快速体外分离、长期培养人Th17细胞

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Th17研究方法和产品应用

七、产品信息
研究意义
• Th17细胞与自身免疫病有着非常密切的关系. 包括类风湿性关节炎、多发性硬化、系统性红斑狼疮 (SLE)、以及哮喘等患者的血清及组织中检测到了 IL-17的高表达。 • IL-17在哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)和肿瘤等也有密切的关系。
报告内容一、Th17的发现二、Th17细胞分化三、Th17细胞的功能四、研究方法
Th17细胞发育与Th1和Th2细胞一样，受各种因素的协调控制。
Th17发现
Th17细胞发现于对实验性自身免疫性脑脊髓炎 (EAE) ，以及对胶原诱导的关节炎(CIA)的研究。传统观点认为，上述疾病由 Th1 细胞介导，然而中和 Th1细胞因子IFN-γ和（或）IL-12的功能，并不能减轻疾病进程. 而中和IL-23则延缓了疾病的进程。证实IL-23的缺失可以降低体内IL-17+T 细胞的比例，而不影响IFN-γ+ T 细胞的含量。
报告内容一、Th17的发现二、Th17细胞分化三、Th17细胞功能四、研究方法
五、Th细胞亚群比较六、研究方法
七、产品信息
生物学功能 Th17 细胞能够分泌产生 IL-17A 、 IL-17F 、 IL-6 、 IL-22 以及 TNF-α 等 , 其功能主要就体现在它分泌的这些细胞因子集体动员、募集及活化中性粒细胞的能力上。 Th17 细胞产生的最重要的效应因子是IL-17, 其受体在体内广泛表达， IL-17 细胞因子家族包括 IL-17A 、 IL-17B 、 IL-17C 、 IL-17D 、 IL-17E(IL-25 ) 和 IL-17F 。通常， IL-17 是指 IL-17A 。 IL-17 具有促炎症作用，诱导促炎细胞因子 (如IL-6、TNF) 、趋化因子(如MCP1和MIP2)和基质金属蛋白酶的表达，引起组织细胞浸润和组织破坏。 IL-17 也参与中性粒细胞的增殖、成熟和趋化，对 T 细胞的活化起协同刺激作用，并能促进树突状细胞的成熟

快速体外分离、长期培养人Th17细胞

快速体外分离、长期培养人Th17细胞方法1.Subject全血2.CD4+T细胞浓缩采用RosetteSep（StemCell Technologies，Canada）进行阴性选择得到浓缩CD4+T细胞。

建立标准密度梯度离心，分离出淋巴细胞3.CD4+T细胞刺激将浓缩的CD4+T细胞悬浮在RPMI1640培养基中（Sigma），包含青霉素/链霉素，L-谷氨酰胺，HEPES缓冲液和10%小牛血清（R10），浓度为1×106个细胞/ ml.含 3×106个细胞的3mlR10，在15ml Falcon管中，用每毫升含4μL（1mg/ml）PMA和2μL（1mg/ml）伊沃诺霉素（AG Scientific，San Diego，CA）的细胞溶液刺激。

继而加入总量3μL的包含CD49d （1mg/ml）和CD28（0.5mg/ml）的共刺激抗体（BD Biosciences）。

随后细胞在37℃、5%CO2条件下孵化3个半小时。

阴性对照采用相似方法，但用R10替换PMA和伊沃诺霉素。

为了用细胞内细胞因子标记法测量IL-17产量，浓缩的CD4+T细胞用10μL Brefeldin A（1mg/ml）刺激。

4.IL-17捕捉复合物的准备IL-17捕捉复合物由2个生物素标记的抗体组成，2个抗体通过一个抗生物素蛋白分子连接。

直接连在T细胞表面CD45分子的抗体与IL-17抗体配对。

2μL生物素标记的CD45抗体（clone H130）（Caltag，Invirtrogen，CA）和20μL生物素标记的IL-17抗体（0.5mg/ml）（clone：eBio64DEC17）（ebiosciences，CA）混合加入eppendorf管，并彻底漩涡。

然后，加入2μL未作标记的5mg/ml的生物素（Invitrogen，CA），并立即充分混匀。

复合物在室温下孵化10分钟，使用前再次漩涡。

5.IL-17体外捕获分析被刺激过的细胞用含有2%小牛血清（2%FCS/PBS）的冰冻PBS（Cellgro ，Mediatech，V A）,冲洗，以500×克离心10分钟成小球，上清液被完全吸出。

Th17细胞、调节性T细胞、Th1细胞平衡失调与As病情活动度的关系

Th17细胞、调节性T细胞、Th1细胞平衡失调与As病情活动度的关系张海龙;张俊英;晋学英;牛敬宪;黎珍娟;张凤兰【摘要】Objective To investigate the relationship of immune imbalance with Ankylosing Spondylitis ( AS) patients with disease activity ( ASDAS) of Th17 cells,Th1 cell,regulatory T cells ( Treg) . Methods The cell tstions of blood CD4 + Th17, CD4 + Th1 and CD4 + CD25 + Treg of ASpatients(n=60)and control group(n=60)were detected with flow cytometry. The levels of interleukin -6, IL-8, IL-17, IL-23, (IL-6, IL-8, IL-17, IL-23) and tumor necrosis fact orα (TNFα) were Measured with ELISA. The relation-ship of immune imbalance of Th1,Th17 and Treg cell between ASDAS were analyzed. Results The levels of CD4 + Th1 and CD4 + CD25 + Treg cell of AS group were lower than control group(P<0. 05). The lev-els of IL-6,IL-17, IL-23 and TNFαof AS group were higher than control group(P<0. 05). The levels of CD4 +Th17,IL-6,IL-17,IL-23 and TNFαof severe group (ASDAS≥2. 1) were higher than stable disease ( ASDAS <1. 3) group and moderate disease activity group (1. 3≤ASDA S<2. 1) . and the levels of CD4 +Th1, CD4 + CD25 + Treg cells of severe group (ASDAS≥2. 1) were lower than stable disease (ASDAS <1. 3) group and moderate disease activity group (1.3≤ASDAS<2. 1),the differences were all statistically significant (P<0. 05). By Pearson correlation analysis shows, IL-6 (r = 0. 412, P = 0. 000), IL-17 (r= 0.396, P = 0.000), IL-23 (r = 0.384, P = 0.000) and TNFα(r = 0.318, P = 0.004) were positively correlated with ASDAS. Conclusion AS presence of Th1 cellsin patients , Th17 cells and Treg cell immune imbalance, and has a close relationship with the degree of ASDAS AS patients, can provide guidance for the prevention and treatment of AS.%目的：探讨效应CD4+T细胞分泌的Th1细胞、Th17细胞及调节性T细胞( Treg)免疫平衡失调与强直性脊柱炎( AS)患者强直性脊柱炎疾病活动评分( ASDAS)的关系。

