干细胞的体外培养

四、胚胎干细胞的体外培养
（一）技术原理
基本原则：促进ES增殖的同时，维持其未分化的二倍体 状态。 有饲养层（feeder layer）培养法：以小鼠成纤维细胞 耐硫代鸟嘌呤和耐乌苯苷亚系（STO）或小鼠胚胎成纤 维细胞（ Mouse Embryo Firbroblasts, MEF）制备饲 养细胞单层，主要是利用其分泌的生长因子FGF和抑制 干细胞分化因子白血病抑制因子（LIF）共同作用，保 持干细胞在体外克隆而不分化。 无饲养层培养法：利用各种能分泌抑制分化因子的细胞 制备条件培养基或在基础培养基中加入重组的LIF制备 条件培养基。
3、用于培养胚胎干细胞的条件培养基
直接在胚胎干细胞培养液中加入重组的LIF，使 终浓度为1000U/ml。 Baffalo大鼠肝细胞株BRL条件培养基（BRLCM):能分泌抑制畸胎癌（瘤）和胚胎干细胞分 化的因子DIF。收集培养72h的培养液，过滤除 菌，用前6-7份+3-4份胚胎干细胞培养液，再 添加8-10%胎牛血清。 年龄 2-3周大鼠心肌细胞条件培养基（RHCM）：分泌抑制胚胎干细胞分化因子。收集16代细胞培养液，过滤除菌，用前6份+3份胚胎 干细胞培养液+1份胎牛血清。
干细胞的体外培养
一、干细胞的概念


干细胞 (stem cells, SC) 是一类具有自 我 复 制 能 力 (self-renewing) 的 多 潜 能 细胞，在一定条件下，它可以分化成多 种功能细胞。 干细胞是一种未充分分化，尚不成熟的 细胞，具有再生各种组织器官和人体的 潜在功能，医学界称之为“万用细胞”。
干细胞
分化细胞
干细胞
分 化 细 胞
对称分裂 （symmetry division）
不对称分裂 （asymmetry division）
4
干细胞几个主要特征
干细胞本身不是终末分化细胞；具有多向分化的能力 （多能性或全能性），即可以分化发育成各种胚层组 织的细胞（ES细胞），或可以分化成为本系统各谱系 的细胞（特定组织干细胞，如造血干细胞）。
它可以无限增殖并分化成为全身200多种细胞类型，
进一步形成机体的所有组织、器官。为全能干细胞。
成体干细胞
是成体组织内具有自我更新及分化一种或一种 以上子细胞的未成熟细胞。 来源于成年组织或器官，一般具有组织特异性， 只能分化成特定的细胞或组织。为多能干细胞 或单能干细胞，如造血干细胞和上皮干细胞等。
干细胞几个主要特征
干细胞的自我更新与分化需要特定的微环境，也就是说 干细胞往哪一种方向分化，必须在该细胞生存的特定微 环境前提下进行分化。已有诸多的实验表明，如将ES细 胞种植入小鼠大脑内，这些干细胞将向神经系统分化。
在不同生长因子刺 激下干细胞可表现 出不同分化潜能
干细胞几个主要特征
干细胞分裂产生的子细胞只能有两种命运——保持 为干细胞或分化为特定细胞。
2、根据来源来分:
来源于胚胎--- 胚胎干细胞 ESC
（Embryonic Stem Cell ）
胚胎性生殖细胞 EGC
（Embryonic Germ Cell ）
来源于成体组织--- 成体干细胞 ASC （Adult-derived Stem Cell ）
胚胎干细胞
指从着床前的胚胎内细胞团（桑椹胚）或原始 生殖细胞获得的一种具有多潜能性、可发育成 为各种细胞、同时可保持不分化状态而持续生 长的克隆细胞系。
人胚胎干细胞来源
a.自终止妊娠（5-9周人工流产）的胎儿中提取生 殖母细胞( primordial germ cell )。
Gearhart法
28
b.取自体外受精胚胎囊胚期内层细胞。用这种 方法，每个胚胎可取得15－20个细胞用于培 养。
Thomson 法
29
c.通过体细胞核转移技术（SCNT技术）获取
干细胞几个主要特征
具有自我更新能力与自我维持能力，可以无限增 殖分裂。干细胞一旦形成，在机体内终生都具有 自我更新能力，以维持自身数目的恒定。 既具有生理性的更新能力，也具有对损伤或疾病 导致的反应有修复能力，如骨髓间充质干细胞等。
干细胞维持自稳性的机制：对称分裂和不对称分裂
干细胞的对称分裂和不对称分裂
至今已分离得到的胚胎干细胞物种有：



