基因工程知识点归纳

基因工程(习题详见2016天利活页)

DNA重组技术的基本工具

知识点一基因工程的概念：基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫做DNA重组技术。

注意：对本概念应从以下几个方面理解：

知识点二基因工程的基本工具

1.限制性核酸内切酶——“分子手术刀”

（1）限制性内切酶的来源：主要是从原核生物中分离纯化来的。

（2）限制性内切酶的作用：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序

列，并能将每一条链上特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键切开。

（3）限制性内切酶的切割方式及结果：①在中心轴线两侧将DNA切开，切口是黏性末端。

②沿着中心轴线切开DNA，切口是平末端。

2.DNA连接酶——“分子缝合针”

（1）来源：大肠杆菌、T4噬菌体

（2）DNA连接酶的种类：E.coliDNA连接酶和T4DNA连接酶。

（3）作用及作用部位：E.coliDNA连接酶作用于黏性末端被切开的磷酸二

酯键，T4DNA连接酶作用于黏性末端和平末端被切开的磷酸二酯键。

注意：比较有关的DNA酶(详情见附件)

DNA聚合酶：在DNA复制时起作用，将多个脱氧核苷酸催化聚合为脱氧核苷酸链（也就是DNA单链），此时形成的化学键是磷酸二酯键。

DNA解旋酶：在DNA复制或转录时起作用，将DNA的双链解开，作用对象是氢键，使氢键断裂

DNA水解酶：在消化道或细胞内起作用，将DNA水解为脱氧核苷酸，作用对象是磷酸二酯键

下图为DNA分子在不同酶的作用下所发生的变化，图中依次表示限制性内切酶、DNA聚合酶、

DNA连接酶：在DNA修饰过程或基因工程中起作用，将两个DNA片段连接起来，此时形成的化学键是磷酸二酯键。

3.基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”

（1）分子运载车的种类

①质粒：常存在于原核细胞和酵母菌中，是一种分子质量较小的环状的裸露的DNA 分子， 独立于拟核之外。

②病毒：常用的病毒有噬菌体、动植物病毒等。

（2）运载体作用：

①是用它做运载工具，将目的基因转运到宿主细胞中去。

②是利用它在受体细胞内对目的基因进行大量复制。

（3）作为运载体必须具备的条件：

①在宿主细胞中保存下来并大量复制

②有多个限制性内切酶切点

③有一定的标记基因，便于筛选。

4、教材拓展：

拓展点一 限制酶所识别序列的特点

限制酶所识别的序列的特点是：呈现碱基互补对称，无论是奇数个碱基还是偶数个碱基，都可以找到一条中心轴线，如图，中轴线两侧的双链DNA 上的碱基是反向对称重复排列的。如：

以中心线为轴，两侧碱基互补对称； 以 为轴，两侧碱基互补对称。

拓展点二 DNA 连接酶连接的是什么部位？

DNA 连接酶是将一段DNA 片段3′端的羟基与另一DNA 片段5′端磷酸基团上的羟基连接起来形成酯键，而不是连接互补碱基之间的氢键。

第1节 基因工程的基本操作程序

一、基因工程的基本操作步骤为四步曲：

1.目的基因的获取；

2.基因表达载体的构建；

3.将目的基因导入受体细胞；

4.目的基因的检测与鉴定。

DNA

连接酶、解旋酶作用的正确顺序是

（一）．目的基因的获取

1．目的基因：主要是指编码蛋白质的结构基因。

目前被较广泛提取使用的目的基因有：苏云金杆菌抗虫基因、人胰岛素基因、人干扰素基因、种子贮藏蛋白基因、植物抗病基因等

2．目的基因的获取方法：

（1）基因文库:将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，

基因文库基因组文库：含有一种生物的所有基因。

部分基因文库（如cDNA文库）：含部分基因，可由mRNA反转录而来。（构建基因文库的目的：为了在不知目的基因序列的情况下，便于获得所需的目的基因。）

3.组成基因文库的目的基因获取途径

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（1）利用PCR技术扩增目的基因

PCR：是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。

原理：DNA双链复制

原料：模板DNA；RNA引物；四种脱氧核苷酸；热稳定DNA聚合酶（Taq酶）；

方法：DNA受热变性解旋为单链、冷却后RNA引物与单链相应互补序列结合、DNA聚合酶作用下延伸合成互补链。

过程：热变性（90-95）、退火（55-60）、延伸（70-75）。

特点：指数形式扩增

二．基因表达载体的构建（基因工程的核心—体外进行）

1．目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在；可以遗传给下一代；使目的基因能够表达和发挥作用。

目的基因：根据需要来选择。

2．基因表达启动子：位于基因首端，RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动转录基因载体的组成终止子：位于基因尾端，使转录在所需要的地方停下来。

标记基因：鉴别受体细胞中是否含有目的基因。

3．方法：同种限制酶分别切割载体和目的基因，再用DNA连接酶把两者连接。

目的基因与运载体结合（以质粒为运载体）

4．条件：同种限制酶、DNA连接酶、（目的基因、启动子、终止子、标记基因）

三．将目的基因导入受体细胞

转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。

①导入植物细胞：常用农杆菌转化法（将构建的载体导入农杆菌，再让农杆菌感染植

物细胞），基因枪法、花粉管通道法。（过程重点介绍）

②导入动物细胞：显微注射法（将基因表达载体提纯，用显微仪注射到受精卵中）（过程重点介绍）

③导入微生物细胞：Ca2＋处理受体细胞成为感受态细胞，再进行混合。

提示：农杆菌转化法的原理是利用农杆菌（胞内寄生菌）对植物的感染而把目的基因导入受体细胞。

四．目的基因的检测和鉴定

1、分子检测：导入检测+表达检测

①导入检测：利用DNA分子杂交技术，目的基因DNA一条链（作探针）与受体细胞中提取的DNA杂交，看是否有杂交带。

②表达检测：目的为了检测是否转录出了mRNA，利用DNA-mRNA分子杂交技术，目的基因DNA一条链（作探针）与受体细胞中提取的mRNA杂交，看是否有杂交带。

③表达检测：目的为了检测目的基因是否翻译成蛋白质。抗体与蛋白质进行抗原－抗体杂交，看是否有杂交带。

2、个体水平的鉴定：进行抗虫、抗病的接种实验，根据其性状判断是否表达。

提示：①DNA分子杂交技术首先提取受体细胞中的DNA，然后高温解成单链，再与同位素标记的DNA探针杂交；②抗原－抗体杂交所用到的抗体是用表达出的蛋白质注射动物进行免疫，产生相应的抗体，并提取出而来的