特应性皮炎的细胞、皮肤模型构建方法研究进展

特应性皮炎的细胞、皮肤模型构建方法研究进展邵钲超，魏明镜，万昊悦，王奕恒，陈文琦南京医科大学附属南京医院南京市第一医院皮肤科，南京210006摘要：特应性皮炎（AD）是一种常见的慢性炎症性皮肤病，表皮屏障破坏和辅助性T细胞2免疫反应失调被认为在该疾病发病中发挥重要作用。

体外疾病模型已成为研究AD越来越流行的方法，最简单的模型是单细胞培养模型，可揭示不同细胞类型在AD病理过程中的参与程度、调节网络和信号通路，有助于理解AD的发病机制和病理生理过程。

二维共培养模型将不同类型的细胞在二维培养基质上共同培养以模拟表皮细胞与免疫细胞的相互作用。

三维模型则提供了更为复杂与真实的生理环境，在三维空间中模仿人类皮肤特征，再现细胞因子与药物在真实皮肤组织中的输送和分布。

随着对神经—免疫—皮肤相互作用在AD炎症反应中作用的认识不断加深，一种芯片上皮肤系统装置正在开发中。

目前还没有一种体外疾病模型能够完全模拟AD的整体特征。

在进行AD相关研究时需要考虑多种可用模型优缺点的平衡。

关键词：特应性皮炎；皮肤模型；细胞模型；芯片上皮肤；人体皮肤等效物doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2024.08.028中图分类号：R751 文献标志码：A 文章编号：1002-266X（2024）08-0111-05特应性皮炎（AD）是由辅助性T细胞2（Th2）驱动的慢性炎症性疾病，为充分了解其炎症过程，研究者们常选用小鼠、豚鼠、犬等动物作为实验对象。

目前动物模型的构建方法主要包括自发性AD模型、致敏剂诱导AD模型及基因方法建立AD模型，但都无法避免动物和人类在解剖、生理和免疫系统方面的差异［1-2］。

尽管动物模型能够模拟AD的一些特征如皮肤炎症、角化异常和免疫细胞浸润，但可能无法完全模拟AD的过敏性变态反应的复杂性和慢性过程。

此外，由于药物代谢差异，在动物模型中观察到的药物效果未必能准确预测人体应用效果，导致研究成果的转化性较差。

2023神经酰胺及神经酰胺合成酶在哮喘中的作用

2023神经酰胺及神经酰胺合成酶在哮喘中的作用摘要神经酰胺是鞘脂代谢的中心，也是一种重要的信号分子，参与细胞分化、增殖、凋亡和迁移等多种生物功能。

神经酰胺合成酶介导神经酰胺的合成。

哮喘是一种以气流阻塞、气道高反应性和肺部炎症为特征的慢性气道疾病,极大地影响了患者的生活质量，是重要的公共卫生问题。

研究表明，神经酰胺在哮喘的病理生理发展中发挥重要作用。

本文重点讨论神经酰胺对参与哮喘发病的多种细胞的影响，以及不同种类神经酰胺作用的差异性，以期为人们更好地了解哮喘及寻找哮喘潜在治疗靶点提供理论基础。

关键词：哮喘；神经酰胺类；综述文献(主题)支气管哮喘严重影响人们的生活质量及健康状况。

我国20岁及以上人群哮喘患病率为4.2%,患者总数达4570万例，处于高患病率、低治疗率、低控制率的阶段。

哮喘在全球造成残疾生活年限的主要疾病中排名第16位，在疾病负担的主要疾病中排名第28位，是重大公共卫生问题。

哮喘是一种以慢性气道炎症和气道高反应性(airwayhyperreactivity z AHR)为特征的异质性疾病,主要表现为反复发作的喘息、气急、胸闷或咳嗽等。

哮喘的发病由多种炎症细胞、炎症介质和细胞因子共同参与。

鞘脂是一类复杂的脂质，是细胞膜的重要结构成分，参与细胞内外信号转导，涉及细胞的增殖、分化、凋亡、转移及血管生成、免疫细胞转运等多种生物学效应。

迄今为止，鞘脂已经在多种人类疾病中进行了研究，表现出极大的结构和功能多样性。

神经酰胺是鞘脂代谢的中心，由神经鞘氨醇长链碱基和可变长链的脂肪酸组成。

神经酰胺主要有3种合成途径：(1)从头合成途径:由丝氨酸棕桐酰转移酶(Serinepa1mitoy1transferase,SPT)将1-丝氨酸和棕楣酰-CoA缩合为3-酮二氢鞘氨醇为起始步骤，之后经一系列酶的作用下生成神经酰胺；(2)鞘磷脂酶途径：鞘磷脂酶将鞘磷脂水解生成神经酰胺；(3)补救途径：先将复杂的鞘脂转化为鞘氨醇，然后通过鞘氨醇的再酰化生成神经酰胺。

