钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ和胞外信号调节激酶对高脂血症大鼠勃起功能障碍影响实验研究论文

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SOX5_对大鼠成骨细胞增殖及核因子-资B_信号通路的影响

[收稿日期]2021-08-25　[修回日期]2022-09-23[基金项目]湖北省卫生健康委2021-2022年度青年人才项目(WJ2021F032)[作者简介]冷冬月(1985-),女,硕士,主治医师.[文章编号]1000⁃2200(2024)02⁃0146⁃06㊃基础医学㊃SOX5对大鼠成骨细胞增殖及核因子⁃κB 信号通路的影响冷冬月1,李旭峰2,方兴刚1(1.湖北省十堰市太和医院中西医结合科,442000;2.湖北省十堰市人民医院中医科,442000)[摘要]目的:探究Y⁃box 蛋白5(SOX5)对大鼠成骨细胞(OB)增殖及核因子⁃κB(NF⁃κB)信号通路的影响㊂方法:取新生24h SPF 级SD 乳鼠,应用酶消化法分离大鼠颅骨OB㊂形态学观察和ALP 染色鉴定成骨细胞;取生长良好的第4代OB,分为空白对照组㊁pcDNA3.1组㊁pcDNA⁃SOX5组㊁si⁃NC 组㊁siRNA⁃SOX5组㊂转染48h 后qRT⁃PCR 检测细胞中SOX5mRNA 的表达;MTT 法检测细胞增殖活力;ALP 活性检测试剂盒测量ALP 活性;茜素红染色观察钙结节的形成情况;Western blotting 检测OB 分化及NF⁃κB 信号通路相关蛋白Runt 相关转录因子2(Runx2)㊁Ⅰ型胶原蛋白(Collagen Ⅰ)㊁NF⁃κB p65及其磷酸化蛋白㊁KB 抑制蛋白激酶α(IκBα)㊁肿瘤坏死因子α(TNF⁃α)的表达㊂结果:与空白对照组相比,pcDNA⁃SOX5组大鼠OB 中SOX5mRNA 水平㊁p⁃NF⁃κB p65/NF⁃κB p65㊁TNF⁃α蛋白表达显著升高(P <0.05),OB 增殖活力㊁ALP 活性㊁钙化结节数量和面积㊁Runx2㊁Collagen Ⅰ㊁IκBα表达显著降低(P <0.05);siRNA⁃SOX5组大鼠OB 中SOX5mRNA 水平㊁p⁃NF⁃κB p65/NF⁃κB p65㊁TNF⁃α蛋白表达明显降低(P <0.05),OB 增殖活力㊁ALP 活性㊁钙化结节数量和面积㊁Runx2㊁Collagen Ⅰ㊁IκBα表达明显升高(P <0.05)㊂结论:SOX5具有调控OB 增殖㊁分化的作用,其作用机制可能与调控NF⁃κB 信号通路有关㊂[关键词]骨质疏松;Y⁃box 蛋白5;成骨细胞;核因子⁃κB[中图法分类号]R 681 [文献标志码]A DOI :10.13898/ki.issn.1000⁃2200.2024.02.002Effects of SOX5on rat osteoblast proliferation and NF⁃κB signaling pathwayLENG Dongyue 1,LI Xufeng 2,FANG Xinggang 1(1.Department of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine ,Taihe Hospital ,Shiyan Hubei 442000;2.Department of Traditional Chinese Medicine ,Shiyan People′s Hospital ,Shiyan Hubei 442000,China )[Abstract ]Objective :To explore the effects of Y⁃box protein 5(SOX5)on rat osteoblasts (OB)proliferation and nuclear factor κB (NF⁃κB)signaling pathway.Methods :The newborn 24h SPF grade SD suckling rats were taken,and the OB of the rat skull was separated by enzyme digestion method.Morphological observation and ALP staining were used to identify osteoblasts.The fourth generation OBs with good growth were divided into blank control group,pcDNA3.1group,pcDNA⁃SOX5group,si⁃NC group,and siRNA⁃SOX5group.After 48h of transfection,qRT⁃PCR was used to detect the expression of SOX5mRNA in the cells;MTT method was used to detect cell proliferation viability;ALP activity detection kit was used to measure ALP activity;alizarin red staining was used to observe the formation of calcium nodules;Western blotting was used to detect OB differentiation and the expression of NF⁃κB signaling pathway⁃related proteins [Runt⁃related transcription factor 2(Runx2),type Ⅰcollagen (collagen Ⅰ),nuclear factor κB p65(NF⁃κB p65)and its phosphorylated protein,KB inhibits protein kinase α(IκBα),tumor necrosis factor α(TNF⁃α)].Results :Compared with the blank control group,the SOX5mRNA level,p⁃NF⁃κB p65/NF⁃κB p65,and TNF⁃αproteins expression in the OB of rats in the pcDNA⁃SOX5group were significantly increased (P <0.05),the OB proliferation activity,ALP activity,the number and area of calcified nodules,Runx2,collagen Ⅰ,and IκBαexpression were significantly reduced (P <0.05);the SOX5mRNA level,p⁃NF⁃κBp65/NF⁃κB p65,and TNF⁃αproteins expression in the OB of rats in the siRNA⁃SOX5group were significantly reduced (P <0.05),the OB proliferation activity,ALP activity,the number and area of calcified nodules,Runx2,collagen Ⅰ,and IκBαexpression were significantly increased (P <0.05).Conclusions :SOX5can regulate the proliferation and differentiation of OB,and its mechanism may be related to the regulation of NF⁃κB signaling pathway.[Key words ]osteoporosis;Y⁃box protein 5;osteoblasts;nuclear factor⁃κB 骨质疏松症(OP)是一种骨代谢疾病,其特征在于骨量下降,伴随着骨组织和微结构的恶化以及骨矿物质密度的下降[1]㊂在OP 中,骨形成与吸收之间的不平衡最终导致了骨的变性和易骨折[2]㊂成骨细胞(osteoblasts,OB)是一类特殊的具有成骨潜能的细胞,在骨重建及骨稳态维持中都发挥着重要的作用[3];OB活性下降是OP的主要原因[4]㊂Y⁃box蛋白5(SOX5)是SOX家族SoxD组的成员,编码控制细胞命运的各种转录因子并在许多谱系中进行分化,包括神经元㊁软骨细胞和B细胞[5-7]㊂研究[8-9]表明SOX5与类风湿关节炎和软骨形成密切相关,是治疗绝经后OP的有希望的分子靶标㊂已经在卵巢切除小鼠的骨髓细胞中发现了差异表达的SOX5;且与绝经前健康女性的骨髓样本相比,绝经后OP病人骨髓中SOX5的mRNA和蛋白表达水平显著上调;SOX5过表达可抑制人间充质干细胞的成骨分化[10]㊂而SOX5对OB增殖的分子功能及作用机制尚不明确;因此,本研究以大鼠OB为对象,探讨SOX5对OB增殖的影响及其潜在的作用机制,为OP的治疗及药物开发提供参考㊂1　材料与方法1.1　实验材料　出生24h的SPF级SD乳鼠10只,雌雄不限,质量(10±3)g,由北京维通利华实验动物技术有限公司提供,许可证为SCXK(京)2019⁃0009㊂饲养温度(20±2)℃,相对湿度为45%~60%㊂胎牛血清㊁胰蛋白酶㊁RPMI1640培养基均购自美国GIBCO公司;TRIzol RNA分离试剂及SYBR®Premix Ex Taq TM 试剂盒均购买于日本TaKaRa公司;Lipofectamine TM 2000转染试剂盒购自美国Thermo公司;pcDNA⁃SOX5和pcDNA3.1载体㊁siRNA⁃SOX5和其阴性对照(si⁃NC)以及PCR引物序列由上海GenePharma 公司设计合成;氯化十六烷基吡啶鎓(美国Sigma⁃Aldrich,货号:C9002);碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)检测试剂盒(P0321S)㊁MTT试剂盒(C0009S)购自碧云天生物科技公司;茜素红染色试剂(北京索莱宝科技有限公司,货号:G8550);兔抗大鼠Runt相关转录因子2(runt⁃related transcription factor2,Runx2)(ab236639)㊁Ⅰ型胶原蛋白(CollagenⅠ)(ab270993)㊁核因子⁃κB p65 (nuclear factor kappa⁃B p65,NF⁃κB p65) (ab16502)㊁p⁃NF⁃κB p65(ab76302)㊁肿瘤坏死因子α(TNF⁃α)(ab205587)㊁KB抑制蛋白激酶α(KB inhibits protein kinaseα,IκBα)(ab109300)㊁山羊抗兔IgG H&L(HRP)(ab205718)㊁β⁃actin(ab8227)均购自英国abcam公司㊂细胞培养箱(美国Thermo Fisher Scientific公司);ABI Prism®7300型荧光定量PCR系统(美国);倒置荧光显微镜(IX73,购自日本Olympus公司);iMark680多功能酶标仪㊁蛋白转膜装置购自美国Bio⁃Rad公司㊂1.2　成骨细胞的分离、鉴定　应用酶消化法分离大鼠颅骨成骨细胞[11]㊂取新生24h内SD乳鼠,处死后,乙醇浸泡5min,在无菌条件下,取出头盖骨,PBS冲洗后切成1mm3的骨颗粒,37℃水浴中用0.1%的胶原酶以1∶10的比例将骨颗粒消化分离20min,然后再次用胶原酶分离约1h㊂将分离获得的悬浮液以1200r/min离心,去上清液,用PBS漂洗3次,并加入含有15%胎牛血清㊁青霉素(100U/mL)和链霉素(100U/mL)的培养液㊂在37℃㊁5%CO2下孵育,1周换液2次,待细胞融合约80%时传代,换用成骨诱导培养基(基础培养基+50μg/mL维生素C+10mmol/Lβ⁃甘油磷酸钠+10nmol/L地塞米松)㊂取第3代细胞通过ALP染色和形态观察行成骨细胞鉴定,取生长良好的第4代细胞用于实验㊂鉴定成骨细胞:(1)形态学观察:在倒置相差显微镜下观察原代和继代培养成骨细胞的生长和形态变化,并在随机选择的视野中拍照㊂(2)ALP染色:将第3代的成骨细胞培养7d,并参照ALP染色试剂盒的说明进行ALP染色㊂去除成骨细胞的培养基,PBS清洗细胞2~3次,并用4%多聚甲醛固定10min㊂清洗后加入300μL显色液,避光于37℃的培养箱中孵育2h,显微镜下观察㊂1.3　分组及转染　取生长良好的第4代成骨细胞,按每孔2×106个接种于24孔板,分成5个处理组:(1)空白对照组,不进行任何转染;(2)pcDNA3.1组,用Lipofectamine2000按照说明书将100nmol/L pcDNA3.1转染至成骨细胞;(3)pcDNA⁃SOX5组,用Lipofectamine2000按照说明书将100nmol/L