第十四章基因重组和基因工程
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第七版生物化学_第14章基因工程
5´ 3´
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5´
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DNA
连接酶 3´
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拼 接
片 段
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重
重
组
组
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5´3´
体
体
3´ 5´
3´ 内切酶
5´
(ruvC)
3´ 5´
5´ 3´
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DNA
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连接酶
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3´
53´´
5´
E.coli同源重组分子机制：
需数十种酶参与，其中最关键的是：RecA蛋白、 RecBCD复合物及RuvC蛋白。 RecA蛋白是由rec基因编码的，可结合单链DNA， 形成RecA—ssDNA复合物。 RecA蛋白具有多个DNA 结合位点，因此线性RecA—ssDNA复合物可以通过插 入同源的DNA双螺旋的大沟，形成三链DNA中间物， 并通过旋转逐渐取代双螺旋DNA中的一条链，与互补 链配对，将同源链置换出来，产生新的双链DNA分子， 从而完成DNA重组。
通过自动获取或人为地供给外源DNA，使细 胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型，称为转 化作用 (transformation)。
例如：当细菌破裂溶解（溶菌）时，其裂解 的DNA片断可被另一细菌作为外源DNA摄取，并 重组整合进自己的基因组，随细菌基因一起复制、 转录、翻译，使受体菌获得新的遗传表型。
目录
2.倒位重组及后果： 以hix为特异重组位点，在倒位酶作用下，两个hix 之间的H片段进行特异位点重组(倒位)。其结果是 H2和rH1基因不表达，因为没有了启动子。但远方 的H1基因因没有阻遏蛋白的抑制而得以表达。所以， 倒位重组的后果是表达H1鞭毛蛋白而不表达H2鞭毛 蛋白。因此，沙门氏菌的位相是由于它的两种鞭毛 蛋白质H1和H2的交迭表达。在某一时期，菌体表达 其中的一种，但从不表达两种。
基因重组和基因工程
5´
3´
5´ 3´
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5´ 拼 接
重
组
体
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3´ 内切酶
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(ruvC)
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片 5´ 段 3´ 重 组 体 53´´
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DNA
连接酶
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二、细菌的基因转移与重组
（一）接合作用
当细胞与细胞、或细菌通过菌毛相互接 触时，质粒DNA从一个细胞（细菌）转移 至另一细胞（细菌）的DNA转移称为接合 作用(conjugation)。
（三）转导作用
当病毒从被感染的（供体）细胞释放出 来、再次感染另一（供体）细胞时，发生在 供体细胞与受体细胞之间的DNA转移及基 因重组即为转导作用(transduction)。
例 λ噬菌体的生活史
溶菌生长途径 (lysis pathway)
溶源菌生长途径 (lysogenic pathway)
①两个同源染色体DNA排列整齐
5´
3´
3´
5´
3´
5´
5´
3´
②一个DNA的一条链断裂、并与另一个 DNA对应的链连接，形成Holliday中间体
③通过分支移动产生异源双链DNA
5´
3´
5´
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5´ 内切酶 3´
3´ 5´
5´
3´
(recBCD)
3´ 5´