人外周血Treg、Th17细胞检测方案

人外周血Treg/Th17检测标准流程1.材料1.1组织外周血。

1.2实验仪器名称厂家型号超净工作台-微量移液器-水套式CO2细胞培养箱-Forma II 水平低速离心机-Centrifuge 5810 R流式细胞仪-LSRFortessa1.3主要实验试剂及耗材名称品牌货号规格淋巴细胞分离液达科为DKW33-R0100 100mL Cell Activation Cocktail（with Brefeldin A）Biolegend 423303 100 ul RPMI 1640 培养基，含L-谷氨酰胺basalmedia L210KJ 500mL 胎牛血清FBS Serana S-FBS-EU-0100mL 磷酸盐缓冲液（PBS），pH7.2 basalmedia B310KJ 500ml FITC anti-human CD3 Biolegend 300305 25testsPE anti-human CD25 Biolegend 302605 25testsAPC anti-human CD4 Biolegend 317415 25testsBV421 anti-human Foxp3 Biolegend 320123 25testsPE-Cy7 anti-human IL-17A Biolegend 512315 25tests Zombie Aqua Fixable Viability kit Biolegend 423101 100tests Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set Kit MultiSciences IC001 100tests 3mL巴氏吸管Biosharp BS-XG-03 100支/盒15mL螺口尖底无菌离心管LABSEE LN-M151 100只/包50mL螺口尖底无菌离心管LABSEE LN-M501 50只/包24孔细胞培养板Nest 702011 1块/包2.方法2.1外周血准备EDTA-K2抗凝外周血2~4mL。

三种不同方法体外诱导CD4+T细胞向TH17细胞分化与增殖的效率☆

中国组织工程研究与临床康复第15卷第44期 2011–10–29出版Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Research October 29, 2011 Vol.15, No.44 ISSN 1673-8225 CN 21-1539/R CODEN: Z LKHAH8285 1ReproductiveMedical Center,Renmin Hospital of Wuhan University, Wuhan 430060,Hubei Province, China; 2Departmentof Nephrology, Tongji Hospital, TongjiMedical College, Huazhong Universityof Science and Technology, Wuhan 430030, Hubei Province, ChinaYin Tai-lang☆,Studying for doctorate, Reproductive Medical Center, Renmin Hospital of Wuhan University, Wuhan 430060, Hubei Province, China reproductive@126.comCorrespondence to: Yang Jing, Doctor, Professor, Chief physician, Reproductive Medical Center, Renmin Hospital of Wuhan University, Wuhan 430060, Hubei Province, China Correspondence to:He Fan, Doctor, Lecturer, Departmentof Nephrology, Tongji Hospital, TongjiMedical College, Huazhong Universityof Science and Technology, Wuhan 430030, Hubei Province, China Received:2011-07-25 Accepted:2011-09-13三种不同方法体外诱导CD4+T细胞向Th17细胞分化与增殖的效率☆尹太郎1，邹宇洁1，杨菁1，何凡2，李赛姣1，吴庚香1，李星1，王雅琴1，罗金1，李维1，徐望明1Comparison of differentiation and proliferation efficiency from CD4+ cells to Th17 cells induced by three different methodsYin T ai-lang1, Zou Yu-jie1, Yang Jing1, He Fan2, Li Sai-jiao1, Wu Geng-xiang1, Li Xing1, Wang Ya-qin1, Luo Jin1, Li Wei1, Xu Wang-ming1AbstractBACKGROUND: Th17 cells participate in the occurrence of many inflammatory diseases, but their induced differentiationefficiency remains poorly clear.OBJECTIVE: To compare the differentiation and proliferation efficiency from CD4+ cells to Th17 cells induced by three differentmethods.METHODS: Three methods to induce Th17 cells in vitro are as follows: (1) stimulation with CD3 and CD28 antibodies followed byaddition of interleukin (IL)-6 and transforming growth factor-β (TGF-β) in the culture medium and finally culture for 3 days; (2)based on method (1), addition of extra IL-1β and tumor necrosis factor-α (TNF-α) and culture for 3 days; (3) based on method (2),washing out previous cytokines on the 3rd day, culture for 2 days, stimulation with CD3 and CD28 antibodies again, addition ofIL-23 and finally culture for 3 days.RESULTS AND CONCLUSION: The proportion of Th17 cells in CD4+T cells was (8.5±2.8)%, (26.9±4.3)%, and (44.3±5.5)% afterinduced by three above-mentioned methods, respectively, with significant difference among these three methods (P < 0.01).These findings suggest that addition of IL-1β, TNF-α and IL-23 into the culture medium facilitates the induced differentiation fromCD4+ cells to Th17 cells.Yin TL, Zou YJ, Yang J, He F, Li SJ, Wu GX, Li X, Wang YQ, Luo J, Li W, Xu WM. Comparison of differentiation and proliferationefficiency from CD4+ cells to Th17 cells induced by three different methods. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu LinchuangKangfu. 2011;15(44): 8285-8288. [ ]摘要背景：研究认为Th17细胞参与了许多炎症性疾病的发生，但其体外诱导分化效率尚不明确。

Th2表达的细胞因子

Th2表达的细胞因子(如IL-4、IL-5、IL-9及IL-13)在其免疫应答过程中发挥重要作用。

近年来，人们对IL-9在Th2型免疫应答中作用给与了更多的关注。

过去人们一直认为IL-9属于Th2类细胞因子,最近，在《NatureImmunology》上先后登载了两篇独立鉴定出“Th9”细胞(即分泌IL-9的Th细胞)的文章，可能为已有的Th细胞亚群又添新成员。

1IL-9的结构IL-9最初被认为是一种T淋巴细胞生长因子，人IL-9mRNA全长591bp,小鼠IL-9mRNA全长536bp。

人和小鼠的IL-9基因结构类似，均含5个外显子，其蛋白质水平有55%的氨基酸同源性。

IL-9受体(IL-9R)属共Y链的细胞因子受体家族，由一条特异性的a链(IL-9R a)和一条Y链组成⑴。

IL-9与其受体结合后,可激发JAK1、JAK3相互磷酸化，进而促使STAT磷酸化,形成STAT1-STAT3异源二聚体、STAT1同源二聚体和STAT5同源二聚体并进入细胞核内,启动一系列相关基因转录表达，发挥相应的生物学作用［2］。