pcDNA⁃SOX5转染至成骨细胞;(4)si⁃NC组,将si⁃NC转染至成骨细胞;(5)siRNA⁃SOX5组,将siRNA⁃SOX5转染至成骨细胞㊂转染48h后收获细胞以进行后续实验㊂1.4　qRT⁃PCR检测细胞中SOX5mRNA的表达　使用TRIzol试剂提取细胞总RNA,使用分光光度计测量总RNA的浓度㊂按照试剂盒说明书将RNA反转录为cDNA,进行PCR扩增(见表1)㊂反应体系(20μL):cDNA(200ng/μL)2μL,SYBR®Premix Ex Taq TM(2×)10μL,上下游引物各0.4μL,ddH2O7.2μL㊂循环条件:94℃持续10min,然后在94℃持续10s,60℃持续20s和72℃持续1min进行40个循环㊂用β⁃actin作为对照,相对SOX5mRNA的表达量采用2-ΔΔCt方法计算㊂表1　RT⁃PCR引物序列基因引物序列SOX5F:5′⁃CAG CCA GAG TTA GCA CAA TAG G⁃3′R:5′⁃CTG TTG TTC CCG TCG GAG TT⁃3′β⁃actinF:5′⁃TTG CGT TAC ACC CTT TCT TG⁃3′R:5′⁃TGT CAC CTT CAC CGT TCC A⁃3′1.5　MTT法检测细胞增殖活力　转染48h后将成骨细胞以2×103细胞/孔的浓度接种到96孔板中,继续培养24h,然后每孔中加入20μL的MTT溶液(5mg/mL),于培养箱中孵育4h,吸去上层清液后加入150μL的DMSO, 490nm波长处测定各孔吸光度值(OD),计算细胞增殖率㊂细胞增殖率=(实验组OD值-空白孔OD 值)/(对照组OD值-空白孔OD值)×100%㊂1.6　ALP活性测定　ALP是成骨细胞分化的早期标志㊂将转染的成骨细胞用成骨培养基培养7d㊂然后,除去OM培养基,并使用0.1%TritonX⁃100裂解细胞获得细胞裂解液,然后12000g离心10min,取上清液为样品㊂使用ALP活性检测试剂盒测量上清液中ALP活性㊂于405nm处测定各组OD值,使用对硝基苯酚绘制标准曲线;另用BCA法测定每个样品的总蛋白浓度㊂并将每个样品的ALP活性标准化为相应的总蛋白含量㊂1.7　茜素红染色　采用茜素红染色观察钙结节的形成数量,评估成骨细胞的矿化能力㊂成骨细胞按1.3方法进行分组处理,转染后将细胞培养2周,弃去培养液,细胞用PBS洗涤2次,并在室温下用4%多聚甲醛固定30min㊂弃去多聚甲醛,PBS洗涤后在37℃下用0.1%茜素红染液染色1h㊂倒置光学显微镜下观察图像并拍照,并使用Image⁃Pro Plus6.0软件统计钙化结节染色阳性区域的面积和数量㊂1.8　Western blotting检测成骨细胞NF⁃κB信号通路相关蛋白的表达　使用RIPA裂解液提取细胞中蛋白质㊂使用BCA试剂盒对蛋白质浓度进行定量㊂取等量蛋白质样品上样(每泳道30μg),10%SDS⁃PAGE分离蛋白质,并通过半干转移将其转移到PVDF膜上㊂将膜用5%脱脂牛奶封闭,并在4℃下与一抗(Runx2㊁CollagenⅠ㊁NF⁃κB p65㊁p⁃NF⁃κB p65㊁TNF⁃α㊁IκBα㊁β⁃actin,1∶1000)孵育过夜㊂第2天,将膜与偶联辣根过氧化物酶的二抗孵育(1∶2000)2h,然后使用化学发光试剂盒(ECL)进行显色㊂以β⁃actin为内参,分析结果㊂1.9　统计学方法　以上所有实验均重复3次㊂采用单因素方差分析(One⁃way ANOVA),Tukey的事后检验用于单因素方差分析后的成对比较㊂2　结果2.1　成骨细胞原代培养和鉴定　原代培养第3天,倒置相差显微镜下见成骨细胞从碎骨块周围爬出,呈放射状贴壁生长,形态不规则,呈多边形或三角形,有较多突起,单核卵圆形, 1~2个核仁,胞质丰富清晰,ALP染色呈阳性,蓝黑色颗粒沉积在细胞质及细胞核ALP活性部位(见图1)㊂2.2　各组成骨细胞中SOX5mRNA的表达　与空白对照组相比,pcDNA⁃SOX5组大鼠OB 中SOX5mRNA水平显著升高(P<0.05),siRNA⁃SOX5组大鼠OB中SOX5mRNA水平明显降低(P <0.05)(见表2)㊂表2　各组大鼠OB中SOX5mRNA水平比较(x±s;n i=3)分组SOX5mRNA空白对照组 1.00±0.00 pcDNA3.1组 1.02±0.01 pcDNA⁃SOX5组 4.65±0.37*si⁃NC组 1.01±0.01 siRNA⁃SOX5组0.41±0.05* F315.94 P<0.01 MS组内0.028 q检验:与空白对照组比较*P<0.052.3　各组成骨细胞增殖活力　与空白对照组相比,pcDNA⁃SOX5组大鼠OB增殖活力显著降低(P <0.05),siRNA⁃SOX5组大鼠OB 增殖活力明显升高(P <0.05)(见表3)㊂表3　各组大鼠OB 增殖活力比较(x ±s ;n i =3)分组增殖率/%空白对照组100.00±0.00pcDNA3.1组102.13±10.01pcDNA⁃SOX5组64.75±6.16*si⁃NC 组104.06±9.31siRNA⁃SOX5组137.31±7.42* F144.83 P<0.01 MS 组内55.976 q 检验:与空白对照组比较*P <0.052.4　各组成骨细胞ALP 活性　与空白对照组相比,pcDNA⁃SOX5组大鼠OB中ALP 活性显著降低(P <0.05),siRNA⁃SOX5组大鼠OB 中ALP 活性明显升高(P <0.05)(见表4)㊂表4　各组大鼠OB 中ALP 活性比较(x ±s ;n i =3)分组ALP 活性空白对照组 1.00±0.00pcDNA3.1组 1.03±0.08pcDNA⁃SOX5组0.75±0.05*si⁃NC 组 1.02±0.06siRNA⁃SOX5组1.54±0.09* F 60.49 P<0.01 MS 组内0.004 q 检验:与空白对照组比较*P <0.052.5　各组成骨细胞钙结节形成情况　倒置显微镜下观察可见细胞呈多层重叠生长,各组细胞间均可见橘红色钙化结节;与空白对照组相比,pcDNA⁃SOX5组大鼠OB 钙化结节数量和面积显著降低(P <0.05),siRNA⁃SOX5组大鼠OB 钙化结节数量和面积明显增加(P <0.05)(见图2㊁表5)㊂2.6　各组成骨细胞分化及NF⁃κB 信号通路相关蛋白的表达　与空白对照组相比,pcDNA⁃SOX5组大鼠OB 中p⁃NF⁃κB p65/NF⁃κB p65㊁TNF⁃α蛋白表达显著升高,Runx2㊁Collagen Ⅰ㊁IκBα表达显著降低(P <0.05),siRNA⁃SOX5组大鼠OB 中p⁃NF⁃κB p65/NF⁃κB p65㊁TNF⁃α蛋白表达明显降低,Runx2㊁Collagen Ⅰ㊁IκBα表达明显增加(P <0.05)(见图3㊁表6)㊂3　讨论 OB 是骨形成的主要功能单位,负责骨骼重塑过程中骨骼基质的合成㊁分泌和矿化㊂OB 在维持骨量和减少骨质流失中起关键作用㊂刺激OB 增殖并促进其分化成熟是调节骨代谢㊁促进新骨形成㊁修复骨缺损的重要方法[12]㊂MTT 法是检测细胞增殖的指标,可以反映生活细胞的代谢水平㊂本研究采用MTT 法检测SOX5对OB 增殖活性的影响,结果显示SOX5mRNA 过表达后,对体外培养的OB 增殖有明显的抑制作用,而采用siRNA 技术干扰SOX5的表达后,OB 增殖率明显增加;表明沉默SOX5具有促进OB 增殖的作用㊂ OB 的增殖通常通过测量细胞总蛋白㊁ALP 活性和Collagen Ⅰ分泌来评估㊂ALP 是OB 分泌的一组膜结合糖蛋白,是OB 早期分化的特异性标志,ALP 活性的高低,能较客观地反映OB 分化成熟的程度[13]㊂Runx2㊁Collagen Ⅰ是OB 相关的蛋白,在成骨分化活动中起重要的促进作用[4],在增殖阶段,OB 分泌Collagen I 以帮助矿化并减少骨质流失㊂OB 分化成熟后多层重叠生长形成结节样结构,并不断分泌基质和矿物质,形成矿化结节㊂茜素红染色可以评估成骨分化晚期细胞外基质矿化情况钙化结节的形成情况[14]㊂本实验中,将转染的OB 用成骨培养基培养7d 后,通过ALP 活性检测了SOX5对OB 分化的影响,结果显示SOX5过表达后,ALP 活性值较低,OB 钙化结节数量和面积降低,且Runx2㊁Collagen Ⅰ表达减少,分析可能与细胞增殖㊁分化受到抑制有关;而SOX5mRNA 表达下调时,ALP 活性㊁细胞钙化程度及Runx2㊁CollagenⅠ表达增加㊂分析沉默SOX5促进成骨细胞ALP活性的原因可能是:(1)与促进细胞增殖有关,OB数量的增加,分泌的ALP也随之增加;(2)上调ALP mRNA表达水平,促进ALP的分泌,调节OB的分化㊂表5　各组大鼠OB钙结节形成情况(x±s;n i=3)分组钙化结节数量钙化结节面积/mm2空白对照组898.62±51.4360.54±5.71 pcDNA3.1组901.05±72.6161.12±5.63 pcDNA⁃SOX5组616.47±60.54*33.28±4.17* si⁃NC组895.09±58.3062.35±4.24 siRNA⁃SOX5组1174.81±73.42*89.76±6.79* F28.7041.08 P<0.01<0.01 MS组内4074.34729.154 q检验:与空白对照组比较*P<0.05表6　各组大鼠OB分化及NF⁃κB信号通路相关蛋白的表达(x±s;n i=3)分组Runx2CollagenⅠ　p⁃NF⁃κB p65/NF⁃κB p65　IκBαTNF⁃α空白对照组0.98±0.10 1.12±0.11　0.49±0.04　0.89±0.080.32±0.02 pcDNA3.1组 1.01±0.09 1.10±0.10*0.51±0.050.91±0.070.31±0.03 pcDNA⁃SOX5组0.66±0.07*0.74±0.07* 1.28±0.11*0.40±0.05*0.87±0.06* si⁃NC组0.99±0.06 1.08±0.090.52±0.070.88±0.040.34±0.04 siRNA⁃SOX5组 1.25±0.08* 1.31±0.12*0.33±0.04* 1.22±0.06*0.16±0.03* F20.0312.8892.2768.09150.30 P<0.01<0.01<0.01<0.01<0.01 MS组内0.0070.0100.0050.0040.001 q检验:与空白对照组比较*P<0.05 NF⁃κB控制主要骨骼细胞类型(破骨细胞[15]㊁成骨细胞[16]和软骨细胞[17])的分化或活性㊂生理和病理性骨重塑的刺激都会影响NF⁃κB信号转导[18];NF⁃κB的启动子活性主要是由核移位和NF⁃κB磷酸化引起[19]㊂在静息细胞中,NF⁃κB以NF?κB/IκBα复合物的形式存在于细胞质;在病理条件下,刺激激活核因子抑制剂IκB激酶(IκB kinases, IKKs),该激酶通过靶向将IκBα蛋白降解,释放NF⁃κB并允许其核移位和DNA结合,促进TNF⁃α㊁IL⁃1β等炎性因子的表达,减少骨细胞形成,使OB增殖㊁分化能力降低㊂研究发现NF⁃κB的激活下调OB分化[20];抑制IκBα的降解,稳定NF⁃κB/IκBα复合物,可抑制NF⁃κB的活化,减少炎性因子的释放[21-22]㊂HUANG等[23]发现在人牙槽骨OB分化中,三七皂苷R1可通过抑制NF⁃κB通路,逆转TNF⁃α诱导的钙结节和ALP活性的降低㊂杨青坡等[24]发现姜黄素能降低骨组织中NF⁃κB表达,明显改善OP大鼠骨密度㊂在本研究中,我们通过pcDNA3.1质粒转染构建SOX5过表达OB,发现大鼠OB中磷酸化NF⁃κB p65㊁TNF⁃α蛋白表达升高, IκBα表达降低,说明NF⁃κB信号通路被激活;而沉默SOX5的表达后,IκBα表达增加,磷酸化NF⁃κB p65㊁TNF⁃α表达降低,提示NF⁃κB信号通路被抑制㊂综上所述,沉默SOX5具有促进OB增殖的作用,并可调节OB的分化,其作用机制可能与抑制NF⁃κB信号通路的激活有关,过表达SOX5则发挥相反作用㊂但本研究尚存在一定不足,未对NF⁃κB 信号通路进行干扰从反面进行验证;此外,由于体内外环境的巨大差异,在体内沉默SOX5是否发挥相同的作用,有待进一步研究㊂[参考文献][1]　MENG YC,LIN T,JIANG H,et al.miR⁃122exerts inhibitoryeffects on osteoblast proliferation/differentiation in osteoporosis byactivating the PCP4⁃Mediated JNK pathway[J].Mol Ther NucleicAcids,2020,20:345.[2]　杨菁,聂子淮,滕斌,等.基于FRAX风险评估的分层管理在社区老年骨质疏松症病人中的应用研究[J].蚌埠医学院学报,2022,47(2):254.[3]　CHOTIYARNWONG P,MCCLOSKEY EV.Pathogenesis ofglucocorticoid⁃induced osteoporosis and options for treatment[J].Nat Rev 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钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ在维拉帕米逆转肺腺癌顺铂化疗耐药中的作用

钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ在维拉帕米逆转肺腺癌顺铂化疗耐药中的作用刘淼;范平生;张腾跃;黄金;樊高飞;刘亚贝【摘要】目的探讨钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)在维拉帕米逆转肺腺癌顺铂化疗耐药中的作用.方法在肺腺癌细胞系(A549)中,采用CCK-8法检测维拉帕米逆转顺铂耐药的能力,采用流式细胞仪Annexin V-FITC/PI法检测维拉帕米逆转顺铂耐药中凋亡水平的效果,采用Western blotting检测逆转耐药过程中P-CaMKⅡ/CaMKⅡ蛋白表达水平的变化.结果在肺腺癌细胞系(A549)中,单药顺铂组、顺铂联合维拉帕米组的细胞增长抑制率分别为(55.00±2.60)％、(32.30±1.80)％,差异有统计学意义(P＜0.05).凋亡实验表明,单药顺铂组细胞凋亡率为10.30％,顺铂联合维拉帕米组为21.60％,差异有统计学意义(P＜0.05).Western blotting结果显示,在A549细胞中,顺铂联合维拉帕米组P-CaMKⅡ/CaMKⅡ的表达明显低于单药顺铂组.结论在肺腺癌细胞中,CaMKⅡ参与维拉帕米逆转化疗耐药的过程.【期刊名称】《实用临床医药杂志》【年(卷),期】2019(023)010【总页数】4页(P5-8)【关键词】肺腺癌;维拉帕米;顺铂;耐药性;钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ【作者】刘淼;范平生;张腾跃;黄金;樊高飞;刘亚贝【作者单位】安徽省肿瘤医院,中国科学技术大学附属第一医院,中国科学技术大学生命科学与医学部,安徽合肥,230000;安徽省肿瘤医院,中国科学技术大学附属第一医院,中国科学技术大学生命科学与医学部,安徽合肥,230000;安徽省肿瘤医院,中国科学技术大学附属第一医院,中国科学技术大学生命科学与医学部,安徽合肥,230000;安徽省肿瘤医院,中国科学技术大学附属第一医院,中国科学技术大学生命科学与医学部,安徽合肥,230000;安徽省肿瘤医院,中国科学技术大学附属第一医院,中国科学技术大学生命科学与医学部,安徽合肥,230000;安徽省肿瘤医院,中国科学技术大学附属第一医院,中国科学技术大学生命科学与医学部,安徽合肥,230000【正文语种】中文【中图分类】R734.2目前，早期肺癌仍缺乏有效的诊断手段，大多数肺癌患者初诊时已为中、晚期，错过了根治性治疗的机会[1]。

植物蛋白磷酸酶2C结构和功能的研究现状与进展

浙江大学学报（农业与生命科学版）47（1）：11~20，2021Journal of Zhejiang University (Agric.&Life Sci.)http ：///agr E -mail ：zdxbnsb @植物蛋白磷酸酶2C 结构和功能的研究现状与进展陈耘蕊，毛志君，李兆伟，范凯*（福建农林大学农学院，作物遗传育种与综合利用教育部重点实验室，福州350002）摘要蛋白磷酸酶是蛋白质可逆磷酸化过程中2个关键酶之一，蛋白磷酸酶2C （protein phosphatase 2C,PP2C ）是蛋白磷酸酶的重要成员。

PP2C 是一类丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶，可以调控真核生物细胞生命活动。

PP2C 成员主要参与激素信号转导途径，尤其可作为脱落酸信号途径的关键调节因子，能响应各种生物和非生物胁迫，在器官发育和种子萌发等方面也具有重要的促进作用。

在不同的植物中也发现了越来越多的PP2C 成员，该酶在不同的植物、不同的生长环境以及不同的生理活动中均有不同的调控方式，这也是目前及今后对PP2C 成员的研究方向。

本文主要介绍了植物PP2C 家族的结构特点、亚细胞定位及其在生长发育、激素信号转导、逆境胁迫方面的研究现状，以及在提高植物生物产量、促进果实发育等方面的新进展。

关键词蛋白磷酸酶2C ；植物生长发育；激素信号转导；胁迫响应中图分类号Q 945文献标志码AResearch status and progress in structure and function of protein phosphatase 2C in plants.Journal of Zhejiang University (Agric.&Life Sci.),2021,47(1):11-20CHEN Yunrui,MAO Zhijun,LI Zhaowei,FAN Kai *(Key Laboratory of Ministry of Education for Genetics,Breeding and Multiple Utilization of Crops,College of Agriculture,Fujian Agriculture and Forestry University,Fuzhou 350002,China )Abstract Protein phosphatase is one of the two key enzymes in the process of protein reversible phosphorylation.Protein phosphatase 2Cs (PP2Cs)are the important members of protein phosphatases.They are attributed to serine/threonine protein phosphatases (STPs)and can regulate the life activities of eukaryotic cells.PP2C members play an important role in hormone signal transduction pathways,especially abscisic acid (ABA)signal pathways;they can respond to various biotic and abiotic stresses,and also regulate organ development and seed germination.Recently,more and more PP2C members are found in plants.The regulation mechanisms of the PP2C members are diverse in different plants,different growth environments,and different physiological activities.The related research is an important topic.This review mainly introduces the structural characteristics,and subcellular localization of PP2C family in plants,and the research progresses in plant growth and development,hormone signal transductions,and stress responses,as well as in aspects of improving plant biological yield and promoting fruit development.Key words protein phosphatase 2C;plant growth and development;hormone signal transduction;stress responseDOI ：10.3785/j.issn.1008-9209.2020.05.291基金项目：国家自然科学基金（31701470）；中国博士后科学基金（2017M610388，2018T110637）；福建农林大学杰出青年科研人才计划（xjq201917）。

CaMKⅡ对心肌细胞影响的研究进展

世界中西医结合杂志２１０２年第７卷第２期
ＷｏｄＪｕｌｆｎｅｔｄＴａｉｏａａｄＷｅｔｎＭｄｃｎ２１，ｏ７Ｎ．ｒｏｍａｏｔｅｒｄｔｎ１ｎｓｒｅｉｉｅ０２Ｖ１，ｏ２ｌＩ￣ａｉｅ．
・１７・７
胞后除极，而诱发恶性室性心律失常，ａ从ＣＭＫⅡ是
转录因子促进心肌肥大，主要包括ＡＰ活化转录Ｎ、
因子一１ｃＭＰ反应元件结合蛋白（Ａｅｐｎｅ、ＡｃＭＰｒｓｏｓｅｍｎｂｎｉｇｐｏｉ，ＲＢ以及心肌细胞增强因ｌｅｔｉｄｎｒｔｎＣＥ）ｅｅ子２ｍｏｙｅｅｈｎｅ￣ｃｒ，）（ｙｃｔｎａｃｒｔＭＥ等。ＣＭＫｏ２ａ
件下早期后除极和尖端扭转型心动过速的发生率，
研究证明Ｊ钙调蛋白（ａ是ｃ信号变化的重，ＣＭ）ａ
要感受器，是Ｃｎ调节蛋白及转录反应的重要效也ａ
应器。钙调素依赖性蛋白激酶 Ⅱ（ａＣＭＫⅡ）调节能基因的转录表达，信号传导和调节心脏功能中的在作用与其异构体的亚细胞定位有关。ＣＭＫⅡ的活ａ性和表达程度在心律失常、肌肥厚、肌细胞凋心心亡的发生中起着非常重要的作用。
时，心律失常的发生率也明显升高。蔡少艾等、Ｃｂｎｔ实验结果显示，丙肾上腺素磷酸化ＲＲｕａｌ０３异ｙ２所致的心律失常可能与ＣＭＫⅡ系统有关。ａ

生物小综述钙离子第二信使-

Ca2+在信号传导中对植物生理的影响一、摘要本文简要分析Ca2+在信号传导中作为第二信使配合钙调蛋白和钙依赖型蛋白激酶的机制原理，并概述其对植物生长生理的影响。

二、关键词：Ca2+钙调素 CDPK 第二信使三、引言我们知道，矿质元素对植物的生长发育和生理过程起着重要作用，Ca2+就是其中最为重要的离子之一。

Ca2+既是植物细胞壁的重要组成部分，大部分Ca2+在细胞壁中与果胶酸形成果胶酸钙，起支持和加固作用；Ca2+对维持膜结构的稳定性也有一定作用；同时，Ca2+作为第二信使配合钙调蛋白和CDPK在植物生理的信号传导过程中具有重要作用。

四、正文1、钙稳态在静息态的胞质中Ca2+浓度≤0.1μmol/L，而通常在细胞壁、ER、液泡、线粒体中的浓度会高2~5个数量级。

细胞壁是植物细胞的最大钙库[1]。

细胞中各处的钙离子浓度梯度在未受刺激时是保持相对稳定的，当受到刺激时，由于胞外Ca2+浓度高与胞内，此平衡就会被打破。

信号分子与受体结合通常引起跨膜的离子流动，从而引起膜电位的改变。

在质膜上，存在Ca2+通道，类似于水通道，引起Ca2+的内流；同时存在Ca2+泵，是Ca2+外流的通道。

在胞内钙库如液泡、ER等结构的膜上也存在相应的结构，其上的Ca2+通道是从钙库流向胞质的通道，Ca2+泵、Ca2+/nH+反向运输体是Ca2+从胞质流向钙库的通道。

