鱼类肌肉蛋白的提取
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实验二鱼类肌肉蛋白的提取、蛋白含量测定及其
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测
一、实验目的和内容
(一)目的:
1.了解从动物组织中提取蛋白的原理和实验方法;
2.熟悉蛋白质含量测定的各种方法和基本原理,并根据实验结果,比较不同种类的鱼肌肉中水溶性蛋白和盐溶性蛋白含量的差异;
3.掌握SDS-PAGE的原理和垂直板型凝胶电泳的操作方法,并根据电泳结果,比较不同种类的鱼肌肉中水溶性蛋白和盐溶性蛋白成分的差异。
(二)内容:
1.利用机械破碎和高速离心分离等手段,从不同种类的鱼肌肉中提取水溶性蛋白和盐溶性蛋白;
2.采用紫外吸收法测定以上各蛋白提取液中的总蛋白含量;
3.对以上蛋白提取液进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测,并利用凝胶成像系统软件对电泳结果进行分析。
二、实验原理
蛋白质在组织或细胞中一般都以复杂的混合物形式存在,每种类型的细胞都含有上千种不同的蛋白质,因此,蛋白质的提取、分离和鉴定工作是生物工程中一项十分艰巨的任务。要想分离提纯某一特定的蛋白,首先必须把蛋白质从组织活细胞中以溶解的状态释放出来。为此,动物组织或动物细胞可用电动捣碎机或匀浆器破碎,细菌和植物细胞可用超声破、高压挤压或砂研磨等方法进行破碎。
鱼类肌肉蛋白按溶解性分为水溶性蛋白质(如各种蛋白水解酶)和盐溶性蛋白质(如肌原纤维蛋白质)。
肌肉组织中含有多种蛋白质,具有不同的电荷、形状和分子量。强阴离子表面活性剂SDS与还原剂并用,通过加热使蛋白质解离,大量的SDS结合蛋白质,使其带相同密度的负电荷和规则的椭圆形状。在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)上,不同蛋白质的迁移率仅取决于分子量。采用考马斯亮蓝快速染色,可及时观察电泳分离效果。根据电泳结果,可比较不同种类的鱼肌肉中水溶性蛋白和盐溶性蛋白成分的差异。
三、实验步骤
(一)鱼肌肉蛋白的提取
1.称取新鲜的淡水鱼和海水鱼肉各6g,用刀切碎,分别加入30 ml 冰冷的Bufffer I (20mM Tris-Cl, pH8.0),在捣碎机中捣碎成匀浆。
2.将以上匀浆转入50ml 离心管中,在4℃下,10000×g,离心15min,将上清和沉淀分开。
3.上清用四层纱布进行过滤除去脂肪,滤液即水溶性蛋白提取液(留样1(1.5ml)、量体积、测蛋白含量、SDS化)
4.在以上沉淀中,加入30 ml 冰冷的蒸馏水,重悬沉淀,在4℃下,10000×g,离心15min,取沉淀。
5.重复操作4二次。
6.在以上沉淀中,加入30 ml 冰冷的Buffer II(Buffer I含有0.5M NaCl),重悬沉淀,再次用组织捣碎机进行捣碎。
将以上匀浆转入50ml 离心管中,在4℃下,8000×g,离心15min,将上清和沉淀分开。上清即为盐溶性溶性蛋白提取液(留样2(1.5ml)、量体积、测蛋白含量、SDS化)。
(二)蛋白含量测定——紫外吸收法
(三)蛋白提取液的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析
1.聚丙烯酰胺凝胶的配制
(1)分离胶(12%)的配制(10ml):
ddH2O 3.3 ml
30%储备胶 4.0 ml
1.5M Tris-HCl(pH8.8)
2.5 ml
10% SDS 0.1 ml
10% AP 0.1 ml
TEMED 4 μl
混匀后灌入玻璃板间,以水封顶,注意使液面平(凝胶完全聚合需30-60min)。
(2)积层胶的配制(5ml):
ddH2O 3.4 ml
30%储备胶0.83 ml
1M Tris-HCl(pH6.8)0.63 ml
10%SDS 0.05 ml
10%AP 0.05 ml
TEMED 5 μl
将分离胶上的水倒去,加入上述混合液,立即将梳子插入玻璃板间(完全聚合需15-30mim)。
2.样品处理:将样品(以上水溶性蛋白液/盐溶性蛋白液)加入等量的2×SDS上样缓冲液,100℃加热5min,离心12000g×1min,取上清作SDS-PAGE分析,同时将SDS 分子量蛋白标准品作平行处理。
1.上样:分别取10μl处理后的样品加入样品池中,并加入6μl蛋白标准品作对照。
2.电泳:在电泳槽中加入1 电泳缓冲液,连接电源,注意正负极接向。电泳时,刚开始电压控制在90V,当样品到达分离胶后,可将电压调至180V,电泳至溴酚兰行至电泳槽下端停止。
3.染色:将胶从玻璃板中小心取出,用考马斯亮兰染色液染色。
4.脱色;将胶从染色液中取出,放入脱色液中,脱色至蛋白带清晰。
5.凝胶摄像和保存:在图像处理系统下将脱色好的凝胶摄像,并利用系统软件分析实验结果,凝胶可保存于双蒸水中或7%乙酸溶液中。