PCR产物胶回收实验

实验六 PCR产物胶回收实验

一、实验目的

1. 掌握胶回收的常规操作

2. 了解胶回收PCR产物的目的

二、实验原理

利用胶回收试剂盒纯化PCR产物。本试剂盒提供一个从TBE或TAE电泳缓冲液配制的琼脂糖凝胶中提取高质量DNA的简单、快速、有效的技术，适合从浓度≤3%，高，低熔点琼脂糖凝胶中，回收长度为60bp~23Kb的DNA片段，小于100bpDNA片段回收率为10%~55%，0.1~10kbDNA片段回收率最大为99%，大于10kbDNA片段回收率为

20~70%。回收的基因组DNA可以应用到克隆，测序，限制性酶切等各类下游分子生物学实验。

三、试剂及配套设备和材料

3.1 试剂

Extraction buffer Wash buffer Elution buffer

3.2 配套设备和材料

无菌1.5ml离心管各种规格移液器和无菌移液器吸头

无水乙醇异丙醇可能需要3M KAc (pH 5.0) 离心机

四、基本技术参数

五、操作步骤

1. 用干净、锋利的手术刀，将含有目的DNA片段的琼脂糖凝胶切下，并放入1.5或

2.0 ml离心管中。

请尽量切去不包含DNA片段的凝胶。一般情况下，电泳的DNA上样量≥50 ul （50ul为最终洗脱体积）。

2. 按1：3的比例（凝胶质量毫克数：融胶液体积微升数）加入Extraction buffer。

例如：100mg凝胶应加入300ul Extraction Buffer。对于每人份试剂用量，凝胶

质量不能超过400mg。

3. 于恒温水浴或金属浴中50℃温育，直到凝胶融化。

一般温育时间为10分钟，温育过程中没隔2-3分钟混匀一次。如果温育后，混合液体颜色变紫，请加入10 ul 3M KAc （pH 5.0），使混合液颜色变回黄色。

4. 可选：按1：1的比例（凝胶质量毫克数：异丙醇体积微升数）加入异丙醇，并混

合均匀。

如DNA片段大于500bp/小于4kb，不需要加异丙醇。

5. 将混合液全部转移到Spin column内，于6,000g离心1分钟，并弃去接液管内

液体。

如混合液体积大于750ul可先转移750ul，其余的液体待离心弃液后，再转移。

6. 向Spin column内加500ul Extraction Buffer，于12，000g离心30~60秒，并弃去接液管内液体。

7. 向Spin column内加750ul Wash Buffer，于12，000g离心30~60秒，并弃去接液管内液体。

如果回收的DNA片段将用于盐浓度敏感的实验，请在加入Wash buffer后静置

2~5分钟，再离心。

8. 再次于12,000 rpm离心1分钟，然后将spin column转移到无菌的1.5ml离心管中。

如不进行该步离心，则无法保证离心柱内残液被彻底清除。

9. 向Spin column内加50ul Elution Buffer、水或TE溶液，并于室温静置1分钟。

可根据实验的实际需要决定Elution Buffer用量。但不要低于20ul。

10. 于12，000g离心1分钟，微量离心管内溶液中含有目的DNA片段。

回收的DNA可直接用于各类下游分子生物学实验，如果不立即使用，请保存于-20℃。

六、注意事项

1. 为了保证没有外源DNA的污染，电泳的buffer和gel都是新制的，切胶的台子清理干净，刀片最好洗净灭菌。

2. 为了减少胶的体积，我们可以用相对比较薄的胶来跑电泳，这样可以减少回收试剂引起的一些后续麻烦。

2. 在洗脱前，将洗脱液于30~60℃温浴，可提高提取效率。

七、思考题

1. 简述影响DNA在琼脂糖凝胶中迁移速率的因素。

2. 简述PCR上样缓冲液（loading buffer）的成分及其作用。