小鼠的胚胎干细胞（1981） 金黄地鼠（1988）、貂（1993）、猪 （1994，1997）、鸡（1996）、恒河猴 （1995）、绒猴（1996）。 分离得到人的胚胎干细胞（1998），胚胎生 殖细胞（1998）， 目前不断报道成年组织来源的的干细胞。
胚胎采集：取孕3.5d（囊胚期或桑椹期）的母小鼠取胚胎 胚胎培养：培养皿内制备直径0.5cm左右露滴状培养液液 滴，并覆盖透明石蜡油，胚胎置于液滴中培养 胚胎干细胞分离：普通分离法、免疫外科法，弃除滋胚层 细胞，获得内细胞团（inner cell mass，ICM），并 分散为3-4个细胞在一起的细胞团
血清缺点： 成分复杂，不利于整合到胚胎干细胞基因组中外 源性基因功能的测定； 可能含有一些未知的促进胚胎干细胞分化的因子； 含有微量的血红蛋白和内毒素，干扰胚胎干细胞 生长。 无血清胚胎干细胞培养液无上述缺点，但细胞贴 附力不如有血清培养基。
（2）胚胎干细胞的分离
小鼠：
母小鼠超数排卵交配（注射孕马血清促性腺激素和人绒毛 膜促性腺激素）
二、干细胞的分类
1、按分化潜能大小来分类:
全能干细胞（ Totipotent stem cell ）：能分化成所有组织
和器官的干细胞，它具有形成完整个体的分化潜能。如受精 卵，胚胎干细胞。 多能干细胞（ pluripotent stem cell ），具有分化出多种组 织细胞的潜能，但却失去了发育成完整个体的能力，发育 潜能受到一定的限制。如骨髓多能造血干细胞是典型的例 子，它可分化出至少十二种血细胞 。 专能干细胞（ unipotent stem cell ），这类干细胞只能向 一种类型或密切相关的两种类型的细胞分化，如上皮组织 基底层干细胞、肌肉中的成肌细胞等。
培养至细胞连成一片没有间隙（中间可补加处理过的细胞）， 制备好的饲养单层置培养箱，5天内使用，使用前换成干细 胞培养液。
观察：


好的饲养单层，细胞连成一片，无间隙，死亡 细胞和杂细胞极少。 MEF和STO产生的抑制分化因子一部分分泌到 培养液中，一部分锚定在细胞外基质上。无间 隙的饲养单层保证了胚胎干细胞都能与饲养层 细胞接触而达到最佳效果。
MEF和STO的优缺点：
MEF分泌促进胚胎干细胞增殖和抑制分化因子的能力比 STO强，STO作饲养细胞时常需在培养基中加入LIF。 MEF不能长期传代，需经常准备怀孕小鼠制备第三代至 第五代细胞，STO则可长期传代培养。 MEF不具耐药性，不能作为转染外源性基因的胚胎干细 胞筛选用。 SNL细胞为转染了neor抗性基因和LIF基因的STO细胞， 可分泌足够的抑制分化因子，并因带有neor抗性基因可 用于转基因胚胎干细胞筛选。 胚胎干细胞培养过程中，死亡MEF或STO的染色体可能 导致胚胎干细胞的突变及影响正常核型的保持。 不易获得纯的胚胎干细胞作为生化和分子生物学方面的分 析。 使用前如用丝裂霉素C处理，如清洗不彻底，残余的丝裂 霉素C会影响胚胎干细胞的增殖。
30
其它干细胞的分离与纯化


干细胞表面有许多特殊的标记，以造血系统 为例，干细胞的表面标志有Sca-1和c-kit等。 另外各种成体干细胞还有各自独特的标记物， 如人造血干细胞表现为CD34+和Thy10+而CD10， CD14，CD15，CD16，CD19，CD20皆为阴性 另外干细胞还有不同于一般分化细胞的物理 特性，比如干细胞不被染料Hoechst33324和 Rhodamine123染色。利用这些特性及表面标 志，采用荧光细胞分离器从单细胞悬液中即 可分离纯化干细胞。



1981年，从小鼠胚泡内细胞团分离出小鼠ES细胞， 并建立了小鼠ES细胞体外培养条件。将ES细胞注入小 鼠，能诱导形成畸胎瘤。 1984-1988年，Anderews 等人从人睾丸畸胎瘤细 胞系Tera-2中产生出多能的、可鉴定的（克隆化的） 细胞，称之为胚胎癌细胞（embryonic carcinoma cells, EC细胞）。克隆的人EC细胞在视黄酸的作用下 分化形成神经元样细胞和其他类型的细胞。 1989年，Pera 等分离了一个人EC细胞系，此细胞系 能产生出三个胚层的组织。这些细胞是非整倍体的 （比正常细胞染色体多或少），他们在体外的分化潜 能是有限的。
报道的人源性滋养层细胞：



