戊二胺的生物合成-李治

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(Li chong, et al., 2007, petrochemical technology )
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发酵生产微生物代谢途径及其发酵酶转化生产流程
源自文库
目前最常用的微生物是大肠杆菌和谷氨酸棒状杆菌，已经对戊二胺在细 菌体内的代谢过程进行了深入研究。以大肠杆菌为例，在大肠杆菌体内， 戊二胺是经赖氨酸途径合成的。赖氨酸由 TCA 循环产生的草酰乙酸和 l 分子丙酮酸、2 分子氨、4 分子NADPH(还原型辅酶 II)作用，经过 10 步反应得到。首先，草酰乙酸经氨基化合成天冬氨酸；然后，天冬氨酸 在 3 种同工酶作用下，通过磷酸化转化成天冬氨酰磷酸；天冬氨酸磷酸 经还原形成天冬氨酸半醛；天冬氨酸半醛与丙酮酸再经6步反应生成二氨 基庚二酸，最后经脱羧形成产物赖氨酸。
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戊二胺在关闭孔蛋白通道和保护大肠杆菌免受氧的毒害方 面也起着重要的作用；内源性戊二胺的分泌以及胞内高浓度戊 二胺积累可导致外膜渗透性降低，抑制某些抗生素如头孢霉素 类抗生素的作用。在农业上，外源施加戊二胺可以改善坐果和 促进果实发育，提高果实的产量；在医学上，它也可作为一种 有效治疗痢疾的药物；在工业上，戊二胺与二元酸进行聚合反 应可合成优质高分子材料——新型尼龙。
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戊二胺的蒸发、蒸馏提取
发酵浓缩液储存罐 ↓NaOH储存罐 调pH ↓ 蒸发罐预热器 ↓ 真空泵蒸发罐 ↓ 液液分相罐 ↓ 一级蒸馏罐 ↓ 二、三级蒸馏罐 ↓ 成品罐 ↓ 尼龙合成车间
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上图为山东凯赛生物材料有限公司拍摄
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微生物转化法生产尸胺的过程可分为菌体发酵培养过程（产酶过程）、底 物与菌体转化反应过程和产物尸胺的分离提取精制过程。日本东丽尖端融合研 究所用高效表达大肠杆菌来源的赖氨酸脱羧酶高效率生成尸胺。其流程如下： (1) 将大肠杆菌中 cad A 基因进行 PCR 扩增，然后连入到pUC18中，将质粒 转入宿主菌大肠 JM109 菌株中，利用卡那霉素筛选出转化子。 (2) 将E.coli JM109 pcad A 菌株在培养基中进行培养，种子液接入的培养基 中，在发酵罐中进行培养。经培养，培养物转入发酵罐中继续培养，培养之后 加入IPTG(溶于水中)诱导，再继续培养。 (3) 培养结束后经离心来收集菌体，可得到湿菌体，再将底物和湿菌体加入到 反应器中进行转化反应。并不断向其中流加己二酸，目的是中和产生的戊二胺， 使pH维持在6.0左右，尸胺转化率可达到 98%。 (4) 反应液离心除去菌体，在上清液中加入活性炭并在 20 ℃下搅拌进行脱色， 然后过滤除去活性炭，滤液再减压浓缩。然后，在4℃冰箱中冷却析出晶体。离 心收集晶体，于减压干燥器中干燥数天。 (5) 将所得干燥的晶体经 X 射线衍射分析，结果发现，晶体是按戊二胺:己二 酸摩尔比为 1:1的方式而形成的结晶，晶体纯度达到 99 %或更高，可直接进行 聚合反应生产尼龙。
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简述几种戊二胺的合成方法
戊二胺的制备方法主要可以分为两大类：化学合成法和生物转化法。 化学合成法条件苛刻、污染环境，而生物转化法过程复杂、成本较高。 目前，利用基因工程技术构造代谢工程菌来直接规模化制备人类所需 产品是最经济、最环保和最有前途的方法，是代谢工程研究的方向和 热点。