2IL-9的细胞来源2.1Th2细胞研究发现，小鼠Th2细胞亚群可分泌高水平的IL-9,IL-9的表达水平与Th2细胞的扩增程度相关。

Th2细胞亚群分泌IL-9的水平与IL-4正相关，阻断IL-4后,Th2细胞表达IL-9的水平下降［3］。

Chang等［4］报道，体外Th2细胞亚群共表达IL-4和IL-9,但体内实验尚未证实Th2细胞亚群能同时表达IL-4和IL-9。

2.2Th9细胞2008年底,Stockinger实验室和Kuchroo实验室同时发现了一群新的效应T细胞亚群Th9，以分泌细胞因子IL-9和IL-10为典型特征［5,6］。

Th9细胞分泌IL-9受IL-25的调控,Angkasekwinai发现，小鼠哮喘模型中,IL-25能增强Th9细胞分泌IL-9,反之，阻断IL-25则降低IL-9的表达水平⑺。

骨髓间充质干细胞对重症哮喘患儿外周血Th17／Treg 的免疫调节作用

骨髓间充质干细胞对重症哮喘患儿外周血Th17／Treg 的免疫调节作用黄雪琼;檀卫平;吴葆菁;蓝丹;吴海飞;麦贤弟【摘要】目的：探讨骨髓间充质干细胞（ MSCs ）在体外对重度哮喘患儿外周血辅助性T细胞17（ Th17）和CD4＋CD25＋调节性T细胞（Treg）的免疫调节作用。

方法：体外分离、培养和鉴定MSCs。

MSCs经丝裂霉素处理后按不同比例（1∶1、1∶2、1∶10和1∶20）与哮喘患儿外周血T淋巴细胞（TLC）直接接触共培养，检测各组MSCs 对TLC的增殖调节作用。

选取上述1∶2比例共培养体系和单独TLC培养体系，ELISA法分别检测Th17的效应分子白细胞介素17（ IL-17）和Treg效应分子转化生长因子β（ TGF-β）水平，qRT-PCR法检测转录因子维甲酸相关孤儿核受体（RORC）及叉头框蛋白3（Foxp3）mRNA表达水平。

结果：MSCs 可显著抑制重度哮喘患儿TLC增殖，且随着MSCs数量的增加，抑制作用增强。

MSCs ＋TLC共培养组Th17转录因子RORC mRNA和效应因子IL-17表达较TLC组下降，同时TGF-β表达增高，而Treg细胞调控基因Foxp3 mRNA表达无明显改变。

结论： MSCs在体外可能通过抑制Th17分化及IL-17的分泌，同时上调TGF-β的表达，进而有效改善哮喘患儿的Th17/Treg失衡状态。

%AIM: To investigate the regulatory function of bone marrow-derived mesenchymal stem cells (MSCs) on T helper 17 cells (Th17) and regulatory T cells (Treg) in peripheral blood of severe asthmatic children . METHODS:MSCs were isolated , cultured and identified in vitro.MSCs digested with mitomycin were cocultured with T lymphocytes (TLC) at different ratios (1∶1, 1∶2, 1∶10 and 1∶20) from severe asthmatic c hildren for 72 h.The prolifera-tion of TLC was measured by CCK-8 method.In thecoculture system of the 1∶2 ratio and the single TLC system , the super-natant levels of interleukin-17 (IL-17) and transforming growth factor-β(TGF-β) were measured by ELISA.Th e mRNA expression of retinoic acid-related orphan nuclear receptor C (RORC) and forkhead box protein 3 (Foxp3) in TLC was de-tected by qRT-PCR.RESULTS:After cocultured with MSCs , the proliferation of TLC decreased significantly in a dose-dependent manner (P<0.05).It also showed decreases in IL-17 (3 799 ±441 vs 4 890 ±373, P<0.05) and RORC mRNA level (1.21 ±0.14 vs 3.85 ±0.48, P<0.05), while an increase in TGF-βlevel (209 ±32 vs 117 ±26, P<0.05) was observed.No influence on the mRNA expression of Foxp3 was found (P>0.05).CONCLUSION: MSCs suppresses Th17 polarization of naive peripheral blood CD 4 +T cells and matures Th17 cells secreting IL-17, which may ef-fectively revise Th17/Treg imbalance of asthma .【期刊名称】《中国病理生理杂志》【年(卷),期】2014(000)009【总页数】5页(P1694-1697,1702)【关键词】间充质干细胞;哮喘;Th17细胞;调节性T细胞【作者】黄雪琼;檀卫平;吴葆菁;蓝丹;吴海飞;麦贤弟【作者单位】中山大学孙逸仙纪念医院儿科，广东广州510120; 中山大学附属第一医院儿童重症监护室，广东广州510080;中山大学孙逸仙纪念医院儿科，广东广州510120;中山大学孙逸仙纪念医院儿科，广东广州510120;中山大学孙逸仙纪念医院儿科，广东广州510120;中山大学孙逸仙纪念医院儿科，广东广州510120;中山大学孙逸仙纪念医院儿科，广东广州510120【正文语种】中文【中图分类】R725.6哮喘是儿童常见的气道慢性炎症性疾病。

Th17细胞生物学功能及与心血管疾病关系的研究进展

综述Th17细胞生物学功能及与心血管疾病关系的研究进展崔瑶秦明照传统上CD4+T 细胞分为辅助性T 细胞(Th)1和Th2细胞亚群。

Th1产生干扰素(IFN )和白细胞介素(I L)2,活化巨噬细胞介导细胞免疫;Th2产生IL 4、I L 5和I L 13,活化嗜酸性粒细胞介导体液免疫。

但是,IFN缺陷鼠或IFN R 缺陷鼠无IFN 信号,仍可发生自身免疫病。

这说明还有另一Th 细胞亚群参与诱导自身免疫,此亚群细胞产生I L 17、IL 6和肿瘤坏死因子(T NF ),被称为Th17细胞亚群[1],在自身免疫性疾病,某些细菌、病毒和寄生虫等感染性疾病及肿瘤中起着重要的调节作用。