人骨髓来源的间充质干细胞 胎儿肌肉或胎儿皮肤细胞 新生儿包皮成纤维细胞 成人子宫内膜细胞 人胎盘成纤维细胞 人胚胎干细胞经体内分化获取的间充质 干细胞
2、饲养单层制备
MEF 或 STO 连成一片，以含 百度文库0μg/ml 丝裂霉素培养液 370C 作 用 2-3 h（如细胞层较薄，也可缩短至 30min-1.5h），或 γ 射线照射（剂量为30-100Gy）。 弃含丝裂霉素培养液，PBS洗5次， γ 射线处理者不用清洗。 消化细胞，制备悬液种植至用 0.1% 明胶处理过（ 0.1% 明胶水 溶液覆盖培养瓶表面，室温 2h以上）的培养瓶，种植细胞 数：MEF7.5×104-105个/cm2，STO为5×104个/cm2。




1998年美国有两个小组分别培养出了人的多能干细胞： James A. Thomson在 Wisconsin大学领导的研究小组的 方法是：人卵体外受精后，将胚胎培育到囊胚阶段，提取 inner cell mass细胞，建立细胞株。 John D. Gearhart 在 Johns Hopkins大学领导的另一个研究小组的方法是： 从受精后5－9周人工流产的胚胎中提取生殖母细胞 ( primordial germ cell )，建立细胞株。 1999年12月，美国科学家在《美国科学院院刊》报告说， 小鼠肌肉组织的成体干细胞可以“横向分化”为血液细胞。 随后，世界各国的科学家相继证实，成体干细胞，包括人 类的成体干细胞具有可塑性。 1999年12月，干细胞研究进展被《科学》杂志评选为该 年度世界十大科学进展之首。 2007年日本的Yamanaka研究小组和美国的James Thomson 研究小组分别获得诱导多能性干细胞 （induced pluripotent stem cell，iPS细胞）。
3、根据干细胞组织发生的名称进行分类:
胎胎干细胞 造血干细胞 骨髓间质干细胞 肌肉干细胞 成骨干细胞 内胚层干细胞 视网膜干细胞 胰腺干细胞
三、干细胞研究的历史情况





1959年，美国首次报道了通过体外受精（IVF）动物。 60年代，几个近亲种系的小鼠睾丸畸胎瘤的研究表明其 来源于胚胎生殖细胞（embryonic germ cells, EG细 胞）,此工作确立了胚胎癌细胞（embryonic carcinoma cells, EC细胞）是一种干细胞。 1968年，Edwards 和Bavister 在体外获得了第一个人 卵子。 70年代，EC细胞注入小鼠胚泡产生杂合小鼠。培养的EC 细胞作为胚胎发育的模型，虽然其染色体的数目属于异常。 1978年，第一个试管婴儿在英国诞生。
（二）基本过程
胚胎的制备和培养 饲养层细胞制备或 条件培养基制备 胚胎干细胞的分离
胚胎干细胞的培养 胚胎干细胞的鉴定
冻存与复苏
细胞克 隆形态
碱性磷酸 酶检测
核型的 鉴定
分化能力 的观察
嵌合能力 的测定
1、饲养层细胞培养


小鼠胚胎成纤维细胞（ MEF）：取孕12.514.5 d鼠胚胎躯干，以植块培养法或分散细胞 培养法制备，取第三代至第五代细胞作为饲养 层细胞。 STO细胞：按照一般已建细胞系培养方法。 DMEM加10%小牛血清作为培养液。 采用胎数多小鼠一次大量培养MEF冻存，用时 复苏。
4、胚胎干细胞的分离和培养
（1）培养液
配制培养液要用超纯水或五蒸水，不能有细菌内毒素 污染，水要现用现制。
高糖DMEM作为基础培养基，葡萄糖浓度为 （4.5g/L）：有助于囊胚贴壁、内细胞团增殖及胚胎 干细胞集落形成。
使用前还要添加β-巯基乙醇（0.1mmol/L）或单硫甘 油（ 0.15mmol/L）：保护细胞内酶和蛋白质中的巯 基不被氧化，促进胚胎干细胞的贴壁和克隆形成。 使用前要添加15%胎牛血清：必不可少，但也有缺点。