直接电化学酶传感器的研究进展

第32卷第5期2009年10月

辽宁科技大学学报

Journal of University of Science and Technology Liaoning

Vol.32No.5

Oct.,2009直接电化学酶传感器的研究进展

张 静,顾婷婷

(辽宁科技大学化学工程学院,辽宁鞍山 114051)

摘 要:电化学生物传感器是电化学、电分析化学以及生物学等多学科交叉的产物,是一种全新的检测仪

器,具有快速、灵敏和价廉等特点,在食品发酵工业、临床医学、环境监测、军事等领域有着重要的应用价值。

简述了电化学生物传感器的基本原理和分类、电流型生物传感器的发展和特点以及直接电子转移的基本原

理,并深入探讨了基于纳米材料等各种新型功能材料的直接电化学酶生物传感器的研究进展。

关键词:生物传感器;酶电极;直接电化学

中图分类号:Q503:O629 8 文献标识码:A 文章编号:1674 1048(2009)05 0460 07

生物传感器(Biosensor)是一类特殊的化学传感器,通过各种物理、化学型信号转换器捕捉目标物与敏感基元之间的反应,然后将反应的程度用离散或连续的信号表达出来,从而得出被测物的浓度[1]。1962年Clark和Lyons首次提出生物传感器这一概念[2],经过多年的研究与开发,已成为生物技术中的一个独立门类。生物传感器技术是发展生物技术必不可少的一种先进的检测方法与监控方法,也是物质分子水平的快速、微量分析方法。生物传感器具有多样性、无试剂分析、操作简便、灵敏、快速、价廉、可重复连续使用等特点,已在食品发酵工业、临床医学、环境监测、军事科学等领域展现出十分广阔的应用前景[3-8]。

目前,生物传感器中研究成果较多的是电化学生物传感器。电化学生物传感器(见图1)是以生物活性物质为敏感基元,以电化学电极为信号转换器,以电势、电流或电容为特征检测信号的生物传感器。其原理是,被分析物扩散进入固定化生物敏感膜层,经分子识别,发生生物化学反应,产生的信息继而被相应的化学换能器或物理换能器转换成可定量和可处理的电信号,再经过二次仪表(检测放大器)放大并输出,便可得到待测物浓度。电化学生物传感器根据分子识别元件的不同,可分为酶传感器、微生物传感器、细胞传感器、组织传感器和免疫传感器等;按照换能器的不同分为电位型、电流型、电导型和电容型等生物传感器。其中,电流型生物传感器具有较宽的线性范围和表观米氏常数(K m)以及高灵敏度,引起人们广泛关注[9,10]。

图1 电化学生物传感器的构成及工作原理示意图

F ig.1 Schematic diagram of configuration and principle of an electrochemical biosensor

收稿日期:2009 07 10。

基金项目:教育部留学回国人员科研启动资金资助(2008)。

作者简介:张静(1983-),女,辽宁朝阳人

1 电流型生物传感器

1 1 电流型生物传感器工作原理

电流型生物传感器的发展历经了三代,葡萄糖氧化酶(GOD)电极的工作原理最具代表性。

第一代电流型生物传感器是以Clark 的酶电极为代表的经典酶电极。其用酶的天然电子传递体 氧来沟通与电极之间的电子通道,直接检测酶反应底物的减少或产物的生成。原理如图2a 。酶层中的反应方程

GOD(FAD)+glucose gluconolactone+GOD(FADH 2)

GOD(FADH 2)+O 2 GOD(FAD)+H 2O 2

电极中的反应方程

O 2+2H ++2e - H 2O 2

或H 2O 2 O 2+2H ++2e

-

图2 三代电化学酶传感器电子转移机理

Fig.2 Electron transfer mechanism o f three generations electrochemical enzyme sensor

第二代电流型生物传感器为介体酶传感器(介体酶电极)。采用氧化还原电子媒介体取代氧分子在酶的氧化还原活性中心与电极之间传递电子,解决了对氧的依赖和电极活性的干扰问题。原理如图2b 。酶层中的反应方程

GOD(FAD)+glucose gluconolactone+GOD(FADH 2)

GOD(FADH 2)+M ox GOD(FAD)+M red

电极中的反应方程

M re d M ox +n H ++n e -

第三代电流型生物传感器为直接电化学酶传感器(直接电化学酶电极),是酶的氧化还原活性中心和电极表面直接交换电子的酶传感器(直接电化学)。主要用于解决酶等生物识别元件与电极之间的低效率的通讯问题。原理如图2c 。酶层中的反应方程

GOD(FAD)+glucose gluconolactone+GOD(FADH 2)

