室温10-20min（工作浓度0.1%染色15min）.7、回收DAPI，滴加5-10μl抗荧光衰减封片剂或中性树胶，用处置干净的盖玻片封片，即可到荧光显微镜或者共聚焦显微镜下观察拍照.8、做好的切片放在切片盒内，置于4℃冰箱，可保管一周左右.比较：。
石蜡切片、冰冻切片及振动切片的区别
石蜡切片、冰冻切片及振动切片的区别一、石蜡切片把修好的蜡块装在旋转切片机上，即可进行切片(section)。
切片必须保持切片刀锐利，切片厚度通常为5～7um，也可根据染色需要切成不同厚度，一般不旋转式切片机超过10um。
切好的蜡带，放人40℃左右的温水中将蜡片展平。
良好的切片应无刀痕、裂痕，切片厚度均一平整。
切片如有上述问题，在进行免疫组织化学染色时会出现假阳性现象。
为能得到平整无皱褶的组织切片。
可采用两次展片，即先将组织切片漂浮在30％的乙醇溶液中进行第一次展片，然后将切片捞起，再次放人45～50℃的水浴中进行第二次展片，乙醇的浓度和水温可视组织不同和石蜡熔点的高低自行调整。
此过程是利用乙醇溶液与水之间的张力差展开切片的皱褶。
为防止脱片，载玻片要涂黏片剂。
对HE染色的切片，可在载玻片上涂抹薄层蛋白甘油，但蛋白甘油因含蛋白易导致非特异性免疫反应，故用于免疫组织化学染色的切片常用多聚赖氨酸、3—氨丙基—乙氧基甲硅烷等处理。
二、冰冻切片冰冻切片(fiozen section)是酶组织化学和免疫组织化学染色中最常用的一种切片方法，其最突出的优点是能够较完好地保存细胞膜表面和细胞内多种酶活性以及抗原的免疫活性，尤其是细胞表面抗原更应采用冰冻切片。
新鲜组织和已固定的组织均可作冰冻切片。
为了得到高质量的冰冻切片，选择好的冰冻切片机和配套的一次性刀架是保证切片质量的关键。
组织在切片前需要冰冻，而冰冻过程容易使组织中的水分形成冰晶，从而影响抗原定位。
一般认为，冰晶体积大而量少时，影响较小；冰晶体积小而量多时，对组织结构损害较大。
含水量较多的组织中较易出现冰晶。
1．防止组织中冰晶形成的方法(1)速冻：使组织温度骤降，减少冰晶的形成。
方法包括：1)干冰—丙酮(乙醇)法：将150～200ml丙酮(无水乙醇)装入小保温杯内，逐渐加入干冰，直至饱和呈黏稠状，再加干冰不再冒泡时，温度可达-70℃，用一小烧杯内装异戊烷约50ml，将此烧杯缓慢置人干冰—丙酮(或无水乙醇)饱和液内，至异戊烷温度-70℃时即可使用。
石蜡切片、冰冻切片及振动切片的区别
石蜡切片、冰冻切片及振动切片的区别一、石蜡切片把修好的蜡块装在旋转切片机上，即可进行切片（sectio n）。
切片必须保持切片刀锐利，切片厚度通常为 5〜7um也可根据染色需要切成不同厚度，一般不旋转式切片机超过10um切好的蜡带，放人40C左右的温水中将蜡片展平。
良好的切片应无刀痕、裂痕，切片厚度均一平整。
切片如有上述问题，在进行免疫组织化学染色时会出现假阳性现象。
为能得到平整无皱褶的组织切片。
可采用两次展片，即先将组织切片漂浮在 30%的乙醇溶液中进行第一次展片，然后将切片捞起，再次放人45〜50C的水浴中进行第二次展片，乙醇的浓度和水温可视组织不同和石蜡熔点的高低自行调整。
此过程是利用乙醇溶液与水之间的张力差展开切片的皱褶。
为防止脱片，载玻片要涂黏片剂。