近年来越来越多试验发现Th17可能参与动脉粥样硬化(AS)斑块不稳定和急性冠状动脉综合征(ACS )的发病。

在此拟就Th17的分化和生物学功能,细胞因子调控和心血管疾病做一综述。

一、Th17的分化和生物学功能近期已能在健康人外周血中分离出Th17,Th17占CD4+T 细胞的05%。

Th17分泌的细胞因子有IL 17、IL 22、I L 23、TNF 、I L 6、粒细胞集落刺激生物因子(G M CSF ),其中I L 17为Th17分泌的代表性细胞因子。

I L 17家族由A F 6个成员组成(IL 17A F )。

IL 17与受体结合后,通过活化促分裂原活化蛋白(MAP )激酶和转录因子NFB 发挥其生物学活性[1]。

IL 17协同IL 18、T NF 、IFN 、CD40L 刺激I L 6、一氧化氮(NO)及前列腺素E2(PGE2),促进炎性反应,在中性粒细胞募集方面具有重要作用[2]。

近年研究发现在不稳定性心绞痛(UA)和急性心肌梗死(A M I)患者中IL 17、IL 6、I L 8活性增高,表明IL 17驱动炎症反应在临床表现不稳定的ACS 患者中起促进作用[3]。

二、Th17分化的细胞因子调节Ve l dhoen 等[4]发现,初始T 细胞可以在树突细胞或调节T 细胞及其产生的炎性因子转化生长因子(TGF )和IL 6的作用下分化成Th17表型。

人成纤维细胞的体外分离、纯化培养及细胞鉴定

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中国老年学杂志 2012 年 3 月第 32 卷
化学染色，细胞质中有棕色颗粒。成纤维细胞的标志物 Vimen- tin 为阳性，证明提取细胞为成纤维细胞。见细胞培养第 2 天； c：细胞培养第 12 天细胞生长呈鱼群状； d：细胞培养第 14 天，细胞生长呈漩涡状
5 Keisuke T，Jin H，Taranova O，et al. Generation of insulin-secreting isletlike clusters from human skin fibroblasts〔J〕. Science，2008； 283 （ 46 ）： 31601-7.
2结果 2. 1 成纤维细胞分离、纯化及培养通过酶消化法及贴壁筛选法，成功分离出人成纤维细胞。 2. 2 形态学观察倒置显微镜观察细胞形态，接种第 2 天可见细胞散在生长，分布不均的单个贴壁细胞呈梭形，成纤维细胞样。待细胞培养 10 ～ 14 d 时，细胞生长已达 80% ～ 90% ，呈鱼群样或漩涡状排列。见图 1。 2. 3 细胞 HE 染色成纤维细胞的形态呈梭形，也可见大多角形和扁平星形等。核仁明显，核呈椭圆形，可见 1 ～ 2 个核仁，胞体较大，胞质弱嗜碱性，染色质疏松着色浅。当细胞汇流时，呈鱼群样或漩涡状排列，细胞在 15 代内形态保持不变，经 HE 染色可以更清楚地观察到这些表现。见图 2。 2. 4 细胞免疫组化结果对第 6 代成纤维细胞进行免疫细胞
人成纤维细胞的体外分离、纯化培养及细胞鉴定
王玲玲1 马峰2 张玉成杜珍武张桂珍（吉林大学中日联谊医院中心研究室，吉林长春 130033）
〔摘要〕目的对人皮肤成纤维细胞进行分离、纯化、培养及细胞鉴定，探讨一种高效的分离及纯化方法，为细胞移植提供种子细胞。方法使用酶消化法原代提取人成纤维细胞，快速贴壁法纯化细胞，对细胞进行形态学观察、HE 染色，免疫细胞化学鉴定细胞标志物 Vimentin。结果利用倒置显微镜及 HE 染色，可见细胞为散在分布的梭形贴壁细胞，当细胞汇流时，呈鱼群样或漩涡状排列，且细胞在 15 代内形态保持不变。结论成功地发现快速提取成人成纤维细胞的方法，为成人自体细胞移植的研究奠定了基础。

小鼠淋巴结Th17细胞体外诱导分化及鉴定

小鼠淋巴结Th17细胞体外诱导分化及鉴定胞的体外诱导成Th17实验的具体流程：Fig1. Th17细胞的分化和功能Fig2. Th17细胞体外诱导分化实验简要流程图1.小鼠淋巴结单细胞悬液制备a. 获取小鼠淋巴结①CO2窒息法处死小鼠，确认死亡后并立即进行颈椎脱位。

用70%乙醇对小鼠解剖工具和腹部切口区域进行消毒。

从腹侧，抓住尿道口前方的皮肤，用剪刀沿着腹侧中线开始切割，直到到达下巴区域；②不同淋巴结的获取：腋窝淋巴结：位于胸肌后，腋窝附近；肱淋巴结：位于腋窝附近，结缔组织中；颈浅淋巴结：位于颈部；腹股沟淋巴结：位于臀部3条血管连接处；肠系膜淋巴结：切开腹面中线的腹膜，位于连接肠道的结缔组织中③收集的淋巴结将全部用镊子取出，并放置在无菌培养皿中，培养皿中含有5 mL autoMACS Running Buffer（Miltenyi Biotec）；Fig3. 小鼠淋巴结解剖图，A 肱淋巴结B 腋窝淋巴结C 肠系膜淋巴结D 颈浅淋巴结E 腹股沟淋巴结b. 淋巴结单细胞悬液制备①使用2张磨砂显微镜载玻片研磨器官。