5´
3´
5´
3´
5´ 分支迁移 3´
3´
5´ (recA) 3´
催化多聚核苷酸5´羟基末端磷酸化，或标记探针
在3´羟基末端进行同质多聚物加尾
切除末端磷酸基
第十四章基因重组与基因工程.pptx
• 溶原菌：整合了噬菌体基因组的细菌。 • 裂解： 噬菌体感染大肠杆菌的第二步
DNA利用菌体的酶系统，复制自身及 外壳蛋白，组装成大量新 噬菌体，并 将细菌涨破。
• 溶原 和裂 解可 以相 互转 变。
整合
转导
• 溶原菌中 DNA可以原样地切离出来， 也可以把邻近的宿主DNA在切离时带走 一部分。后者称转导。
酶有不止一个切口，需经过改造。 • 一个切口：插入型载体。 • 二个切口：置换型载体。
噬菌体载体
目的基因的来源
• 直接从染色体DNA中分离：原核生物 • 人工合成：简单的多肽 • 从NA后建库。
穿梭质粒
酵母
动 植 物 病 毒 、 组织培养细胞 昆虫载体 DNA 直 接 导 入 生 殖 细 胞
DNA重组体的筛选与鉴定
• 根据重组载体的表型进行筛选： 如质粒的抗药性、营养素的依赖型
• DNA限制酶切图谱分析： 提取经粗选后的宿主DNA，用限制性内 切酶切割后与原来载体比较。
• 利用核酸杂交和放射自显影进行鉴定： 用目的基因作探针监测宿主DNA是否重 组体。
分 切 接 转 筛
载体和目的基因
• 载体：vector 在宿主细胞内可独立复制的完整DNA分 子。但必须利用宿主的酶系统，才能有 进一步的基因表达能力。
• 常用的载体有： 质粒、 噬菌体 、 M13 噬菌体 逆转录病毒DNA、昆虫病毒DNA
• 载体与宿主共培育可大量生成，经纯化 后可用于基因工程。
转化
细菌的转化
转化
• 病毒癌基因 感染宿主细 胞后，可整 合到宿主染 色体上，从 而使宿主细 胞癌变。
细胞的转化
转染：噬菌体感染宿主菌后，核酸进入菌体 内的过程。
整合
• 整合： 噬菌体感染大肠杆菌的第一步 噬菌体粘附于细胞壁上，将自身的 DNA注入菌体中。 此 DNA可与细菌染 色体重组，成为细菌染色体的一部分。
DNA利用菌体的酶系统，复制自身及 外壳蛋白，组装成大量新 噬菌体，并 将细菌涨破。
• 溶原 和裂 解可 以相 互转 变。
整合
转导
• 溶原菌中 DNA可以原样地切离出来， 也可以把邻近的宿主DNA在切离时带走 一部分。后者称转导。
酶有不止一个切口，需经过改造。 • 一个切口：插入型载体。 • 二个切口：置换型载体。
噬菌体载体
目的基因的来源
• 直接从染色体DNA中分离：原核生物 • 人工合成：简单的多肽 • 从NA后建库。
穿梭质粒
酵母
动 植 物 病 毒 、 组织培养细胞 昆虫载体 DNA 直 接 导 入 生 殖 细 胞
DNA重组体的筛选与鉴定
• 根据重组载体的表型进行筛选： 如质粒的抗药性、营养素的依赖型
• DNA限制酶切图谱分析： 提取经粗选后的宿主DNA，用限制性内 切酶切割后与原来载体比较。
• 利用核酸杂交和放射自显影进行鉴定： 用目的基因作探针监测宿主DNA是否重 组体。
分 切 接 转 筛
载体和目的基因
• 载体：vector 在宿主细胞内可独立复制的完整DNA分 子。但必须利用宿主的酶系统，才能有 进一步的基因表达能力。
• 常用的载体有： 质粒、 噬菌体 、 M13 噬菌体 逆转录病毒DNA、昆虫病毒DNA
• 载体与宿主共培育可大量生成，经纯化 后可用于基因工程。
转化
细菌的转化
转化
• 病毒癌基因 感染宿主细 胞后，可整 合到宿主染 色体上，从 而使宿主细 胞癌变。
细胞的转化
转染：噬菌体感染宿主菌后，核酸进入菌体 内的过程。
整合
• 整合： 噬菌体感染大肠杆菌的第一步 噬菌体粘附于细胞壁上，将自身的 DNA注入菌体中。 此 DNA可与细菌染 色体重组，成为细菌染色体的一部分。
第十三、十四章 基因重组与基因工程 -
二、切－限制性内切酶（restriction endonuclease）的应用
定义：是一类能识别和切割双链DNA分子
中特定碱基顺序的核酸水解酶。
分类
I 型：复合功能酶－内切、甲基化、
ATP酶和DNA解旋；
III型：内切、甲基化 II 型：识别和切割双链DNA的特异顺序
三、接－外源基因与载体的连接
基因的改造 “显微工程”
三件必备“工具”
第一节 重组DNA技术相关概念及意义
一、有关DNA克隆的相关概念
克隆（clone）:
通过无性繁殖过程
所产生的与亲代完全相同的子代群
体。获取着一群体的过程称为克隆 化（cloning）。
重组DNA技术(recombinant DNA
technology) ： 是按人类的意愿，在体外
第十四章 基因重组与基因工程
Genetic engineering enables scientists to produce clones of cells or organisms that contain the same genes.