因此细胞质中的游离Ca2+的浓度主要受质膜和内膜系统上的Ca2+通道和Ca2+泵的调节。

任何一种外界刺激或激素所引起的细胞反应通过Ca2+作为第二信使传递的直接证据是细胞质中是否有游离Ca2+的浓度变化。

2、Ca2+的作用方式有两种：第一种是游离Ca2+的浓度直接或间接影响植物的生理过程；第二种是胞质里的Ca2+与钙结合蛋白，如钙调蛋白CaM（也叫钙调素）、钙依赖型蛋白激酶（CDPK）结合而起作用。

3、钙调素3.1 钙调素( Calmodulin, CaM)是一种分布最广，功能最重要的钙依赖性调节蛋白。

咬合干扰大鼠咬肌线粒体钙超载的离子变化特征及其钙调蛋白激酶Ⅱ的调节机制

咬合干扰大鼠咬肌线粒体钙超载的离子变化特征及其钙调蛋白激酶Ⅱ的调节机制曾林;刘静【摘要】目的探明咬合干扰作用下大鼠咬肌组织线粒体钙离子浓度与细胞外钠离子浓度的变化特点,探讨钙调蛋白激酶Ⅱ(CaMK Ⅱ)对线粒体“钙超载”现象的调控机制.方法在SD大鼠右侧上颌第一磨牙咬合面粘接直径0.6 mm钢丝段,建立咬合干扰大鼠模型,实验组分为3、7、14、21d及去除咬合干扰后3d组,并设立对照组.应用苏木精-伊红(HE)染色法观察咬肌组织形态学的变化;应用荧光分光光度法检测咬肌线粒体钙离子浓度;应用6-氢氧化锑钾直接比浊法检测咬肌肌纤维细胞外钠离子浓度;应用Western blotting技术检测咬肌组织p-CaMK Ⅱ(Thr286)/CaMK Ⅱ表达水平.结果与对照组比较,建模3、7、14和21 d实验组咬合干扰侧咬肌线粒体Ca2+浓度持续升高(P＜0.05),去除咬合干扰后3d组Ca2+浓度显著下降且低于正常对照组(P＜0.05).建模3d组、7d组、14d组及21 d组细胞外Na+浓度持续升高(P＜0.05),去除咬合干扰后3d组Na+浓度显著降低(P＜0.05).建模3d、7d 和14 d实验组咬合干扰侧p-CaMK Ⅱ(Thr286)/CaMK Ⅱ表达水平持续升高(P＜0.05),但其表达水平在建模21d组下降且低于对照组水平(P＜0.05),去除干扰3d 组表达水平显著下降且低于21 d组(P＜0.05).非咬合干扰侧变化趋势同干扰侧趋势一致,但干扰侧变化更显著(P＜0.05).结论咬合干扰可使大鼠咬肌线粒体Ca2+和胞浆Na+浓度升高,引发“钙超载”;线粒体Ca2+浓度升高与CaMK Ⅱ磷酸化水平相关,提示其对线粒体“钙超载”具有负反馈调节作用.【期刊名称】《南方医科大学学报》【年(卷),期】2018(038)006【总页数】6页(P755-760)【关键词】线粒体钙超载;咬合干扰;咬肌;钙调蛋白激酶2;咀嚼肌功能紊乱【作者】曾林;刘静【作者单位】暨南大学口腔医学院;暨南大学华侨医院口腔科,广东广州510630;暨南大学口腔医学院修复学教研室,广东广州510632【正文语种】中文钙离子是细胞凋亡信号中关键的第二信使，而线粒体凋亡途径是细胞凋亡发生的核心［1］。

从内质网应激研究高脂饮食对小鼠睾丸生精细胞凋亡的影响

网络出版时间：２０２３－１２－０１１６：０３：１９　网络出版地址：ｈｔｔｐｓ：／／ｌｉｎｋ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ／ｕｒｌｉｄ／３４．１０８６．Ｒ．２０２３１１３０．１３２３．０４８◇生殖药理◇从内质网应激研究高脂饮食对小鼠睾丸生精细胞凋亡的影响周本文１，２，３，张长城１，３，邓　何１，２，陈思敏１，３，常言语１，３，杨焱娜１，２，付国庆１，３，袁　丁１，赵海霞１，２（三峡大学１．国家中医药管理局中药药理科研三级实验室、２．基础医学院、３．健康医学院，湖北宜昌　４４３００２）收稿日期：２０２３－０６－０５，修回日期：２０２３－０９－１６基金项目：国家自然科学基金资助项目（Ｎｏ８２０７４２０５，８２２７４１９１）作者简介：周本文（１９９６－），女，硕士生，研究方向：高脂饮食对雄性生殖功能的影响及药物防治机制，Ｅｍａｉｌ：１７５４１９８８４７＠ｑｑ．ｃｏｍ；赵海霞（１９８６－），女，博士，副教授，研究方向：生殖功能障碍的病理生理机制及药物防治机制，鄂产中草药的药理活性及作用机制，通信作者，Ｅｍａｉｌ：ｚｈａｏｈａｉｘｉａ．ｍｍ＠１６３．ｃｏｍ；张长城（１９７３－），男，博士，教授，研究方向：机体衰老的生理病理机制与药物防治机制，生殖与不育的病理机制与药物防治机制，通信作者，Ｅｍａｉｌ：ｇｒｅａｔｗａｌｌ＠ｃｔｇｕ．ｅｄｕ．ｃｎｄｏｉ：１０．１２３６０／ＣＰＢ２０２３０４０３２文献标志码：Ａ文章编号：１００１－１９７８（２０２３）１２－２３４６－０８中国图书分类号：Ｒ３３２；Ｒ３２１１；Ｒ３２２６４；Ｒ３２９２４；Ｒ３２９２５；Ｒ５８９２摘要：目的　从内质网应激的角度研究高脂饮食对小鼠睾丸生精细胞凋亡的影响。

方法　将Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雄性小鼠随机分为正常组和高脂饮食组，每组６只，分别给予普通饲料和高脂饲料持续喂养５个月。

小鼠称体质量，麻醉后处死，取睾丸组织，称质量并计算睾丸指数；取附睾组织进行精液分析；ＨＥ染色检测睾丸组织形态学变化；ＴＵＮＥＬ染色检测生精细胞凋亡；Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测睾丸凋亡及内质网应激相关蛋白的表达水平；免疫荧光法检测ＧＲＰ７８蛋白表达和定位的变化。

钙调蛋白依赖性激酶在神经元发育中的调控机制

钙调蛋白依赖性激酶在神经元发育中的调控机制作为一种重要的信号传导分子，钙调蛋白依赖性激酶不仅在细胞的生长、分化和死亡等基础生理过程中起着至关重要的作用，而且在神经元发育过程中的调控机制也备受研究学者关注。

在一系列的实验研究中，科学家们发现，钙调蛋白依赖性激酶参与了神经元的健康发育以及神经退行性疾病的发生，并为疾病的预防与治疗提供了新的思路与途径。

神经元发育过程中的激酶如今，越来越多的研究表明，神经元的发育需要严格的时间表达和空间调控，它们之间的配合令神经元的形态变化、分化过程、突触形成和功能的成熟同步进行。

常见的突触激酶主要包含了钙调蛋白依赖性激酶（CAMK）、蛋白激酶C（PKC）和蛋白激酶A（PKA）等。

在这其中，CAMK是一种与神经元发育密切相关的激酶，它的活性通过钙-/钙调蛋白及其信号通路的调节而被严格限制。

在神经元的发育过程中，CAMK的活性调控可以促进神经元的成长、分化、突触的塑造和功能的成熟。

CAMK在神经元中的分布和调控CAMK的基因在哺乳动物中表达广泛，其亚型亦不止一种。

在神经元中，CAMK主要通过多种表达方式进行调控，如CAMKⅡ的自磷酸化和机械感受器的活性改变等。

此外，神经元中的CAMK活性可以由信号通路中的其他因素调控。

事实上，很多神经递质综合神经元内部的激酶、酶和钙通道等，以促进本身的释放和作用。

CAMK在神经元发育中的作用机制不同类型的CAMK参与到神经元发育过程中的方式也是不同的。

首先，CAMK的活性可以促进神经元的成长（Nikolic等）。

在神经元的过度发育阶段，较高水平的CAMK活性可以促进神经元的生长并帮助形成健康稳定的神经系统。

其次，CAMK对突触的塑造和功能的成熟也具有重要的作用（Wu等）。

神经系统突触的塑造是神经元发育的关键部分，突触的塑造与突触磷酸酶和突触前神经细胞因子合成相关，大多数研究表明CAMK在突触的塑造和成熟方面发挥了极其重要的作用。

同时它还可以促进突触的形成和运转，并对突触的可塑性和动态进行调节。

蛋白激酶CK2在神经退行性疾病病理生理机制中的作用及应用进展

蛋白激酶ＣＫ２在神经退行性疾病病理生理机制中的作用及应用进展崔孟颖　冯其贞　武　菲△（神经生物学研究所，济宁医学院，济宁２７２０６７）摘要　蛋白激酶ＣＫ２（ｃａｓｅｉｎｋｉｎａｓｅ２，ＣＫ２）是一种高度保守的丝／苏氨酸蛋白激酶，广泛分布于真核细胞的胞质和胞核中。