对HE染色的切片, 可在载玻片上涂抹薄层蛋白甘油，但蛋白甘油因含蛋白易导致非特异性免疫反应，故用于免疫组织化学染色的切片常用多聚赖氨酸、3—氨丙基一乙氧基甲硅烷等处理。
二、冰冻切片冰冻切片（fiozen section）是酶组织化学和免疫组织化学染色中最常用的一种切片方法，其最突出的优点是能够较完好地保存细胞膜表面和细胞内多种酶活性以及抗原的免疫活性，尤其是细胞表面抗原更应采用冰冻切片。
新鲜组织和已固定的组织均可作冰冻切片。
为了得到高质量的冰冻切片，选择好的冰冻切片机和配套的一次性刀架是保证切片质量的关键。
组织在切片前需要冰冻，而冰冻过程容易使组织中的水分形成冰晶，从而影响抗原定位。
一般认为，冰晶体积大而量少时，影响较小；冰晶体积小而量多时，对组织结构损害较大。
含水量较多的组织中较易出现冰晶。
1 •防止组织中冰晶形成的方法（1）速冻：使组织温度骤降，减少冰晶的形成。
方法包括：1）干冰一丙酮（乙醇）法：将150〜200ml丙酮（无水乙醇）装入小保温杯内，逐渐加入干冰，直至饱和呈黏稠状，再加干冰不再冒泡时，温度可达-70 C,用一小烧杯内装异戊烷约50ml，将此烧杯缓慢置人干冰一丙酮（或无水乙醇）饱和液内，至异戊烷温度-70 C时即可使用。
免疫组化(IHC)经验
免疫组化经验总（好假哟）一、石蜡切片和冰冻切片的比较？1.要求做冰冻切片的不一定能做石蜡切片，这是我向一老师请教得出的结论。
因为作石蜡切片时要高温烤片，可能会破坏组织的抗原性，如果组织的抗原性较稳定，则可作石蜡切片；但是要求做石蜡切片的，可作冰冻切片。
2.冰冻切片的优点是能够较好的保存组织的抗原免疫活性，做免疫组化时不需抗原修复这一步。
缺点是细胞内易形成冰晶而破坏细胞结构，可能会使抗原弥散；切片厚度较石蜡的厚，做的片子没石蜡的漂亮。
当你买一抗时，目录上都写着做什么样的切片，如果它写着只能做冰冻，就不能做石蜡，如写着两者都可，那就都能做。
3.石蜡切片的优点是可以保持组织细胞的形态结构，且容易存放在室温，而冰冻切片比较麻烦，一定要存在 -80℃的低温冰箱中，尤其是用来做原位杂交的切片，为了防止 RNA 降解，保存一贯很重要。
由于石蜡切片可以切到 4 μm 左右，所以原位杂交探针容易渗透到组织中去，容易成功，而且得到的颜色/形态都较冰冻切片好。
二、一抗的选择要点和技巧是什么？1.单克隆和多克隆抗体的选择。
由一种克隆产生的特异性抗体叫做单克隆抗体。
单克隆抗体能目标明确地与单一的特异抗原决定簇结合，就像导弹精确地命中目标一样。
另一方面，即使是同一个抗原决定簇，在机体内也可以由好几种克隆来产生抗体，形成好几种单克隆抗体混杂物，称为多克隆抗体。
在抗原抗体反应中，一般单克隆抗体特异性强，但亲和力相对小，检测抗原灵敏度相对就低；而多克隆抗体特异性稍弱，但抗体的亲和力强，灵敏度高，但易出现非特异性染色（可以通过封闭等避免）。
2.应用范围的选择。
有的一抗只能用于 WB （ Western blotting）或免疫组化、免疫荧光、免疫沉淀等；甚至表明石蜡切片或冰冻切片。
3.种属反应性的选择。
这一点很重要，表明这种抗体可能存在种属差异，且这种抗体适合检测哪种种属动物体内的抗原。
4.种属来源，一般兔来源的多是多克隆；而小鼠来源的多是单克隆，但也有另外。
甲状腺冰冻与石蜡切片的病理诊断价值观察