自然进化
人 工 育 种
畜力车
基因工程基因工程基因组(genomiclibrary)：将
某种生物细胞的基因组DNA切割成一定 大小的片段后，分别与合适的载体重组 并导入宿主细胞内克隆保存。这种保存 在宿主细胞内的整个library)：将分离
纯化获得某种真核细胞中的全部mRNA， 并将mRNA逆转录成cDNA，如此获得的 cDNA通过重组、克隆方法保存在宿主细 胞中。这种保存在-gal筛选
杂交（核酸分子杂
交、菌落原位杂交）
序列分析
生物化学试题及答案(14
生物化学试题及答案〔14〕第十四章基因重组与基因工程[测试题]一、名词解释：1.基因工程〔geneticengineering〕。
2.接合作用(conjugation)。
3.转化作用(transforation)。
4.转导作用(transduction)。
5.转座(transposition)。
6.转座子(transposons)。
7.同源重组(homologousrecombination)。
8.全然重组(generalrecombination)。
9.DNA克隆〔DNAcloning〕。
10.复制子(replicon)。
11.限制性核酸内切酶(restrictionendonuclease)。
12.回文结构〔palindrome〕。
13.配伍末端〔compatibleend〕。
14.目的DNA〔targetDNA〕。
15.互补DNA(complementaryDNA；cDNA)。
16.克隆载体(cloningvector)。
17.表达载体(expressionvector)。
18.质粒(plasmid)。
19.α—互补(alphacomplementation)。
20.基因组DNA文库(genomicDNAlibrary)。
21.标志补救(markerrescue)。
22.转染〔transfection〕。
23.基因组DNA〔genomicDNA〕。
24.感受态细胞〔competentcell〕。
25.聚合酶链反响(polymerasechainreaction)。
26.cDNA文库(cDNAlibrary)。
27.保守性转座(conservativetransposition)。
28.复制性转座(duplicativetransposition)。
29.溶菌生长途径(lysispathway)。
30.溶源生长途径(lysogenicpathway)。
二、填空题：31.自然界的常见基因转移方式有____、____、____、____。
生物化学第十四章-基因重组和基因工程
第十四章基因重组和基因工程一、自然界的基因转移和重组：基因重组(gene recombination)是指DNA片段在细胞内、细胞间，甚至在不同物种之间进行交换，交换后的片段仍然具有复制和表达的功能。
1．接合作用：当细胞与细胞相互接触时，DNA分子即从一个细胞向另一个细胞转移，这种遗传物质的转移方式称为接合作用（conjugation）。
2．转化和转染：由外来DNA引起生物体遗传性状改变的过程称为转化(transformation)。
噬菌体常常可感染细菌并将其DNA注入细菌体内，也可引起细菌遗传性状的改变。
通过感染方式将外来DNA引入宿主细胞，并导致宿主细胞遗传性状改变的过程称为转染(transfection)。
转染是转化的一种特殊形式。
3．整合和转导:外来DNA侵入宿主细胞，并与宿主细胞DNA进行重组，成为宿主细胞DNA的一部分，这一过程称为整合。
整合在宿主细胞染色体DNA中的外来DNA，可以被切离出来，同时也可带走一部分的宿主DNA，这一过程称为转导(transduction)。
来源于宿主DNA的基因称为转导基因。
4．转座：转座又称为转位（transposition），是指DNA的片段或基因从基因组的一个位置转移到另一个位置的现象。
这些能够在基因组中自由游动的DNA片段包括插入序列和转座子两种类型。
⑴插入序列：典型的插入序列（insertion sequence，IS）是长750-1500bp的DNA片段，由两个分离的反向重复序列和一个转座酶基因。
当转座酶基因表达时，即可引起该序列的转座。
其转座方式主要有保守性转座和复制性转座。
⑵转座子：转座子(transposons)是可从一个染色体位点转移到另一个位点的分散的重复序列，含两个反向重复序列、一个转座酶基因和其他基因（如抗生素抗性基因）。
免疫球蛋白重链基因由一组可变区基因（VH）和一组恒定区基因（CH）构成，通过这些基因的选择性转座和重组，就可以转录表达出各种各样的免疫球蛋白重链，以对付不同的抗原。
基因重组与基因工程PPT课件
（三）DNA序列的复制
（一）DNA克隆技术
2、PCR技术
10.3 基因工程
（一）基因工程的基本原理和方法