ＣＫ２可通过对其底物的磷酸化作用调制底物的生物学活性，从而参与细胞内多条重要的信号转导通路。

越来越多的研究发现，在多种神经退行性疾病中ＣＫ２表达及活性异常，是其病理生理机制的重要一环，提示ＣＫ２有重要的研究意义，可能是某些神经退行性疾病潜在的治疗靶点。

本文将对ＣＫ２在多种神经退行性疾病中病理生理作用以及ＣＫ２抑制剂、激动剂的最新研究进展作一综述。

关键词　ＣＫ２；神经退行性疾病；ＣＫ２抑制剂中图分类号　Ｒ３３８ＲｏｌｅａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎＰｒｏｇｒｅｓｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎＫｉｎａｓｅＣＫ２ｉｎｔｈｅＰａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌＭｅｃｈａｎｉｓｍｓｏｆＮｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅＤｉｓｅａｓｅｓＣＵＩＭｅｎｇＹｉｎｇ，ＦＥＮＧＱｉＺｈｅｎ，ＷＵＦｅｉ△（ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＮｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，ＪｉｎｉｎｇＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｊｉｎｉｎｇ２７２０６７，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ　ＰｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅＣＫ２ｉｓａｈｉｇｈｌｙｃｏｎｓｅｒｖｅｄｓｅｒｉｎｅ／ｔｈｒｅｏｎｉｎｅｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅ，ｗｈｉｃｈｉｓｗｉｄｅｌｙｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄｉｎｔｈｅｃｙｔｏｐｌａｓｍａｎｄｎｕｃｌｅｕｓｏｆｅｕｋａｒｙｏｔｉｃｃｅｌｌｓ．ＣＫ２ｃｏｕｌｄｍｏｄｕｌａｔｅｔｈｅｂｉｏｌｏｇｉｃａｌａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｉｔｓｓｕｂｓｔｒａｔｅｓｖｉａｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ，ｔｈｕｓｐａｒｔｉｃｉｐａｔｉｎｇｉｎｍａｎｙｉｍｐｏｒｔａｎｔｃｅｌｌｕｌａｒｓｉｇｎａｌｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎｐａｔｈｗａｙｓ．ＭｏｒｅａｎｄｍｏｒｅｅｖｉｄｅｎｃｅｓｈａｖｅｐｒｏｖｅｄｔｈｅａｂｎｏｒｍａｌｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄａｃｔｉｖｉｔｙｏｆＣＫ２ｉｎｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅｄｉｓｅａｓｅｓ，ａｎｄｈａｖｅｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄｔｈａｔＣＫ２ｍａｙｂｅｏｎｅｏｆｔｈｅｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ，ｓｕｇｇｅｓｔｉｎｇｔｈａｔＣＫ２ｉｓｏｆｇｒｅａｔｖａｌｕｅｔｏｓｔｕｄｙａｎｄｍａｙｂｅａｎｅｆｆｅｃｔｉｖｅｎｅｗｔａｒｇｅｔｆｏｒｓｏｍｅｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｉｎｔｈｅｐｒｅｓｅｎｔｒｅｖｉｅｗ，ｗｅｆｏｃｕｓｅｄｏｎｔｈｅｒｅｃｅｎｔｐｒｏｇｒｅｓｓｏｆＣＫ２ｉｎｖａｒｉｏｕｓｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅｄｉｓｅａｓｅｓａｎｄｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓａｎｄａｃｔｉｖａｔｏｒｓｏｆＣＫ２．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ　ＣＫ２；Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅｄｉｓｅａｓｅ；ＣＫ２ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ酪蛋白激酶（ｃａｓｅｉｎｋｉｎａｓｅ，ＣＫ）是一种高度保守的非环核苷酸依赖的丝／苏氨酸蛋白激酶，包括ＣＫ１、ＣＫ２和ＧｏｌｇｉＣＫ（ＧＣＫ）／Ｆａｍ２０Ｃ（ｆａｍｉｌｙｗｉｔｈｓｅｑｕｅｎｃｅｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ２０，ｍｅｍｂｅｒＣ）。

cAMP_PKA_CREB信号通路及相关调控蛋白PDE_4和ERK对学习记忆的影

Key words： cAMP； cAMP response element binding protein； phosphodiesterase 4； Extracellular signal regulating kinase； Learning and memory
过激活腺苷酸环化酶催化 ATP 水解生成的。cAMP 主要通过激活 PKA 使靶酶磷酸化，然后开启基因表达，在细胞生命活动中有着重要的意义，参与调节许多细胞的代谢、基因表达、细胞生长和分裂等。
pde4抑制剂rolipram能使n甲基d天冬氨酸受体的激活从而激活mapkerkcreb信号通路在神经保护及学习记忆过程中发挥重要作用31在camppkacreb信号通路及相关调控蛋白pde4和erk对学习记忆的影响及机制方面人们已做了大量研究并取得显著成果但把三者之间联系起来是否能为临床提供一条新的治疗途径及筛选新的有效药物预防麻醉引起的术后学习记忆障碍还要进一步探索
基金项目：国家自然科学基金（ 81000469）
在神经系统中，CREB 作为细胞内多种信号通路
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医学综述 2011 年 8 月第 17 卷第 15 期 Medical Recapitulate，Aug． 2011，Vol． 17，No． 15
的一个重要组成部分，其下游效应包括影响神经元的存活与生长、突触的可塑性和长期记忆的形成［4］。实验证实，CREB 活性的降低可抑制长时程记忆的形成，其数量的增加或活性的增强可促进长时程记忆的形成［5］。研究已证实，受 cAMP 调节的下游蛋白 CREB 参与了氯胺酮导致未成年大鼠学习记忆障碍的形成［6］，CREB 直接参与了水迷宫空间学习记忆的形成［7］。而另一研究证实大鼠纹状体边缘区及海马等脑区的 CREB 在空间学习记忆的早期就开始参与长时记忆的形成［8］。 1． 3 磷酸化的 CREB 蛋白（ phosphorylated CREB， P-CREB） CREB 磷酸化是许多信号转导通路的一个会聚点，在神经元的生长、突触可塑性、学习和记忆功能、损伤和再生等方面起着重要作用。CREB 的转录活性主要依赖于第 133 位丝氨酸残基（ Ser133）的磷酸化（即 P-CREB）。CREB 的 Ser133 位点被磷酸化后，它就成为活性状态，可启动多种基因的转录，引起细胞内多种长期生物学效应。记忆的形成依赖 P-CREB 通路诱导下游基因的表达［9］。研究证实，中枢神经系统神经递质的合成、基因表达、细胞增殖等均被通过以 P-CREB 为第二信使系统起作用的神经递质调控。

TNF-α和钙-钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ在大鼠心肌缺血后适应中的作用

TNF-α和钙-钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ在大鼠心肌缺血后适应中的作用刘敏;张家明;李超;郝海菊;李景东【摘要】AIM: To study the changes of myocardial TNF -α and total calcium - calmodulin - dependent protein kinase II ( CaMKII ) in sarcoplasmic reticulum ( SR ) after ischemic postconditioning. METHODS: The hearts of SD rats were collected and divided into 5 groups, including sham group, ischemia - reperfusion group, ischemic postconditioning group, recombinant human tumor necrosis factor receptor: Fc fusion protein( rhTNFR:Fc ) + ischemia - reperfusion group and rhTNFR:Fc + ischemic postconditioning group ( all n = 16 ). Eight hearts of each group were used to determine the levels of TNF - α and total SR CaMKII by RT - PCR and Western blotting, and the rest were used for the infarct size detection. RESULTS: The ratios of the infarct area to the ischemic area and the ischemic area to the total area in ischemia - reperfusion group were significantly increased than those in sham group ( P < 0. 01 ), while the ratios in ischemic post-conditioning group, rhTNFR: Fc + ischemia —reperfusion group and rhTNFR: Fc + ischemic postconditioning group were significantly decreased than those in ischemia - reperfusion group ( P <0.01 ). The expression of TNF - α at mRNA and protein levels was lower and the activity of SR CaMK II was higher in ischemic postconditioning group, rhTNFR: Fc + ischemic reperfusion group and rhTNFR: Fc + ischemic postconditioning group as compared to those in ischemia — reperfusiongroup ( P < 0. 01 ). Moreover, the activity of SR CaMK II in rhTNFR: Fc + ischemic postconditioning group significantly increased as compared with ischemia - reperfusion group and ischemic postconditioning group ( P < 0.01 ), and that in ischemic post-conditioning group was higher than that in ischemia — reperfusion group. CONCLUSION: Decreased TNF -α level and increased activity of CaMK II may contribute to cardio protective effect of ischemic postconditioning.%目的:探讨肿瘤坏死因子α(TNF-α)和肌浆网钙-钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)在大鼠心肌缺血后适应发生机制中的作用.方法:SD大鼠随机分为5组(各组n=16),包括假手术组(sham组)、缺血再灌注组(IR 组)、缺血后适应组(IP组)、重组人肿瘤坏死因子受体:Fc融合蛋白(rhTNFR:Fc)+缺血再灌注组(F+IR组)和rhTNFR:Fc+缺血后适应组(F+IP组).结扎冠状动脉左前降支建立心肌缺血再灌注损伤和缺血后适应模型,测量各组心肌梗死面积;RT-PCR及Western blotting测定心肌TNF-α mRNA和蛋白及CaMKⅡ含量和活性.结果:(1)与sham组比较,IR组梗死面积/缺血区面积及缺血区面积/总面积的比值均显著增加(P<0.01);与IR组比较,IP组、F+IR组和F+IP组这2个比值均显著减少(P<0.01),其中F+IP组减少更为明显.(2) 与sham组比较,其余各组心肌组织TNF-α mRNA和蛋白均显著升高(P<0.01);与IR组比较,IP组、F+IR组和F+IP组TNF-α表达均显著降低(P<0.01);与IR组比较,IP组、F+IR组和F+IP组CaMK Ⅱ活性均明显升高(P<0.01),其中以F+IP组升高最为显著.(4)与sham组比较,IR组和IP组肌浆网CaMKⅡ活性显著降低(P<0.01),而F+IR组和F+IP组均明显升高;与IR组比较,IP组、F+IR组和F+IP组CaMKⅡ活性均明显升高(P<0.01),其中以F+IP组升高最为显著.结论:缺血后适应可通过降低缺血再灌注时心肌组织TNF-α mRNA和蛋白表达、增加CaMKⅡ含量和活性发挥心肌保护作用.【期刊名称】《中国病理生理杂志》【年(卷),期】2012(028)007【总页数】5页(P1330-1334)【关键词】缺血后适应;心肌;钙-钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ;肿瘤坏死因子【作者】刘敏;张家明;李超;郝海菊;李景东【作者单位】华中科技大学同济医学院附属协和医院心内科,湖北,武汉,430022;华中科技大学同济医学院附属协和医院心内科,湖北,武汉,430022;华中科技大学同济医学院附属协和医院心内科,湖北,武汉,430022;华中科技大学同济医学院附属协和医院心内科,湖北,武汉,430022;华中科技大学同济医学院附属协和医院心内科,湖北,武汉,430022【正文语种】中文【中图分类】R541近年来在多种动物和人类发现心肌缺血预适应和后适应现象，即在心肌缺血前后给予多次短暂的缺血再灌注能减轻随后的再灌注损伤，两者具有内源性心肌保护作用，受到实验和临床研究的高度重视。

生物小综述钙离子第二信使-

二、关键词：Ca2+钙调素 CDPK 第二信使三、引言我们知道，矿质元素对植物的生长发育和生理过程起着重要作用，Ca2+就是其中最为重要的离子之一。

四、正文1、钙稳态在静息态的胞质中Ca2+浓度≤0.1μmol/L，而通常在细胞壁、ER、液泡、线粒体中的浓度会高2~5个数量级。

细胞壁是植物细胞的最大钙库[1]。

细胞中各处的钙离子浓度梯度在未受刺激时是保持相对稳定的，当受到刺激时，由于胞外Ca2+浓度高与胞内，此平衡就会被打破。

信号分子与受体结合通常引起跨膜的离子流动，从而引起膜电位的改变。

在质膜上，存在Ca2+通道，类似于水通道，引起Ca2+的内流；同时存在Ca2+泵，是Ca2+外流的通道。

因此细胞质中的游离Ca2+的浓度主要受质膜和内膜系统上的Ca2+通道和Ca2+泵的调节。

任何一种外界刺激或激素所引起的细胞反应通过Ca2+作为第二信使传递的直接证据是细胞质中是否有游离Ca2+的浓度变化。

3、钙调素3.1 钙调素( Calmodulin, CaM)是一种分布最广，功能最重要的钙依赖性调节蛋白。

钙_钙调素依赖性蛋白激酶_及其生物学作用 (1)