将淋巴结放在一张显微镜载玻片的磨砂面上，并与第二张载玻片的磨砂面摩擦，直至分解。

重复上述步骤，直到所有淋巴结磨平；②用5mL注射器和21G的针头抽吸5mL淋巴结组织混合液；③将淋巴结组织混合液用40 μm细胞过滤器过滤入15mL离心管中，滤液即为单细胞悬液。

注：获得的单细胞悬浮液，如果有固体残留，可用新的滤器再次过滤，保证单细胞悬液的均一性。

2. Th17细胞体外诱导a. 分选naive CD4+ T细胞方法一：Miltenyi磁珠分选出CD4+CD25-细胞亚群（货号130-091-041）或Naive CD4+ T 阴选试剂盒（货号130-104-453）（具体操作以及试剂用量可参考产品说明书，标注的非常详尽）方法二：流式分选CD4+CD25-CD62L+CD44-细胞亚群分选后，收集细胞，进行流式表面染色进行纯度鉴定。

th17细胞

利用TH17细胞治疗多发性硬化
• 治疗多发性硬化等炎症性肠病
• 利用TH17细胞产生IL-17A和IL-17F，增强炎症反应
• 利用抗IL-17A和抗IL-17F抗体抑制炎症反应
05
TH17细胞研究的发展趋势与挑战
TH17细胞研究的未来发展方向

深入探讨TH17细胞的分化机制
• 揭示转录因子和信号通路在TH17细胞分化中的作用

⌛️
TH17细胞研究面临的挑战

TH17细胞分化的调控机制尚不完全明确
• 需要进一步研究转录因子和信号通路在TH17细胞分化中的作用
• 需要研究表观遗传调控在TH17细胞分化中的作用

TH17细胞在疾病中的作用机制尚不完全明确
• 需要进一步研究TH17细胞在自身免疫性疾病、炎症性疾病等疾病中
的作用机制
• 激活RORγt的表达
02
TGF-β信号通路
• 促进SMAD3的磷酸化
• 激活RORγt的表达
03
JAK-STAT信号通路
• JAK1和JAK2介导IL-6信号通路
• STAT3在TH17细胞分化中起关键作用
TH17细胞分化的调控策略
促进TH17细胞分化的策略
• 使用IL-6和TGF-β的激动剂

信号通路在TH17细胞分化中的作用
• IL-6和TGF-β信号通路促进TH17细胞分化
• JAK-STAT信号通路在TH17细胞分化中起重要作用
⌛️
表观遗传调控在TH17细胞分化中的作用
• DNA甲基化、组蛋白修饰等调控TH17细胞分化
TH17细胞分化的信号通路
01
IL-6信号通路
• 性疾病

异基因脂肪干细胞对系统性红斑狼疮患者Th17淋巴细胞亚群的调节

ｇｏｐ（００）ｏｃｕｉｎＰＤＣａｏｎｒｇｌｔｔｍｕｔｎａａｉｆｈ７ｉＬａｅｔ，ｗｉｒｕＰ＜．５．Ｃｎｌｓ３ＡＳＳｎｄｗｕａｅａｏｎｄｃｐｃｙｏｌｎＳＥｐｔｎｓｈｌｏｃｅｅｈａｔＴｉｅ
ｏｄＡｌｔｏｉｌＳＮＹｔｓｎＵｉｒｔ，ｕｎｚｏ１１０，ｈｎｎｆｉｅＨｓｔＵａ — ｅｎｖｓｙＧａｇｈｕ５０２Ｃｉａｉｆａｄｐａｏｆｅｉ
【ｂｔｃ】ＯｊｃｖＴｖｓｇｅｅｆｃｆｌｇｎｉａｉｓ —ｄｒｅｅｅｓ（ＤＣ）ｏｈ７ＡｓａｔｒｂｅｔｅｏｎｅｉｔｔｆｔｏａｏｅｅｄｏｉｉｔａｄｈｅｅｓｌｃｐｅｅｖｄｓｍｃｌＡＳｓｎＴｌｉｔｌ
【ｅｏｄ】ｓｔｉｌｕｅｔｅａｓｓＡＳｓｃｃｈｒ；ｈ７Ｉ一７Ｋｙｗｒｓｙｅｃｕｓｒｈｍｔｕ；ＤＣ；ｏｕｕｅＴｌ；Ｌ１ｓｍｐｙｏ干细胞治疗是当今医学研究的热点，有望解决许
２００９年２１， — Ｏ月本实验体外观察异基因ＡＳｓ活ＤＣ对
ｗｒａｕｅｙＦｅｅｍｅｓｒｄｂＣＭｎＬＳａｄＥＩＡ，ｒｓｅｔｅｙｔ８ｈＲｅｕｔｅｐｃｉｌ，ａ．ｓｌｖ４ｓＡＤＳｓｆｍｒｒｕｔｒｒｓｎｅｉｒｂａｔＣｒｏｐｍａｙｃｌｅｐｅｅｔｄｆｏｌｓ — ｉｕｂｌｅｍｏｐｏｏｙｕｄｒｏｔａｃｏｃｐ．Ｃｌｓｒｃｈｎｔｐａｏｓｓｅｔｗｔｅｏｔ．Ａｄｐｇｎｃａｄｏｔｏｅｉｉｒｈｌｇｎｅｐｉｌｍｉｒｓｏｅｋｃｅｌｕｆｅｐｅｏｙｅｗｓｃｎｉｎｉｒｐｒｓａｔｈｉｏｅｉｎｓｇｎｃｅｄｆｒｎｉｔｎｒｕｃｓｆｌｎｕｅｎｖｔ．ＴｅｅｓｇｉｃｎｌｅｒａｅａｄｉｃｅｓｆＴｌａｉｎＬ～１ｎｉｅｅｔｉｓｗｅｅｓｃｅｓｌｉｄｃｄｉｉｏａｏｕｙｒｈｒｉｎｆａｔｄｃｅｓｎｎｒａｅｏｈ７ｒｔａｄＩｉｙｏ７ｉ