甲状腺冰冻与石蜡切片的病理诊断价值观察甲状腺冰冻与石蜡切片是当前常用的甲状腺病理诊断方法。
本文旨在探讨二者的优缺点及其在甲状腺病理学诊断中的应用。
一、甲状腺冰冻甲状腺冰冻是指在手术中取出甲状腺组织后，迅速将其放入低温液氮中冷冻并切片，然后用光学显微镜进行观察。
该方法不需要特殊设备，能够快速、准确地得到病理诊断结果，并指导术中的决策。
但其缺点也显而易见，冰冻后的组织结构变形实在难以避免，而且样本量也很小，易出现误差。
二、石蜡切片石蜡切片是指在标本固定后，将其放置于福尔马林中，然后用石蜡浸渍，再进行定型、切片、染色等步骤，最终形成切片。
这种方法需要专门的设备和技术，执行较为复杂。
但由于石蜡切片保持了组织结构的原貌，能够更好地反映真实的病理情况，而且样本量也较大，误差较小。
三、甲状腺冰冻与石蜡切片的优缺点比较甲状腺冰冻和石蜡切片两种方法各有优缺点。
在实际的诊断中，应根据患者的具体情况来选择策略。
甲状腺冰冻具有快速、实时、准确的特点，能够帮助外科医生做出更好的治疗决策，减少手术并发症的发生。
石蜡切片技术则更能反映真实组织结构，需要较长时间的制备和分析，但诊断效果更好。
甲状腺冰冻和石蜡切片是甲状腺病理学诊断中两种主要的方法。
二者的应用范围几乎相同，都可以用于良性和恶性疾病的鉴别诊断、淋巴结转移的检测、肿瘤的类型、大小、浸润范围的评估等方面。
此外，甲状腺冰冻可以在术中快速得出结果，以指导手术的决策，而石蜡切片则可用于病理诊断和医学研究。
综上所述，甲状腺冰冻和石蜡切片都是常用的甲状腺病理学诊断方法，各有其独特的优缺点。
在诊断过程中，应根据患者的具体情况来选择采用哪种方法，以期待得出更准确的诊断结果。
石蜡切片与冰冻切片的优缺点
两种切片我都做得比较多。
相比之下，我更喜欢石蜡切片。
石蜡切片的最突出优点是标本可以长期保存。
在这次试验结束的若干年后，还可以用来做别的指标。
对于比较珍贵的标本，如罕见的临床标本，石蜡切片是比较好的选择。
我觉得石蜡标本的好坏取决于固定的质量。
个人认为组织块不宜过大，固定时间不宜过长。
我的经验是取火柴头大的组织，4%多聚甲醛或10%福尔马林4摄氏度固定3-4小时。
固定时间太长的话，蛋白质的肽链过度扭曲，抗原决定族被缠绕包裹，不容易做出结果。
石蜡切片的主要缺点是不适合做荧光。
我也不知道为什么，反正我老板是这么说的。
可能是由于石蜡有自发荧光的缘故。
我也试过用石蜡切片做荧光，效果还可以。
可是文章中这么做的确实很少。
冰切相对简单，容易出结果。
大多数人是用新鲜组织直接冰切，然后丙酮固定。
这样做虽然省事，可固定完了以后要马上漂洗、孵抗体或染色，不能让切片晾干，不然形态会非常糟糕。
我喜欢先用4%多聚甲醛或10%福尔马林固定，然后蔗糖脱水，再切片。
这样虽然麻烦一些，可切片的形态会好很多。
切片可以晾干，而且在4摄氏度下可以保存1-2个月。
千万不能放-20度保存，否则会有严重的冰晶，切记。
冰冻切片最大的问题还是标本不能长期保存，要现取现做。
适合用于容易获取的动物标本。
chengjinxiang wrote:做冰冻切片的组织可以是直接放在液氮里直接冻存的组织吗？石蜡切片前的福尔马林固定的组织过大会怎么样，我们因为自己没有机器通常是把组织扔到甲醛里直到有一定量和有足够多标本才去包蜡块这样对组化结果有什么影响？做冰切的组织可以先在液氮中长期保存。