[收稿日期]2001-04-28 [修回日期]2001-07-163[基金项目]国家自然科学基金资助项目(39770175);国家杰出青年科学基金资助项目(39925012);国家重点基础研究规划(G 1999054000)资助项目△山东省临沂市人民医院神经科,276003T el :0539-*******;E -mail :wqb666@[文章编号]　1000-4718(2002)10-1300-03钙/钙调素依赖性蛋白激酶-Ⅱ及其生物学作用3王全保△,　王建枝(华中科技大学同济医学院,湖北武汉430030)C alcium/calmodulin -dependent protein kinase Ⅱand its biologic functionWANG Quan -bao ,WANGJian -zhi(Department o f Pathophysiology ,Tongji Medical Univer sity ,Wuhan 430030,China ) 【A R eview 】　Ca 2+/calm odulin -dependent protein kinase Ⅱ(CaMK Ⅱ)is a member of a family of Ca 2+/calm odulin -regulated protein kinases which als o includes Ca 2+/calm odulin -dependent protein kinas 2es Ⅰand Ⅲ,my osin light chain kinases and phosphorylase kinase.Unlike the other members of this family ,CaMK Ⅱis multifunctional protein kinase and distributes in a variety of tissues.It is especially abundant in neuronal system.In hippocam pus ,CaMK Ⅱis about 2%of the total protein.Studies have shown that CaMKⅡplays an im portant role in a variety of biological processes ,such as regulation of gene transcription ,synthe 2sis of neurotransmitter ,phosphorylation of cytoskeletonal protein ,hippocam pal learning and mem ory formation. [关键词]　钙调蛋白;蛋白激酶Ⅱ;学习;记忆 [KE Y WOR DS]　Calm odulin ;Protein kinase -Ⅱ;Learning ;Mem ory [中图分类号]　R363 [文献标识码]　A 钙/钙调素依赖性蛋白激酶-Ⅱ(calcium/calm odulin -dependent protein kinase -Ⅱ,CaMK Ⅱ)是一种多功能蛋白激酶,存在于许多动物细胞内,尤其在神经组织中含量丰富。

钙钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱδ通过Wntβ-连环素通路调节前列腺癌细胞增殖和侵袭要点

ｆｉｅ，Ｅｍａｉｆ：ｚｈａｎｇｊ９７５＠ｓｉｎａ．ｔｏｍ
Ｔｏｓｔｕｄｙｔｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆｅａｌｃｉｕｍ／ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅⅡ８
【Ａｂｓｔｒａｃｔ】０ｂｊｅｃｆｉｖｅ
（ＣａＭＫｌＩ８）ＯｎｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎａｎｄｉｎｖａｓｉｏｎｏｆｈｕｍａｎｐｒｏｓｔａｔｅｃａｎｃｅｒＰＣ一３ｃｅｌｌｓ．ＭｅｔｈｏｄｓＨｕｍａｎＣａＭＫ Ⅱ８ｓｉＲＮＡｗａｓｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄｉｎｔｏＰＣ一３ｃｅｌｌｓ．ＣａＭＫⅡ８ｍＲＮＡａｎｄｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｓｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄ
・１０４８・
生垡塞墼处抖苤查！Ｑ！！生堡旦箜！！鲞箜堡塑ｇ！也』垦！Ｐ！！垡：垒Ｐ堕！！Ｑ！！，！！！．！！：盟！．堡
・实验研究・
钙／钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ６通过Ｗｎｔ／１３一连环素通路调节前列腺癌细胞增殖和侵袭
张兴华张杰罗鹏程民医院泌尿外科
通信作者：张杰，Ｅｍａｉｌ：ｚｈａｎ自９７５＠ｓｉｎａ．ｃｏｒｎ
【关键词】前列腺肿瘤；钙／钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ８；增殖；侵袭；Ｗｎｔ／１３一连环蛋
白通路基金项目：国家自然科学基金（８１４７０９２３）
Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆｃａｌｃｉｕｍ／ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅ１Ｉ８
ｔａｔｅｃａｎｃｅｒ
ｏｎ
ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎａｎｄｉｎｖａｓｉｏｎｏｆｐｒｏｓ．
Ｔｒｉｓ—ＨＣｌ缓冲液（ＴＢＳＴ）溶液４℃封闭ＰＶＤＦ膜过夜。分别加入ｌ：１０００稀释一抗和内参，４℃摇床过夜。用含０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０的ＴＢＳＴ溶液洗涤３次，然后加入辣

异丙肾上腺素对大鼠心脏功能的动态影响

异丙肾上腺素对大鼠心脏功能的动态影响左琳;宋峰;赵锐;李端端;石山慧;贺忠梅;刘慧荣【摘要】目的：观察异丙肾上腺素(ISO)对在体大鼠心脏功能、心室肌细胞功能以及胞内相关下游蛋白表达的动态影响。

方法采用血流动力学方法及乳鼠心肌细胞培养,观察ISO对在体及离体大鼠心肌收缩能力的影响；通过Fura 2荧光探针法观察ISO对成鼠心肌细胞内游离钙水平的影响；Western blot 检测 ISO下游胞内相关蛋白表达水平的变化。

结果(5~500)nmol/L ISO对成鼠在体心功能有一个剂量依赖性增强效应,100 nmol/L为其最佳实验浓度：0.1μmoI/LISO作用大鼠心室肌细胞(1000~1200)s,胞内游离钙水平达高峰。

0.1μmoI/LISO作用于乳鼠心肌细胞30 min可使其跳动频率达高峰,维持至60 min后开始下降,与胞内钙变化规律一致。

心室肌细胞内钙调蛋白激酶Ⅱ(Calmodulin kinaseⅡ,CaMKⅡ)水平在ISO干预后3 h达高峰；G蛋白偶联受体激酶2(GRK2)和β arrestin也在 ISO作用后48 h达高峰。

结论 ISO可通过兴奋胞内Ca2+ CaMKⅡ信号通路参与心肌细胞功能活动的动态调节；同时,ISO长期作用可升高胞内GRK2β arrestin水平,参与受体的脱敏调节。

【期刊名称】《中西医结合心脑血管病杂志》【年(卷),期】2015(000)005【总页数】5页(P589-593)【关键词】异丙肾上腺素;细胞内游离钙;心脏功能;钙调蛋白激酶Ⅱ;G蛋白偶联受体激酶2;β arrestin【作者】左琳;宋峰;赵锐;李端端;石山慧;贺忠梅;刘慧荣【作者单位】山西医科大学基础医学院生理学系太原 030001; 山西医科大学细胞生理学省部共建教育部重点实验室;山西医科大学基础医学院生理学系太原030001;山西省儿童医院临床医学检验中心;山西医科大学基础医学院生理学系太原 030001; 山西医科大学细胞生理学省部共建教育部重点实验室;山西医科大学基础医学院生理学系太原 030001; 山西医科大学细胞生理学省部共建教育部重点实验室;山西医科大学基础医学院生理学系太原 030001; 山西医科大学细胞生理学省部共建教育部重点实验室;首都医科大学基础医学院生理学与病理生理学系【正文语种】中文【中图分类】R285;R255在心肌重构以及心衰的发生、发展过程中。

钙及钙调蛋白依赖性激酶在神经元缺氧损伤中的作用

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中国当代儿科杂志第９卷第４期ＣｈｉｎＪＣｏｎｔｅｍｐＰｅｄｉａｔｒ２００７年８月
Ｖｏｌ．９Ｎｏ．４Ａｕｇ．２００７
ＤＡ）阻滞剂阻断不同类型的钙离子内流，测定钙离子的动态变化，用ＭＴＴ法测定细胞的活性，免疫印记技术检测ＣａＭＫ和ＣａＭＫ的表达，以期阐明钙调蛋 Ⅱ Ⅳ 白依赖性激酶在神经元缺氧损伤中的作用。
中国当代儿科杂志第９卷第４期ＣｈｉｎＪＣｏｎｔｅｍｐＰｅｄｉａｔｒ２００７年８月
Ｖｏｌ．９Ｎｏ．４Ａｕｇ．２００７
新生儿脑损伤专栏·实验研究
钙及钙调蛋白依赖性激酶在神经元缺氧损伤中的作用
Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆｃａｌｃｉｕｍａｎｄｃａｌｍｏｄｕｌｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｋｉｎａｓｅａｇａｉｎｓｔｈｙｐｏｘｉｃｎｅｕｒｏｎａｌｉｎｊｕｒｙ
ＺＨＯＵＨｕｉ，ＳＵＮＸｉａｏＭｅｉ，ＬＵＯＸｉａｏＬｉ，ＭＡＯＭｅｎｇ．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＰｅｄｉａｔｒｉｃｓ，ＷｅｓｔＣｈｉｎａＳｅｃｏｎｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＨｏｓｐｉｔａｌ，ＳｉｃｈｕａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈｅｎｇｄｕ６１００４１，Ｃｈｉｎａ（ＭａｏＭ，Ｅｍａｉｌ：ｄｆｆｍｍａｏ＠１２６．ｃｏｍ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＯｂｊｅｃｔｉｖｅＴｏｓｔｕｄｙｔｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆｃａｌｃｉｕｍａｎｄｃａｌｍｏｄｕｌｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｋｉｎａｓｅａｇａｉｎｓｔｈｙｐｏｘｉｃｎｅｕｒｏｎａｌｔｈｏｄｓＥｍｂｒｙｏｎｉｃｃｏｒｔｉｃａｌｎｅｕｒｏｎｓｏｆ１７ｄａｙｐｒｅｇｎａｎｔｅｍｂｒｙｏＳｐｒａｇｕｅＤａｗｌｅｙｒａｔｓｉｎｊｕｒｙａｎｄｉｔｓｐｏｓｓｉｂｌｅｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ．Ｍｅｗｅｒｅｃｕｌｔｕｒｅｄｉｎｖｉｔｒｏａｎｄｔｈｅｃｕｌｔｕｒｅｄｎｅｕｒｏｎｓｗｅｒｅｒａｎｄｏｍｌｙａｌｌｏｃａｔｅｄｉｎｔｏｄｉｆｆｅｒｅｎｔｇｒｏｕｐｓｔｈａｔｅｘｐｏｓｅｄｔｏｈｙｐｏｘｉａｏｒｈｙｐｏｘｉａ＋ｃａｌｃｉｕｍｃｈａｎｎｅｌａｎｔａｇｏｎｉｓｔ．ＮｉｍｏｄｉｐｉｎｅａｎｄＭＫ８０１ｗｅｒｅｕｓｅｄｔｏｂｌｏｃｋｔｈｅＬｖｏｌｔａｇｅｓｅｎｓｉｔｉｖｅｃａｌｃｉｕｍｃｈａｎｎｅｌ（ＭＴＴ）ｍｅｔｈｏｄｗａｓｕｓｅｄｔｏｄｅｔｅｒｍｉｎｅｔｈｅａｎｄＮＭＤＡｒｅｃｅｐｔｏｒｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙｂｅｆｏｒｅｈｙｐｏｘｉａ．Ｔｈｅｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍｃｅｌｌｖｉａｂｉｌｉｔｙ．Ｆｌｕｏ４ＡＭ，ａｎｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｃａｌｃｉｕｍｉｎｄｉｃｔｏｒ，ｗａｓｕｓｅｄｔｏｄｅｔｅｃｔｔｈｅｃｈａｎｇｅｓｏｆｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｃａｌｃｉｕｍａｆｔｅｒｈｙｐｏｘｉａ．ＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｏｆＣａＭＫｎｄＣａＭＫｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ．ＲｅｓｕｌｔｓＴｈｅｃｅｌｌｖｉａｂｉｌｉｔｙｏｆｔｈｅ Ⅱ ａ Ⅳ ｗｎｉｍｏｄｉｐｉｎｅｏｒＭＫ８０１ｔｒｅａｔｅｄｇｒｏｕｐｓｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈａｔｏｆｔｈｅｕｎｔｒｅａｔｅｄｈｙｐｏｘｉａｇｒｏｕｐ．Ｔｈｅｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｃａｌｃｉｕｍｌｅｖｅｌｏｆｔｈｅｎｉｍｏｄｉｐｉｎｅｔｒｅａｔｅｄｇｒｏｕｐｄｅｃｒｅａｓｅｄｒａｐｉｄｌｙａｆｔｅｒｈｙｐｏｘｉａ．Ｃｏｍｐａｒｅｄｔｏｎｉｍｏｄｉｐｉｎｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ，ＭＫ８０１ｔｒｅａｔｍｅｎｔｃｏｕｌｄｉｎｈｉｂｉｔｈｙｐｏｘｉａｉｎｄｕｃｅｄｃａｌｃｉｕｍｉｎｆｌｕｘｆｏｒａｌｏｎｇｅｒｔｉｍｅ．ＮｉｍｏｄｉｐｉｎｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｄｅｃｒｅａｓｅｄｔｈｅＣａＭＫ Ⅱ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｗｈｉｌｅＭＫ８０１ｔｒｅａｔｍｅｎｔｄｅｃｒｅａｓｅｄｔｈｅＣａＭＫⅣ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．ＣｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓＮｉｍｏｄｉｐｉｎｅａｎｄＭＫ８０１ｐｒｏｔｅｃｔｎｅｕｒｏｎｓｆｒｏｍｈｙｐｏｘｉｃｉｎｊｕｒｙｐｏｓｓｉｂｌｙｂｙｔｈｅｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆＣａＭＫｎｄＣａＭＫｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ⅱａ Ⅳｅ［ＣｈｉｎＪＣｏｎｔｅｍｐＰｅｄｉａｔｒ，２００７，９（４）：３２４－３２６］Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｎｅｕｒｏｎ；Ｈｙｐｏｘｉａｉｎｊｕｒｙ；Ｃａｌｉｃｕｍ；Ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎｄｅｐｅｄｅｎｔｋｉｎａｓｅ；Ｒａｔｓ