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1.实验室的制备 采用戊二腈为原料，把戊二腈的无水乙醇溶液煮沸之后，快速加 入金属钠，反应完之后向其中加入水，蒸出乙醇，剩余反应物采用过 热蒸汽蒸馏。蒸出的馏出物用稀盐酸中和、蒸干，剩余物用冷无水乙 醇洗涤，再用少量固体氢氧化钾和水分解所得的盐酸盐，蒸去水，减 压蒸馏，即可得到戊二胺。西北大学李崇等人采用非晶态镍催化剂在 戊二腈上催化加氢来制备戊二胺，取得不错结果。 2.生物体直接提取法 戊二胺是生物体内广泛存在的具有生物活性的含氮碱，虽然它在 腐烂的尸体和精液中都可以分离得到，但是含量较低，不适合大量的 生产，而且也未曾有此方面的报道。
戊二胺的生物合成
——生物制药技术
姓名： 李治
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戊二胺的简介和其生理作用及工业应用
戊二胺(Diaminopentane)，又名尸胺、1,5-二氨基戊烷、 五亚甲基二胺或尸毒素，是生物胺类(包括腐胺、精胺、亚 精胺和尸胺等)中的一种。1885 年，德国柏林的医师布瑞 哲在腐败的尸体中首次发现该胺类，并以此得名尸胺。戊 二胺是赖氨酸脱羧酶催化赖氨酸脱羧产生的。
从工业发酵肉汤中分离纯化出戊二胺单体，并获得较高的产量，可以使 用快速萃取的纯化方法。从发酵肉汤中分离纯化提取戊二胺单体主要包括分 离、絮凝、过滤等方法去除细胞；然后，加入氢氧化钠、氢氧化钙或氢氧化 钾来调节p H>12；随后，通过加热发酵肉汤来水解可能存在的副产物N-乙酰 基-二氨基戊烷；再使用在碱性环境下稳定的有机溶剂（如正丁醇）进行萃 取，可得到戊二胺的粗产品。利用色谱、蒸馏或酸沉淀法将戊二胺纯化，纯 化后的戊二胺单体达到聚合级要求，用于生产聚酰胺。
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传统化学催化合成戊二胺法
采用非晶态镍催化剂、以无水乙醇为溶剂,在高压反应釜中进 行了戊二腈催化加氢制备戊二胺。非晶态镍催化剂上戊二腈催化加 氢制备戊二胺的反应历程为:首先戊二腈催化加氢生成5一氨基戊腈, 然后5一氨基戊腈催化加氢生成目标产物戊二胺和副产物六氢吡啶。 经查找文献其最佳反应条件为： 非晶态Fe-Mo一Ni一Al催化剂用量15%、NaoH助催化剂用量 0.25%、戊二腈与乙醇的体积比1:5、反应压力3Mpa、反应温度70℃ 的优化反应条件下,戊二睛的转化率达100%。
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发酵液中戊二胺的提取和精制
先将发酵液中的细胞组分除去，然后经过四步，即发酵液碱化、热处理、 有机萃取剂萃取、有机相分离戊二胺。碱化发酵液至pH>11，热处理的目的 是使乙酰基-DAP水解，温度选在90-110℃或在过压下加热到更高的温度进行 热处理。萃取剂选用偶极质子性有机溶剂，如链烷醇或环烷醇，萃取过程和 随后的相分离过程在升温条件下进行。
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3.微生物转化法 微生物转化法主要是利用底物赖氨酸在赖氨酸脱羧酶的催化下脱去羧 基生成戊二胺。L-赖氨酸脱羧酶存在于 E.coli、尸杆菌等大多数微生物中， 一些高等植物中也有。日本太卡哈斯等通过游离大肠杆菌 L-赖氨酸脱羧酶 用 D, L-赖氨酸作为底物以不对称降解 L-赖氨酸的方式得戊二胺和 D-赖 氨酸。该反应步骤多，产物分离过程复杂，成本高，产率低(38 %)。日本 东丽尖端融合研究所用高效表达大肠杆菌来源的赖氨酸脱梭酶的大肠杆菌 高效率生成戊二胺。
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4.微生物直接生产法 日本东丽尖端融合研究所通过对赖氨酸工业生产上所用的谷氨酸棒 杆菌进行转基因操作，又开发了从葡萄糖生产戊二胺的技术。可以用高 丝氨酸脱氢酶基因被破坏的、用来发酵生产赖氨酸的谷氨酸棒状杆菌菌 株为宿主，把来源于大肠杆菌的赖氨酸脱梭酶基因的表达单元插入高丝 氨酸脱氢酶基因座。通过玻璃发酵罐的发酵试验发现，培养 15 小时可 以生产出 2.5 g/L 戊二胺。目前，通过基因工程筛选得到的谷氨酸棒状 杆菌是生产戊二胺的最好菌株。生物法生产戊二胺需要解决的首要问题 是提高该菌株对高浓度产物的耐受性。