而且经过液氮冻存的组织冰切后的形态特别漂亮，一点儿冰晶都没有。
不过保存之前要先用OCT包埋。
切片之前要把冰切机预冷到工作温度（-20度以下）。
包埋块从液氮中一拿出来就要放进冰切机中，不能让包埋块融化，否则还是会出现严重的冰晶。
做HE染色的话，组织固定时间长一点儿没关系。
但如果做免疫组化的话，固定时间就不能太长。
冰冻切片与石蜡切片的区别
1．冰冻切片是免疫组织化学染色中最经常使用的一种切片方法.其最突出的长处是能够较残缺地保管多种抗原的免疫活性，特别是细胞概况抗原更应采取冰冻切片.新颖的组织及已固定的组织均可作冰冻切片.之杨若古兰创作冰冻时，组织中水份易构成冰晶，常常影响抗原定位.普通认为冰晶少而大时，影响较小，冰晶小而多时，对组织结构损害较大，在含水量较多的组织中上述景象更易发生.冰晶的大小与其生长速率成反比，而与成核率（构成速率）成反比，即冰晶构成的数量愈多则愈小，对组织结构影响愈严重.是以，应尽量降低冰晶的数量.Fish认为冰冻开始时，冰晶成核率较慢，当前逐步添加，其临界温度为-33.C,从-30.C 降至-43.C之间，成核率急剧添加达1018，然后再减慢.基于上述理论可采纳以下措施减少冰晶的构成.（1）速冻，使组织温度骤降，缩短从-33.C43.C的时间，减少冰晶的构成.其方法有二：①干冰-丙酮（酒精）法：将150-200ml丙酮（酒精）装入小保温杯内，逐步加入干冰，直至饱和呈黏稠状，再加干冰不再昌泡时，温度可达-70℃C，用一小烧杯（50-100ml）内装异戊烷约50ml，再将烧杯缓慢置入干冰丙酮（纯酒精）饱和液内，至异戊烷温度达-70℃时即可使用.将组织（大小为1cm×0.8cm×0.5cm）投入异戊烷内速冻30-60s后取出，或置恒冷箱内以备切片，或置-80℃低温冰箱内储存.②液氮法：将组织块平放于软塑瓶盖或特制小盒内（直径约2cm），如组织块小可适量加OCT包埋剂浸没组织，然后将特制小盒缓缓平放入盛有液氮的小杯内，当盒底部接触液氮时即开始气化沸腾，此时小盒坚持原位切勿浸入液氮中，大约10-20s组织即敏捷冰结成块.取出组织冰块立即置入-80℃冰箱储存备用，或置入恒冷箱切片机冰冻切片.（2）将组织置于20%-30%蔗糖溶液1～3天，利用高渗接收组织中水分，减少组织含水量.影响冰冻切片的身分较多，是以，技术难度较大，选择好的冰冻切片机是包管切片质量的关键.目前冰冻切片机有两类：①恒慢冰冻切片机（Cryastat）：为较理想的冰冻切片机，型号很多，但其基本结构是将切片机置于-30℃C低温密闭室内，故切片时不受外界温度和环境影响，可连续切薄片至2-4μm，完整能满足免疫组织化学标识表记标帜请求.切片时，低温室内温度以-15℃～18℃为好，温度过低组织易破碎，抗卷板的地位及角度要适当，载玻片附贴组织切片，切勿上下挪动.②开放式冰冻切片机：包含半导体致冷切片机和甲醇致冷切片和老式的CO2、氯乙烷等冷冻切片机.切片时流露空气中，温度不容易控制，切片技术难度大，在高温季节，切片更加困难，且切片厚8～15μm，不容易连续切片，但其长处是价廉，国内有生产.冰冻切片后如不染色，必须吹干，储存低温冰箱内，或进行短暂预固定后储存冰箱保管.2．石蜡切片其长处是组织结构保管良好，在病理和回顾性研讨中有较大的实用价值，能切连续薄片，组织结构清晰，抗原定位精确.