电极中的反应方程

GOD(FADH 2) GOD(FAD)+n e -

由于第一代的经典酶电极的检测电位比较高,一些电化学活性物质如抗坏血酸、尿酸、乙酰氨基酚等对其干扰较大,因而限制了它的广泛应用

[11,12]。第二代的介体酶传感器虽然降低了检测电位,但是电子媒介体的加入产生了电极制作复杂、媒介体污染电极、测量电位较正、电活性物质干扰测定等问题[13,14];第三代的直接电化学酶传感器固定化相对简单,在选择性、灵敏度和测试范围等方面都有新的!461!第5期 张静,等:直接电化学酶传感器的研究进展

突破。在理论上,酶与电极之间直接电子传递过程更接近生物氧化还原系统的原始模型,为揭示生物氧化还原过程的机理奠定了基础;在应用方面,酶直接电化学的实现可用于发展人工心脏用的生物燃料电池。因此,直接电化学酶传感器的研究具有重要意义[11,12]。

1 2 氧化还原酶在电极上的直接电子转移原理

氧化还原酶在电极上的直接电子转移须满足条件:(1)固定过程中保持酶的结构和活性;(2)酶的活性中心与电极间的距离足够小以保证两者间的电子转移。根据M arcus 关于电子转移的理论,在受体 供体之间的电子转移速率k et [15]

k et ∀e

[- (d-d 0)]e -( G 0+ )24RT (1)式中: G 0表示生成氧化还原产物吉布斯自由能的变化, 是重组能,d 0是范德华距离,d 是受体 供体

间的实际距离, 是电子耦合常数。由式(1)可以看出,电子受体和供体间的距离d 是控制电子转移速率k et 的重要因素。蛋白质或酶的活性中心和电极可以被看作一对电子受体 供体,因此,只有当活性中心处于电极表面足够近的区域时,才能发生直接电子转移。

2 几种直接电化学酶传感器

近些年来,关于蛋白质或酶在电极表面的直接电化学研究主要集中在酶的功能材料的使用和有效固定上。天然酶的分子量一般较大,结构比较复杂,电活性中心被蛋白本体封闭,很难接近电极表面,不易实现酶和电极表面的直接电子转移。很多新的功能性材料被研究用于酶直接电化学传感器,例如,纳米材料[16-

34]、溶胶凝胶复合材料[35-40]、室温离子溶液[41-44]、复合生物材料[45-50]和无机介孔材料[51,52]等。其中,纳米材料由于具有良好的生物兼容性,有利于酶的固定,并能够促进电子的转移,因此受到极大地关注,我国学者在这方面已经走到了国际前沿。

2 1 基于纳米材料的直接电化学酶电极

纳米碳管(CNT)因其完美的石墨结构而具有良好的导电性、催化活性和较大的比表面积等,更为人注目的是其有效地降低了氧化还原蛋白的过电位,从而有力地促进了直接电子转移,因此,被广泛用于第三代生物传感器的制备[16-21]。以固定GOD 为例,许多研究者利用CNT 修饰电极获得了GOD 的直接电子转移。都柏林城市大学的Luo 等人将GOD 固定在包含有金纳米颗粒的壳聚糖(CH I)膜中,然后固定在CNT 修饰的玻碳电极(GC)表面,从而制得了用于检测葡萄糖的无电子媒介体的第三代电流型生物传感器,其葡萄糖的检测线性范围为4#10-5-1#10-3mol/L,检出限为2#10-5mol/L [19]。杰克逊州立大学的Zhang 等将葡萄糖氧化酶溶液pH 调至3 8,此时GOD 带正电荷,可与CNT 层层组装GO x /CNT [20]。GOD 在多层膜内能够实现直接电子转移。利用GOD 的直接电化学性质对葡萄糖进行检测,当组装1个双层时,线性范围为1#10-2-0 1mol/L ;组装5个双层时,线性范围为1#10-3-4#10-2mol/L,控制组装层数可对葡萄糖的检测范围讲行调控。清华大学的Liu 等人利用具有独特物理、化学以及电子特征的半导体碲化镉量子点与CNT 协同作用,制备了具有更高敏感度的第三代葡萄糖传感器[21]。

金纳米颗粒的比表面积大、表面自由能高以及生物相容性良好,可以增加生物材料固定的稳定性和有效保持固定生物材料的活性,并可改进生物酶与基体电极之间的电子传导能力,实现酶与基体电极之间的直接电子转移,因此,广泛应用于固定酶和促进电子转移[22-29]。以固定血红蛋白(Hb)为例,东南大学的Wang 等人将金纳米颗粒自组装在丙基三乙氧基硅烷的表面修饰氧化铟锡电极上,并利用其制

备了血红蛋白酶纳米生物传感器[27]。实验结果表明,Hb 与电极表面之间的直接电子转移速率常数k s

为(2 39∃0 7)s -1,并且催化H 2O 2的能力大大增加,检测限为3 4!m 。武汉大学的Yang 等通过构筑有序的三维金纳米线阵列实现Hb 的固定[28]。此法制备的传感器对H 2O 2具有很好的催化还原能力,

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