Th亚群细胞及其特征性细胞因子与慢性牙周炎相关性的研究中期报告

Th亚群细胞及其特征性细胞因子与慢性牙周炎相关性的研究中期报告尊敬的评审专家：我是一名牙医学专业的研究生，目前正在进行关于Th亚群细胞及其特征性细胞因子与慢性牙周炎相关性的研究。

现在给您递交中期报告，报告如下：一、研究背景和目的慢性牙周炎是牙周疾病中最常见的一种，其发病率已经逐年上升，严重影响人们的口腔健康和生活质量。

研究表明，慢性牙周炎的发生和发展与机体免疫系统的异常反应有关。

T细胞在免疫调节中具有重要作用，其中，Th1亚群细胞、Th2亚群细胞和Th17亚群细胞是炎症状态中的关键细胞类型。

这些细胞产生的特征性细胞因子（IFN-γ、IL-4和IL-17等）在慢性牙周炎的免疫炎症反应中起到重要作用。

因此，本研究旨在探讨不同Th亚群细胞及其特征性细胞因子在慢性牙周炎中的表达及其相关性。

二、研究方法本研究分为两个部分：1.慢性牙周炎患者和健康控制组的免疫细胞分离和检测。

选取20名慢性牙周炎患者和20名健康人作为对照组。

通过腔内刷法采取口腔上皮细胞，并分离出外周血单个核细胞。

使用流式细胞仪检测不同Th亚群细胞在外周血单个核细胞中的比例，以及特征性细胞因子的表达水平。

2.基于上述结果，进一步进行细胞因子的体外实验。

将慢性牙周炎和健康对照组分离出的不同Th亚群细胞用于体外培养，根据不同细胞亚群分配不同的刺激剂，如PGA_2促进Th2细胞分化、IFN-γ促进Th1细胞分化、TGF-β促进Th17细胞分化等，通过ELISA检测细胞因子的分泌水平和细胞增殖情况。

三、研究进展目前，我们已经完成了上述方法的第一部分实验，进一步分析和统计结果正在进行。

分析结果预计将在本年度秋季公布。

根据预期结果，我们将进一步进行细胞因子的体外实验，以更直观地验证T细胞在慢性牙周炎免疫炎症反应中的作用和特征性细胞因子的分泌情况。

四、结论和展望本研究旨在通过探讨不同Th亚群细胞及其特征性细胞因子在慢性牙周炎中的表达及其相关性，为该疾病的诊断和治疗提供新的思路和方法。

体外活化Th17细胞最适条件的研究

体外活化Th17细胞最适条件的研究苏向阳;季双双;林锦梅;谢小元;吴洁;梁韵婷;赖维【期刊名称】《新医学》【年(卷),期】2013(044)002【摘要】目的:探索体外活化Th17细胞的适宜条件.方法:检测细胞表面CD69及细胞内IL-17的表达判断Th17细胞的活化效果,比较不同浓度(25、7、150、250 ng/ml)的佛波酯(PMA),联合离子霉素和莫能霉素刺激培养外周血单个核细胞(PBMC) 4～6 hTh17细胞的活化效果;另比较最佳浓度的PMA与离子霉素、莫能霉素组合和Leukocyte Activation Cocktail试剂刺激培养人PBMC 4 h Th17细胞的活化效果.结果:在25 ng/ml PMA加入离子霉素处理3h后再加莫能霉素刺激淋巴细胞3h后,CD4+T细胞中CD69阳性细胞含量＞90％,Th17细胞比例最高且结果稳定,而Leukocyte Activation Cocktail试剂刺激后CD69阳性细胞含量为30％～ 80％,含IL-17的CD4+T细胞未明显增多.结论:PMA 25 ng/ml加离子霉素(1μg/ml)刺激1h后,加莫能霉素(1.7 μg/ml)刺激培养3h,为体外活化Th17细胞的适宜条件.%Objective:To investigate the most appropriate condition for activating Thl7 cells in vitro. Methods ; Peripheral blood mononuclear cells ( PBMC ) were stimulated by PMA at different concentration (25, 75, 150, 250 ng/ml) , and sequentially with ionomycin for 1 hour and with monensin for another 3 hours. Then Thl7 cells were detected by flow cytometry after 4 or 6 hours. The result was compared with those stimulated with Leukocyte Activation Cocktail. Results:Thl7 cells could be activated effectively with 25 ng/ml PMA plus ionomycin and monensin inthat the proportion of CD69 + T cells accounted for over 90% and intracellular IL-17 increased. Leukocyte Activation Cocktail could also activate Thl7 cells to accumulate IL-17. But CD69 couldn't be detected from the cell membrane. Conclusion:The optimal condition for activating Thl7 cells in vitro is PMA (25 ng/ml) plus ionomycin (1 μg/ml) for 1 hour and with monensin (1.7 μg/ml) incubating for another 3 hours.【总页数】4页(P127-130)【作者】苏向阳;季双双;林锦梅;谢小元;吴洁;梁韵婷;赖维【作者单位】510630广州,中山大学附属第三医院皮肤性病科;252000聊城,山东聊城市人民医院皮肤科;510182广州,广州医学院检验系;510630广州,中山大学附属第三医院皮肤性病科;510630广州,中山大学附属第三医院皮肤性病科;510630广州,中山大学附属第三医院皮肤性病科;510630广州,中山大学附属第三医院皮肤性病科【正文语种】中文【相关文献】1.鸡红细胞体外融合最适条件的研究 [J], 刘哲;张峰;佟丹丹;安雪源2.Phb2/REA过表达慢病毒载体对体外Th17分化条件下小鼠单核细胞IL-17a表达的影响 [J], 谭卉卉; 林灿辉; 李街青; 陈佳玲; 史建强; 陈嵘祎; 刘胜波3.Phb2/REA过表达慢病毒载体对体外Th17分化条件下小鼠单核细胞IL-17a表达的影响 [J], 谭卉卉; 林灿辉; 李街青; 陈佳玲; 史建强; 陈嵘祎; 刘胜波4.人Th17细胞体外诱导分化条件的研究 [J], 王辰;郭薇;王欣;郁冬梅;王宇恒;姚文兵5.黄牛表皮细胞分离与体外培养最适条件的探索 [J], 秦粉菊;昝林森因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