用于免疫组化技术的石蜡切片制备与惯例制片略有分歧：①脱水、透明等过程应在4℃.C下进行，以尽量减少组织抗原的损失.②组织块大小应限于2cm×1.5cm×0.2cm，使组织充分脱水、透明、浸蜡.③浸蜡、包埋过程中，石蜡应坚持在60℃以下，以溶点低的软蜡最好（即低温石蜡包埋）.组织块脱水、透明、浸蜡时间参考表1-3：表1-3 组织块处理时间表1 70%乙醇4℃ 3～4h2 80%乙醇4℃ 3～4h3 90%乙醇4℃ 2～3h4 95%乙醇Ⅰ 4℃ 2～3h5 95%乙醇Ⅱ 4℃ 1～2h8 二甲苯Ⅰ 4℃ 0.5～1h9 二甲苯Ⅱ 4℃ 0.5１～1h10 石蜡Ⅰ 60℃ 1h11 石蜡Ⅱ 60℃ 2h以上全过程为18-24h，也可在室温内使用主动脱水机代替.如组织块小，直径小于0.5cm，可用快速石蜡包埋切片，全过程只需4h摆布.石蜡切片为惯例制片技术，切片机多为轮转式，切片厚度2～7μm，利用范围广，不影响抗体的穿透性，染色均匀分歧.因为甲醛固定、无机熔剂和包埋剂对组抗原有必定的损害及掩蔽，使抗原特征发生改变.有人陈述经蛋白酶消化，可以改善光镜免疫组化染色强度，经常使用的有胰蛋白酶、链霉蛋白酶及胃蛋白酶等消化法.石蜡切片应入37℃恒温箱过夜，如许烤片可减少染色中脱片景象.切片如需持久储存，可存放于4℃冰箱内备用.石蜡切片长处较多，但在制片过程中要经过酒精、二甲苯等无机溶剂处理，组织内抗原活性失去较多，有人采取冷冻干燥包埋法（Freeze drying embedding methed），可以保管组织内可溶性物资，防止蛋白变性和酶的失活，从而减少了抗原的丢失.该法是将新颖组织低温速冻，利用冷冻干燥机（Freezing dryer）在真空、低温条件下排除组织内水分，然后用甲醛蒸气固定干燥的组织，最初将组织浸蜡、包埋、切片.此法可用于免疫荧光标识表记标帜、免疫酶标识表记标帜及放射自显影.。
石蜡切片和冷冻切片
石蜡切片战热冻切片——愚愚分出有收会系列之阳早格格创做正在构造真验中，构造切片战热冻切片是最罕睹的二种切片要收，二种劣缺面明隐，正在真验的应用上也大有分歧.而二个真验的相共面皆是应用免疫教基根源基本理——即抗本与抗体特同性分离的本理，通过化教反应使标记表记标帜抗体的隐色剂隐色去决定构造细胞内蛋黑量，对于其举止定位、定性及相对于定量的钻研.一、石蜡切片构造教惯例造片技能中最为广大应用的要收.石蜡切片出有但是用于瞅察仄常细胞构造的形态结构，也是病理教战法医教等教科用以钻研、瞅察及推断细胞构造的形态变更的主要要收，而且也已相称广大天用于其余许多教科范围的钻研中.1、牢固：将新陈构造切成小块，牢固于4%多散甲醛过夜.凝固构造中的物量身分，尽大概脆持其活体时的结构.共时能使构造硬化，有好处切片的举止.2、脱火：为了缩小构造资料的慢遽中断，应使用从矮浓度到下浓度递加的程序举止经70%、85%、95%曲至杂酒粗（无火乙醇），屡屡时间为1小时.牢固后的构造资料需与消留正在构造内的牢固液及其结晶重淀，可则会做用后期的染色效验.3、透明：时常使用的透明剂有二甲苯，二甲苯是石蜡的溶剂.杂酒粗出有克出有及与石蜡相溶，还需用能与酒粗战石蜡相溶的溶剂，替换出构造内的酒粗.资料块正在透明剂浸渍历程称透明.4、浸蜡：先把构造资料块搁正在熔化的石蜡战二甲苯的等量混同液浸渍1小时.