尾加压素Ⅱ生物学作用的研究进展

ｌ司外医学呼吸系统分Ⅱ｜｝２００３｛Ｆ第２３卷第４期尾加压素Ⅱ生物学作用的研究进展·１８３·广州呼吸疾病研究所（广州５１０１２０）彭公永综述冉丕鑫钟南山审校摘要尾加压崇１１（ｕｒｏｔｅｎｓｉｎｌｌＪＪ—ＩＩ）是发上见于硬甘鱼尾部下垂体的活性从。

日前·从人体中已克降出ｕＩｉ．并发现其受体ＧＰＲｌｌ分布下Ａｔ｝－的多个部位，ＵＩＩ与Ｇｔ’Ｒ１４结合后，参与许多生物学效应，如舒缩血管、收缩５１道歧促细胞增殖等。

关键词尾ＪＪⅡ妪索；生物学作用尾加压素¨（ｕｒｏｔｅｎｓｉｎ１Ｉ。

ｕⅡ）最早发现于硬骨鱼垲部下垂体，后证实其分布具有种属普遍性。

近米，从人体中已克隆ｍＵ—Ｈ．并发现其受体ＧＰＲｌ４，ｕⅡ与ＧＰＲｌ４结合后，引起细胞内ｃａ引浓度升高，参与许多生物学效应，本文就其生物学作用做一综述。

１结构、受体及其分布１９８０年，ｕⅡ首次从虾虎鱼尾部Ｆ垂体中被人Ｔ。

提纯，日前在多种物种（包括人类）中郡克隆出了ｕＨ。

不同物种ＬＪＵ的结构虽有差异．但都有一环形结构，序列为半胱氨酸举丙氨酸色氨酸赖氨酸酪氨酸一半胱氯酸，此环状六肽是ｕ—ＩＩ的活性中心，从佰类到几娄，ｕⅡ的环形活性中心相当保守…，它与生长抑索一１ｄ的活肚中心（苯丙氨酸色氨酸赖氨酸苏氰酸）相类似．但荩冈分析证实二者并非同源。

与其他物种牛ｎ比，人的ｕ一１１只有ｎ个氨基酸残基，但其环状？ｉ肽结构仍十分保守。

研究ｕⅡ的前体发现．ｕ一｜１序列位丁其前休的ｃ端，哺乳炎ｕ一¨是其前体产生的唯有生物活性的多肽。

ＵＩＩ的分布很普遍。

在鱼类，ｕ—ｌＩ广泛分布于建部神绎分泌系统；在蛀，ＵⅡ上要分布于蜓髓和尾部脑垂体的运动神经元．在端脑、问腑、中脑及后脑仅有其舒ｕ—ＩＩ反应性的致密神经纤维网，尤其在丘脑、顶盖、人脑脚更为明显；胚胎期大鼠，ｕⅡ在骶骨水平运动神经元高度表达．在颈部水平和胸部水平仅有微鼍表达，出生后ｕ一¨在争身各水平运动神经元的表达都增加，成年后，ｕ—ＩＩ主要表达于脑ｒ和脊髓，其中在腑十外展神经梭高度分布，在脊髓背侧角中度分布．另外．在丰动脉也有低度分布”；在人类．ｕⅡ主要分布于脊髓的运动神经元，在：骨胳肌和人脑皮质分布水平【ｉ王较高，。