人骨髓间充质干细胞与羊膜间充质干细胞的研究进展

人骨髓间充质干细胞与羊膜间充质干细胞的研究进展陈锐憬【期刊名称】《重庆医学》【年(卷),期】2017(046)027【总页数】4页(P3863-3866)【关键词】间质干细胞;人骨髓间充质干细胞;羊膜间充质干细胞【作者】陈锐憬【作者单位】昆明医科大学第一附属医院血液科/云南省血液病研究中心 650032【正文语种】中文【中图分类】R321间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)广泛存在于机体的各种组织器官中，例如骨髓、脂肪、羊膜、脐带等。

最初MSC是在骨髓中被发现的，因此骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSC)被认为是干细胞的最好来源，并且用BMSC作为衡量其他组织干细胞来源的标准[1]。

在其他组织来源的MSC中，羊膜间充质干细胞(amniotic mesenchymal stem cells,AMSC)因具有增殖能力强、免疫原性低和来源无伦理学争议等特点备受专家学者们的关注，被视为BMSC的理想替代物。

本文就BMSC和AMSC的生物学特性、免疫调节机制及临床运用的潜在价值进行综述。

hBMSC主要来源于骨髓，需经有创操作进行采集，具有一定伦理学争议。

hBMSC常用的体内分离方法有4种：密度梯度离心法、全骨髓贴壁分离法、流式细胞仪分离法和免疫磁珠分离法。

其中密度梯度离心法应用最广泛也最为经典，此方法获得的hBMSC纯度高，增殖活性强，但操作复杂，故研究者常用简单易行的贴壁法与此结合。

最近，有学者探索使用一种BMSC过滤装置分离纯化MSC，这种滤过装置可快速、高效、可靠地分离BMSC，避免BMSC被外界污染物污染[2]。

BMSC最常用的培养液是含10%～20%胎牛血清的DMEM培养基。

MSC在骨髓中的含量稀少，大约1×105～1×106个单核细胞中含有1个MSC，体外分离培养、扩增纯化在科学研究及临床应用当中就显得尤为重要。

用于t淋巴细胞的体外培养方法

用于t淋巴细胞的体外培养方法
T淋巴细胞是一种重要的免疫细胞，它们在体内起着重要的免疫调节作用。

为了更好地研究T淋巴细胞的生物学特性和免疫功能，需要进行体外培养。

下面介绍几种常用的T淋巴细胞体外培养方法。

1. 传统的T淋巴细胞体外培养方法
传统的T淋巴细胞体外培养方法是将T淋巴细胞与培养基、血清和生长因子等物质混合，然后在培养皿中进行培养。

这种方法的优点是简单易行，适用于大规模培养，但缺点是培养时间长，细胞易受到污染和变异。

2. 磁珠分选法
磁珠分选法是一种高效的T淋巴细胞体外培养方法。

该方法利用磁珠的磁性将T淋巴细胞从混合细胞中分离出来，然后进行体外培养。

这种方法的优点是分离效率高，细胞存活率高，可以得到纯度较高的T 淋巴细胞，但缺点是设备和试剂成本较高。

3. 无血清培养法
无血清培养法是一种新型的T淋巴细胞体外培养方法。

该方法不使用血清，而是使用一种特殊的培养基和生长因子来进行培养。

这种方法的优点是细胞生长快，细胞存活率高，细胞功能稳定，但缺点是培养基和生长因子成本较高。

4. 生物反应器培养法
生物反应器培养法是一种高效的T淋巴细胞体外培养方法。

该方法利用生物反应器的特殊结构和流体力学特性，使T淋巴细胞在培养过程中得到更好的氧气和营养供应。

这种方法的优点是细胞生长快，细胞存活率高，细胞功能稳定，但缺点是设备成本较高。

总之，T淋巴细胞的体外培养方法有多种，每种方法都有其优缺点。

在选择合适的培养方法时，需要考虑到实验的具体要求和实验室的设备和经费条件。

体外活化Th17细胞最适条件的研究

ＩＬ — ｌ７的表达判断Ｔｈｌ７细胞的活化效果，比较不同浓度（２５、７、１５０、２５０ｎｇ／ｍ１）的佛波酯
（ＰＭＡ），联合离子霉素和莫能霉素刺激培养外周血单个核细胞（ＰＢＭＣ）４～６ｈＴｈｌ７细胞的活
化效果；另比较最佳浓度的ＰＭＡ与离子霉素、莫能霉素组合和ＬｅｕｋｏｃｙｔｅＡｃｔｉｖａｔｉｏｎＣｏｃｋｔａｉｌ试剂
刺激培养人ＰＢＭＣ４ｈ，Ｉ ’ Ｉｌ１７细胞的活化效果。结果：在２５ｎｇ／ｍｌＰＭＡ加入离子霉素处理３ｈ后再加莫能霉素刺激淋巴细胞３ｈ后，ＣＩＭＴ细胞中ＣＤ６９阳性细胞含量＞９０％，Ｔｈ１７细胞比例最高
ｏｄｓ：Ｐｅｉｒｐｈｅｒａｌｂｌｏｏｄｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒｃｅｌｌｓ（ＰＢＭＣ）ｗｅｒｅｓｔｉｍｕｌａｔｅｄｂｙＰＭＡａｔｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ（２５，７５，
［Ａｂｓｔｒａｃｔ］Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：ＴｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｍｏｓｔａｐｐｒｏｐｉｒａｔｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｆｏｒａｃｔｉｖａｔｉｎｇＴｈｌ７ｃｅｌｌｓｉｎｖｉｔｒｏ．Ｍｅｔｈ－