先后移进2个熔化的石蜡液中浸渍1小时安排.5、包埋：以少许热蜡液将其底部赶快揭附于包埋盒内上，而后置于速冻台，让石蜡牢固.6、切片：切片刀的钝利与可、蜡块硬度是可适合皆间接做用切片品量，可将蜡块至于热火中改变蜡块硬度.常常切片薄度为5微米，用毛笔沉托沉搁正在37度火浴中展片.7、揭片与烤片：将火浴中展片捞至玻片上铺正，而后将载玻片搁进37℃温箱中搞燥.8、切片脱蜡及火化：搞燥后的切片置于二甲苯中举止脱蜡，而后依次使用从下浓度到矮浓度递减的程序举止经杂酒粗、95%、85%、70%举止火化.9、染色：典范的苏木粗战伊黑：细胞核被苏木粗染成紫蓝色，普遍细胞量及非细胞身分被伊黑染成粉黑色.真验支配简朴.免疫组化：指戴隐色剂标记表记标帜的特同性抗体正在构造细胞本位通过抗本抗体反应战构造化教的呈色反应.二、冰冻切片：冰冻切片是一种正在矮温条件下使构造赶快热冻到一定的硬度，而后举止切片的一种要收.创造历程较石蜡切片快速、烦琐，果多应用于脚术中的赶快病理诊疗.一、与材：应尽大概快天采与新陈的资料，预防构造爆收死后变更.二、速冻：1、将构造块仄搁于硬塑瓶盖大概特造小盒内（曲径约2cm）.2、如构造块小可适量加OCT包埋剂浸出构造，而后将特造小盒慢慢仄搁进衰有液氮的小杯内.3、当盒底部交战液氮时即启初气化沸腾，此时小盒脆持本位切勿浸进液氮中，约莫10-20s构造即赶快冰结成块.4、正在造成冻块后，即可置进恒热箱切片机冰冻切片.5、若需要保存，应赶快以铝箔大概塑料薄膜启包，坐时置进-80℃冰箱贮存备用.三、牢固：1、样品托上涂一层OCT包埋胶，将速冻构造置于其上，4℃冰箱预热5-10min让OCT胶浸透构造.2、与下构造置于锡箔大概者玻片上，样品托速冻.3、构造置于样品托上，其上再加一层OCT胶，以真足覆盖为宜，速冻架（PE）上30min.四，切片：1、恒温冰冻切片机为较理念的冰冻切片机，其基础结构是将切片机置于矮温稀关室内，故切片时出有受中界温度战环境做用，可连绝切薄片至5-10μm.2、切片时，矮温室内温度以-15℃ ~ -20℃为宜，温度过矮构造易破碎，抗卷板的位子及角度要适合，载玻片附揭构造切片，切勿上下移动.3、切佳室温搁置30min后，进4℃丙酮牢固5-10min，烘箱搞燥20min.PBS洗5min×3.4、举止抗本热建复，微波热建复也可，室温自然热却.可用3%H2O2孵育5-10min，与消内源性过氧化物酶的活性.五、免疫荧光染色：1、冰冻切片室温晾搞15min，可用含10%仄常山羊血浑的PBS室温启关切片1小时（此步可出有洗）.2、滴加适合比率稀释的一抗大概一抗处事液（抗体的量视构造大小而定，准则是不妨匀称覆盖构造里，且包管所有历程中出有会使构造搞涸）.3、将切片搁正在加了PBS的免疫组化干盒，室温孵育2小时大概4℃过夜.4、第二天先将干盒搁到37℃回温1h，而后吸与片上的一抗举止回支，将切片拔出到小染缸PBS浑洗.5、滴加用PBS稀释佳的二抗（躲光）置于分子杂接箱中37℃孵育1小时.回支二抗，切片置于染缸内，PBS洗5min×3次.6、滴加DAPI处事液染核，室温10-20min（处事浓度0.1%染色15min）.7、回支DAPI，滴加5-10μl抗荧光衰减启片剂大概中性树胶，用处理搞洁的盖玻片启片，即可到荧光隐微镜大概者共散焦隐微镜下瞅察拍照.8、搞佳的切片搁正在切片盒内，置于4℃冰箱，可保存一周安排.对于比：。