钙调蛋白结构、性质及其细胞生物学功能的研究进展

钙调蛋白结构、性质及其细胞生物学功能的研究进展李庆伟;张撼;逄越【摘要】钙调蛋白(calmodulin,简称CaM)是普遍存在于真核生物中且高度保守的一类钙离子结合蛋白,在不同物种中,其氨基酸的同源性非常高.作为典型的EF-hand 家族蛋白成员,CaM可以结合Ca2+,形成Ca2+-CaM复合体,从而调节细胞代谢及靶酶的功能.CaM与多种靶蛋白结合,调节靶蛋白的活性,激活下游细胞凋亡、自噬等细胞反应.CaM能够调控微管的解聚.此外,CaM还可以影响细胞增殖,促进DNA 的合成,调控细胞周期的进程.就CaM的结构、性质及细胞生物学功能进行综述,以期为从事该领域研究的科研人员提供有益参考.%Calmodulin (CaM) is a kind of universal existence in all eukaryotic cells and highly conserved calcium binding protein.The homology of amino acid is very high in different species.The protein has two approximately symmetrical globular domains each containing a pair of EF-hand motifs (the N-and C-domain) separated by a flexible linker region for a total of four Ca2+ binding sites, and then CaM can bind to Ca2+ to form a Ca2+-CaM complex.Actived CaM regulates cell metabolism and function of the target enzyme.Calmodulin binds a wide variety of target proteins, modulates the activity of target proteins, and activates cell apoptosis, autophagy and other cellular responses.CaM can modulate microtubule depolymerization.In addition, CaM can also affect cell proliferation and DNA synthesis and regulation of cell cycle progression.In this review, we summarize the structure, properties and cell biological function of CaM,which provides valuable information for the future research in this field.【期刊名称】《辽宁师范大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2017(040)001【总页数】9页(P74-82)【关键词】钙调蛋白;微管解聚;细胞增殖;细胞周期【作者】李庆伟;张撼;逄越【作者单位】辽宁师范大学生命科学学院,辽宁大连 116081;辽宁师范大学七鳃鳗研究中心,辽宁大连 116081;辽宁师范大学生命科学学院,辽宁大连 116081;辽宁师范大学七鳃鳗研究中心,辽宁大连 116081;辽宁师范大学生命科学学院,辽宁大连 116081;辽宁师范大学七鳃鳗研究中心,辽宁大连 116081【正文语种】中文【中图分类】Q786早在1965年，Ebashi等[1]在细胞中发现了一种可以结合并传递钙离子信号的蛋白，短期内引起了很大的轰动；后来美籍华人张槐耀博士[2]对这个钙结合蛋白的结构和功能进行了深入的研究，并将此类蛋白命名为“钙调蛋白”.CaM被认为是真核细胞中重要的调节器[3].Ca2+作为动植物及微生物中重要的第二信使[4]，在细胞内行使多种细胞生理反应的同时[5]，也是细胞内重要的离子之一.作为离子信号分子的Ca2+需要与下游的离子受体结合才能行使相关生化功能和诸多细胞反应，研究表明，Ca2+最重要的离子受体就是CaM.空载的CaM不具有任何酶活性，只有当CaM结合了Ca2+，形成了Ca2+-CaM复合体后，才能引起CaM构型发生改变，暴露疏水区，CaM的活性才能被激活.CaM在生物进化中是高度保守的一类重要的调节型蛋白，无论是高低等生物，其同源性都非常高.通过近50 a时间的探索，对CaM的结构、性质的研究已经有了飞跃性的突破，同时在功能方面，对细胞周期调控、细胞增殖、微管解聚[6]、以及与下游靶酶、靶蛋白的结合等领域也获得了可喜的成果.本文就CaM的结构、性质以及细胞生物学功能进行综述.CaM是由148个氨基酸残基组成的、且在不同物种中高度保守的一类小分子蛋白质，其相对分子质量为16.7 kD.CaM属于典型的EF-hand型家族，N末端和C末端都有一相似的EF-hand结构域，这2个结构域是通过一个长而富有弹性的中央Linker连接而成[7].EF-hand不会单独出现，而是成对存在,除了CaM含有4个EF-hand外，还有2、6个EF-hand 2种类型.CaM外形似哑铃，两端具有可以结合钙离子的2个球形末端(图1),每个EF-hand的球形末端可以结合2个Ca2+，这样1个CaM就可以结合4个Ca2+.CaM一级结构非常稳定，有研究表明，无论是脊椎生物，还是无脊椎动物，其氨基酸水平都具有很高的同源性.Ca2+结合到CaM的部位受体系中Ca2+浓度调控，每个球形末端对Ca2+的亲和性是不同的，其中一个位点亲和性较高，而另一个亲和性则相对较低，Ca2+通常结合在亲和性较低的球形末端.α螺旋和β折叠的相互作用形成了CaM独特的二级结构.CaM含有7个α螺旋，4个Ca2+结合位点和2个短的、反向平行的双链β折叠[8].作为EF手型家族蛋白成员的CaM，具有独特的螺旋-环-螺旋结构[9].2个相互垂直的α螺旋由一个钙结合环连接，细胞内的Ca2+就结合在这个结合环上(图1)，CaM结构的稳定性依赖于α螺旋的氢键和疏水键作用的强度.CaM的三级结构通常情况下很稳定，对高温、酸性条件具有良好的耐受作用，DNA酶、RNA酶对CaM的活性也不会造成严重的影响.研究发现，CaM的4个Ca2+结合位点与Ca2+/CaM复合物之间有正向的协同作用[10].Ca2+-CaM复合体具有催化活性，其原因就在于，在同一个结构域内构象发生了变化，每个螺旋之间的相对方向改变，导致Ca2+结合结构域从闭合的构象变为打开的构象，这样一来就形成了一个疏水口袋，进而增强了与CaM结合蛋白的亲和性.有报道称，Apo 钙调蛋白(Ca2+空载CaM)的C端结构域即使在缺少Ca2+的情况下，也具有与靶蛋白作用的能力，这与Apo钙调素C端结构域呈半开半闭的动态平衡是分不开的.Holo钙调蛋白(Ca2+饱和钙调蛋白)中呈α螺旋的中央Linker通过C端结构域第一个螺旋和N端结构域最后一个螺旋连接成一个更长的螺旋，当时认为这是导致CaM呈哑铃形状的主要原因，而后来的研究表明，形成这种特殊构象的原因是晶体堆积造成的.CaM一个显著性的特点就是其结构的高度灵活性，这是由于CaM不含有易于氧化的半胱氨酸和羟脯氨酸，使得肽链定型不受其他因素的影响，并且在温度很高的情况下依然可以保持活性.CaM普遍存在于真核生物细胞中，位于人类第14号染色体上，等电点为4.0左右，分布广泛，为进化上高度保守的一类钙离子受体蛋白[11]，且在已知的脊椎动物中，CaM的氨基酸水平极其相似，同源性也非常高[12](图 2)，其理化性质和生物学活性的相似度也很高，这对于维持多种多样的CaM结合蛋白家族的相互作用可能是相当重要的[13].CaM是一种酸性的水溶性热稳定蛋白，可以在外界温度很高的情况下仍可保持其良好的生物活性.李朝军等[14]的研究表明，成熟期的CaM 主要存在于细胞核中，并在核内进行一系列信号应答反应.在植物中，外界环境刺激，如盐离子浓度、高温、低温、干旱等非生物胁迫可以改变生物体内Ca2+水平[15]，而细胞内的与CaM调节有关的靶酶活性与Ca2+水平之间存在正相关.Ca2+-CaM复合物调节细胞代谢的方式主要有2种：一种是直接与靶标酶起作用，一种是通过激活Ca2+-CaM复合物相关蛋白激酶的活性，从而调节细胞代谢[16].CaM本身无任何酶活性，但可以与靶蛋白相互作用并调节靶蛋白的活性[5]，而这一过程是通过与其下游的靶蛋白——钙调素结合蛋白(calmodulin-bindingproteins，CaMBPs)的作用来完成的.CaM分布于所有的真核生物中，而CaMBPs主要在神经元细胞类型中表达[17].对CaMBPs的研究能够帮助更好地探明Ca2+-CaM在信号转导中发挥的作用.结合CaM的靶蛋白有很多[18](表1)，一旦CaM与靶蛋白结合后就会引起诸如细胞增殖、迁移、凋亡、自噬等反应.纵观这些靶蛋白之间的最明显的共同点是呈碱性，除此之外，包括序列、结构和功能上都没有相似之处.CaM的靶蛋白通常分为3种：①动物中与CaM同系物相似的蛋白；②植物所特有的CaM靶蛋白；③具有独立的CaM结合区域的动物同系物类似蛋白.CaM对其靶蛋白的激活机制也有3种：CaM通过与其靶蛋白的结合使靶蛋白的活性位点重组，释放了靶蛋白的自动抑制区以及使靶蛋白二聚体化，从而激活靶蛋白[19].靶蛋白的CaM结合区表现极端的序列可变性，这反映了CaM调节的柔性[20]，这与CaM序列的保守性是截然相反的.CaM识别靶蛋白的机制是根据靶蛋白的类型决定的，通常情况下，CaM与其靶蛋白是通过15～30个碱基对组成的肽段将彼此连接起来，这个连接区域的肽段一般情况下都含有一个自动的抑制区，识别机制也会随着靶蛋白的改变而变化.通过对CaMBPs氨基酸序列进行分析，将CaMBPs归纳成两类3种CaMBD基序(motif)，包括一个不依赖于Ca2+的基序(IQ)和2个依赖于Ca2+的基序，分为1-5-10和1-8-14两种区域模式，最前面和最后面的数字表明这2个疏水性锚的碱基位置，而中间的数字表示另一个额外的疏水性碱基的位置[5].CaM的靶蛋白在基因调控[21]、抗病性[22]、代谢、离子运输[23]、胁迫耐受性和细胞骨架的组建[24]具有重要的作用.4.1 CaM调控细胞增殖及细胞周期真核生物的细胞增殖过程远比原核生物复杂得多.研究发现，在细胞增殖和细胞周期的过程中，CaM具有重要的调节作用.CaM在细胞中的分布并非永恒不变，会随着细胞周期的进行而迁移.在G1期，CaM主要分布在细胞质中，可与含肌动蛋白的微丝束组装结合；当细胞分裂进行到S期时，发现CaM开始向细胞核中迁移；当分裂进行到G2期时，CaM集中在细胞核中；而在M期(分裂期),CaM主要聚集在极粒和染色体之间的半纺锤体上，说明了在不同时期，CaM在细胞中存在的位置是不同的(图3A).有资料显示，在G1期向S期转变以及G2期向M期过渡过程中,CaM的浓度会增加近1倍，说明CaM是在晚G1期合成的.影响细胞增殖的一个重要指标就是CaM水平，而激活CaM依赖性激酶所需的Ca2+阈浓度随CaM浓度变化而变化.线性回归方程分析表明，CaM水平与G1期长短以及进入S期细胞的百分数有直接的相关性，说明CaM浓度水平对G1期向S期过渡起关键作用[40].在化学致癌物、病毒以及激素诱发的转化细胞中，G1期都大大缩短了，CaM含量提高了2～3倍[41].在动植物中,CaM所参与的周期调控有明显的不同，说明细胞增殖在物种不同进化水平上存在显著的差异.CaM除了可以调控胞内细胞增殖，在胞外同样可以促使细胞增殖.早在1988年,Crocker等首次报道了CaM在胞外可以促进人白血病淋巴细胞增殖，说明CaM不仅可以在胞内影响细胞增殖，在胞外同样具有促进细胞分裂的作用.在细胞增殖的过程中，CaM只是调控机制中的一个重要环节，影响增殖不是单因素决定的，而是多种因素相互作用产生的结果.总而言之，CaM调控细胞增殖的特点可归纳为以下几点：①启动DNA合成，促进G1/S期过渡；②促进G1/M期过渡；③调控染色体的移动，并促进细胞进入有丝分裂后期(图3B).4.2 CaM参与调控靶酶活性同CaM的靶蛋白类似，复合体Ca2+-CaM也同样具有结合并调控下游靶酶的功能.国内外学者利用CaM这个特性，获得许多与其结合的靶酶，为生命科学的发展提供了重要的资源.现已确定的靶酶有磷酸化酶激酶、鸟苷酸环化酶、磷脂酶A2、肌球蛋白轻链激酶、磷酸二酯酶、Ca2+依赖蛋白激酶、辅酶Ⅰ激酶、Ca2+-ATP 酶、腺苷酸环化酶等多种酶的活性.钙调蛋白激酶(CaMK)是一类重要的CaM靶酶，尤其是CaMKⅡ是研究最深的一类钙调蛋白激酶.当体内CaMKⅡ含量达到一定水平时，可导致心脏肥大、心律不齐以及房颤等症状[42].Ca2+-CaM复合体形成后，下游的靶酶的活力会有不同程度的增加，例如氧化物歧化酶含量可提高50%以上，乳酸脱氢酶活力可提高30%左右.在动物中，CaM在肾上腺和脑中cAMP的合成与降解的过程中扮演重要的角色；在植物中，CaM参与调节叶绿素光合作用的进行，CaM在植物体内NAD激酶对浓度的要求极高，若低于一定浓度，NAD激酶的催化活性会被抑制或停滞.有资料显示，Ca2+-CaM激活NAD激酶是调节光合作用的重要环节.李翠凤[43]等在研究Ca2+-CaM依赖性蛋白激酶对胰腺蛋白磷酸化时发现，当CaM的浓度为60 μmol/L时，Ca2+对磷酸化最大激活浓度为15 nmol/L；当体系中的Ca2+过量时，CaM磷酸化水平会有很大程度增加.Seubert[44]等的研究表明,CaM和类红细胞血影蛋白参与神经功能的调节.在CaM众多的靶酶中，在细胞中起到的作用、结合与活化的部位都有不同程度差异，结合CaM的靶酶不能证明靶酶被活化，但靶酶的活化却是CaM与靶酶结合的结果.4.3 CaM调节微管解聚微管(microtubule, MT)是细胞骨架的主要成分之一，在细胞内主要参与充当分子马达分选、细胞内部结构有序性的保持、运输细胞组分的运动轨道和细胞形态的维持[45].微管的组装需要微管结合蛋白和Tau因子共同作用，由于依赖CaM激酶的底物而被磷酸化，导致MT的解聚.当体系中存在一定的Ca2+时，CaM就会与微管Tau因子竞争结合，微管的聚合就会被抑制，细胞的生理活动恢复正常.在体外和活细胞中，MT对冷和诺达考唑比较敏感，有MT存在的情况下，MAP6/STOP家族成员会阻止冷和诺达考唑介导的微管解聚[46]，并且MAP6蛋白的MT活性受CaM抑制[47-48].早期的研究证明[49]，利用显微注射的方法注入CaM，可以有效地延长有丝分裂中期持续的时间，这是由于纺锤体中微管的瞬时解聚造成的；同时大量证据表明，细胞在行使有丝分裂的时候，纺锤体的装配与去装配能够调控染色体向两极移动，而在此过程中，处于中期的CaM对微管的稳定性具有调节作用，这种调节作用是通过翻转机制(flip-flop)来完成的.通常情况下，微管蛋白在聚合与解聚之间处于动态的随机转换.有研究表明，微管的解聚有助于DNA的合成，说明微管解聚与细胞增殖之间可能存在正向协同作用.作为调节型的CaM,在进化上非常保守，不同物种之间的同源性也非常高，说明了CaM对细胞功能的调节发挥了重要的作用[50].除了野甘草之外(只有一个)，无论是脊椎动物还是无脊椎动物，无论是高等生物还是低等生物，编码CaM的基因都有3个，这3个基因在不同的物种间也是高度保守的[51].利用CaM可以结合下游靶蛋白的特性，可以找到更多的相关蛋白，这对分析研究CaM的功能是一个很好的途径.CaM对外界刺激的耐受性很强.在植物中，CaM及其相关激酶的存在可以影响植物的生长、发育等非生物胁迫，但是对植物的生长发育究竟产生了哪些影响，以及对下游的通路产生什么样的影响，影响的方式又是怎样的，目前还不是很清楚.现阶段研究CaM最多的就是CaM在细胞增殖过程中的一些调控机制，包括对G1长短的调控、M期CaM集中于纺锤体的原因，此外，CaM可以调节微管解聚，但是影响微管解聚的机制与方式，却知之甚少，还有待进一步探究.有报道称，CaM可能参与了肿瘤机制的调节[52].在Alzheimer’s疾病中可能是重要的钙稳态介体[53]，在许多疾病中，CaM都充当一个重要的角色，而调控这一过程是通过一系列的信号通路来完成的[11].例如，功能缺陷的CaM可以破坏心脏重要的钙离子信号，从而影响细胞膜通道以及诱发心律失常等病症[54].近年来，CRISPR/CAS9基因敲入、基因敲除技术的日益成熟，以及其他生物科技的研发，这些问题会在不久的将来得到解决.随着研究的深入，CaM越来越多的功能会被科学家们发掘，不仅推动了社会的进步与发展，对相关疾病的治疗也有着同样重要的意义.【相关文献】[1] 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