石蜡切片和冰冻切片都适合质谱成像分析
石蜡切片和冰冻切片都适合质谱成像分析
石蜡切片和冰冻切片都是质谱成像分析中常用的技术。
它们各自具有优点，可以根据实验需求进行选择。
石蜡切片法是将组织样本固定在石蜡块中，然后用切片机切成非常薄的切片(通常在20-50微米之间)。
这种方法的优点在于其切割厚度均匀，可以提供高质量的细胞和组织的图像。
此外，由于使用的是石蜡作为固定剂，因此可以得到长期保存的切片。
石蜡切片也有其缺点。
石蜡本身是一种有机物质，可能会对某些生物分子产生影响。
石蜡切片需要经过一系列复杂的处理步骤，包括脱水、包埋、切片等，这可能增加实验的复杂性和时间成本。
相比之下，冰冻切片法则是在冷冻状态下快速切割生物组织并立即冻结以保留其完整性。
这种方法的优点在于它可以提供实时观察的活体细胞和组织结构，对于研究动态过程非常有用。
此外，冰冻切片不需要使用石蜡或其他固定剂，因此不会对生物分子产生影响。
然而，冰冻切片也有其挑战。
由于是在冷冻状态下进行切割，因此切片的质量可能受到冷冻损伤的影响。
此外，冰冻切片需要在极短的时间内完成，这可能对切片机的性能要求较高。
石蜡切片和冰冻切片都适合质谱成像分析，选择哪种方法取决于具体
的实验需求。
如果需要长期保存的高质量图像，或者需要研究静态结构和三维形态，那么石蜡切片可能是更好的选择。
而如果需要实时观察活体细胞和组织结构，或者对时间敏感，那么冰冻切片可能更合适。
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石蜡切片和冷冻切片——傻傻分不清楚系列
在组织实验中，组织切片和冷冻切片是最常见的两种切片方法，两种优缺点明显，在实验的应用上也大有不同。
而两个实验的相同点都是应用免疫学基本原理——即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂显色来确定组织细胞内蛋白质，对其进行定位、定性及相对定量的研究。
一、石蜡切片
组织学常规制片技术中最为广泛应用的方法。
石蜡切片不仅用于观察正常细胞组织的形态结构，也是病理学和法医学等学科用以研究、观察及判断细胞组织的形态变化的主要方法，而且也已相当广泛地用于其他许多学科领域的研究中。
1、固定：将新鲜组织切成小块，固定于4%多聚甲醛过夜。
凝固组织中的物质成分，尽可
能保持其活体时的结构。
同时能使组织硬化，有利于切片的进行。
2、脱水：为了减少组织材料的急剧收缩，应使用从低浓度到高浓度递增的顺序进行经70%、85%、95%直至纯酒精（无水乙醇），每次时间为1小时。
固定后的组织材料需除去留在组织内的固定液及其结晶沉淀，否则会影响后期的染色效果。
3、透明：常用的透明剂有二甲苯，二甲苯是石蜡的溶剂。
纯酒精不能与石蜡相溶，还需用能与酒精和石蜡相溶的溶剂，替换出组织内的酒精。
材料块在透明剂浸渍过程称透明。
4、浸蜡：
先把组织材料块放在熔化的石蜡和二甲苯的等量混合液浸渍1小时。
先后移入2个熔化的石蜡液中浸渍1小时左右。
5、包埋：以少许热蜡液将其底部迅速贴附于包埋盒内上，然后置于速冻台，让石蜡固定。
6、切片：切片刀的锐利与否、蜡块硬度是否适当都直接影响切片质量，可将蜡块至于冷水中改变蜡块硬度。
通常切片厚度为5微米，用毛笔轻托轻放在37度水浴中展片。
7、贴片与烤片：将水浴中展片捞至玻片上铺正，然后将载玻片放入37℃温箱中干燥。
8、切片脱蜡及水化：干燥后的切片置于二甲苯中进行脱蜡，然后依次使用从高浓度到低浓度递减的顺序进行经纯酒精、95%、85%、70%进行水化。
9、染色：
经典的苏木精和伊红：细胞核被苏木精染成紫蓝色，多数细胞质及非细胞成分被伊红染成粉红色。
实验操作简单。
免疫组化：指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应。
二、冰冻切片：
冰冻切片是一种在低温条件下使组织快速冷冻到一定的硬度，然后进行切片的一种方法。
制作过程较石蜡切片快捷、简便，因多应用于手术中的快速病理诊断。
一、取材：应尽可能快地采取新鲜的材料，防止组织发生死后变化。
二、速冻：
1、将组织块平放于软塑瓶盖或特制小盒内（直径约2cm）。
2、如组织块小可适量加OCT包埋剂浸没组织，然后将特制小盒缓缓平放入盛有液氮的小杯内。
3、当盒底部接触液氮时即开始气化沸腾，此时小盒保持原位切勿浸入液氮中，大约10-20s 组织即迅速冰结成块。
4、在制成冻块后，即可置入恒冷箱切片机冰冻切片。
5、若需要保存，应快速以铝箔或塑料薄膜封包，立即置入-80℃冰箱贮存备用。
三、固定：
1、样品托上涂一层OCT包埋胶，将速冻组织置于其上，4℃冰箱预冷5-10min让OCT胶浸透组织。
2、取下组织置于锡箔或者玻片上，样品托速冻。
3、组织置于样品托上，其上再添一层OCT胶，以完全覆盖为宜，速冻架（PE）上30min。
四，切片：
1、恒温冰冻切片机为较理想的冰冻切片机，其基本结构是将切片机置于低温密闭室内，故切片时不受外界温度和环境影响，可连续切薄片至5-10μm。
2、切片时，低温室内温度以-15℃~ -20℃为宜，温度过低组织易破碎，抗卷板的位置及角度要适当，载玻片附贴组织切片，切勿上下移动。
3、切好室温放置30min后，入4℃丙酮固定5-10min，烘箱干燥20min。
PBS洗5min×3。
4、进行抗原热修复，微波热修复也可，室温自然冷却。
可用3%H2O2孵育5-10min，消除内源性过氧化物酶的活性。
五、免疫荧光染色：
1、冰冻切片室温晾干15min，可用含10%正常山羊血清的PBS室温封闭切片1小时（此步可不洗）。
2、滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液（抗体的量视组织大小而定，原则是可以均匀覆盖组织面，且保证整个过程中不会使组织干涸）。
3、将切片放在加了PBS的免疫组化湿盒，室温孵育2小时或4℃过夜。
4、第二天先将湿盒放到37℃回温1h，然后吸取片上的一抗进行回收，将切片插入到小染缸PBS冲洗。
5、滴加用PBS稀释好的二抗（避光）置于分子杂交箱中37℃孵育1小时。
回收二抗，切片置于染缸内，PBS洗5min×3次。
6、滴加DAPI工作液染核，室温10-20min（工作浓度0.1%染色15min）。
7、回收DAPI，滴加5-10μl抗荧光衰减封片剂或中性树胶，用处理干净的盖玻片封片，即可到荧光显微镜或者共聚焦显微镜下观察拍照。
8、做好的切片放在切片盒内，置于4℃冰箱，可保存一周左右。
对比：。