基因工程的实现主要分为三个步骤： 第一步：目的基因的分离或制备：人工分离生物基因组群中目的基因及内切酶定位切割或人工酶促合成 第二步：重组DNA：选择载体及目的基因与载体基因重组 第三步：导入与表达：重组DNA导入受体细胞，目的基因表达出目的效应和性状 实现以上三步需要进行以下工作： 1) 寻找目标基因 2) 取得目标基因 3) 基因的载体问题：现主要有质粒载体、病毒载体、脂质载体、原生质载体
DNA的变性与复性
3、基因图谱和DNA序列分析
（1）限制性作图与RFLP
限制酶A、B
限制酶A
限制酶B
2kb
3kb
5kb
2kb
8kb
3kb
7kbLeabharlann AB2kb
5kb
3kb
基因图（DNA测序仪显示的碱基排列顺序)
（2）DNA序列分析
已完成测序工作的生物
面包酵母
蛔虫
果蝇
芥菜
1988年，美国国家卫生院和能源部 迄今为止在生命科学领域最宏大的研究计划—人类基因组计划 主要内容是完成人体23对染色体的全部基因的遗传作图和物理作图，完成23对染色体上30亿个碱基的序列测定 以美国为主、包括英国、法国、日本和中国多国科学家参加的国际合作计划
基因重组与基因工程
10.1自然界生物的基因重组
（一）同源重组 （二）非同源重组 转座子与跳跃基因
10.2 DNA重组技术
（一）DNA分子的加工与工具酶 限制性内切酶与连接酶
分子剪刀和分子针线
（二）、DNA片断的分离和检测
中国医科大学-生物化学-14 基因重组与基因工程
Holliday模型中，同源重组主要4个关键步骤
①两个同源染色体DNA排列整齐 ②一个DNA的一条链断裂、并与另一个DNA
对应的链连接，形成Holliday中间体 ③通过分支移动产生异源双链DNA ④Holliday中间体切开并修复，形成两个双链
重组体DNA，分别为： 片段重组体(patch recombinant)
5´ 3´
5´
3´ DNA 5´
3´
3´
5´ 连接酶 3´
5´
3´
5´
3´
5´
5´
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5´
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Holiday中间体
5´ 3´ 3´ 5´
3´ 5´
3´ 5´ 5´ 3´
3´ 5´
3´
3´
5´
5´
内切酶 (ruvC)
5´ 3´
5´ 3´
Hale Waihona Puke 3´5´5´ 3´
5´ 3´ 5´ 3´
5´ 3´
3´ 5´
DNA连接酶
Ⅰ类酶由三种不同的亚基组成，需要Mg2+、 S-腺苷酸甲硫氨酸(SAM)和ATP为辅助因子。这 类酶识别部位复杂，特异性差，通常在识别部位 周围400～7000bp范围内切割DNA。
Ⅲ类酶由二种亚基组成，需要Mg2+、ATP为辅 助因子，DNA切割发生在识别部位周围25～27bp 范围内。
Ⅱ类酶由一种亚基构成，切割DNA仅需要 Mg2+作为辅助因子，DNA切割就发生在特异识 别部位范围内。Ⅱ类酶切割DNA的特异性强， 被分子生物学家广泛研究，通常所指的限制性内 切酶，即指此类酶而言。
例 （一）λ噬菌体DNA的整合
λ噬菌体的整合酶识别噬菌体DNA和宿主 染色体的特异靶位点发生选择性整合；反转 录病毒整合酶可特异地识别、整合反转录病 毒 cDNA 的 长 末 端 重 复 序 列 (long terminal repeat, LTR)。
第十四章基因重组与基因工程2
的筛选和鉴定； • 有克隆位点（外源DNA插入点），常具
有多个单一酶切位点，称为多克隆位点； • 分子量小，以容纳较大的外源DNA。
第十四章基因重组与基因工程2
（三）外源基因与载体的连接
第十四章基因重组与基因工程2
1、粘性末端连接： • 同一限制酶切割位点连接 • 配伍末端连接
第十四章基因重组与基因工程2
第十四章基因重组与基因工程2
（五）重组体的筛选
1、直接选择： 抗药性标记选择
插入失活法 标志补救 分子杂交法：
原位杂交、Southern印迹
第十四章基因重组与基因工程2
第十四章基因重组与基因工程2
原 位 杂 交
第十四章基因重组与基因工程2
2、非直接选择法： 免疫学方法：如免疫化学方法 酶免检测法
指一套完整单倍体DNA（染色体DNA） 和线粒体DNA的全部序列。
第十四章基因重组与基因工程2
（四）基因载体（克隆载体）：为携带目 的基因，实现其无性繁殖或表达有意义 的蛋白质所采用的一些DNA分子。
常用载体：质粒DNA、噬菌体DNA、病 毒DNA
第十四章基因重组与基因工程2
克隆载体(cloning vector)：为使插入的外 源DNA序列被扩增而特意设计的载体。 表达载体(expression vector)：为使插入的 外源DNA序列可转录翻译成多肽链而特意 设计的载体。
组织或培养细胞 mRNA
载体
cDNA
cDNA与载体连接基因工程2
（二）克隆载体的选择 常用载体：质粒DNA、噬菌体DNA、病 毒DNA
第十四章基因重组与基因工程2
载体的选择标准： • 能自主复制； • 具有两个以上的遗传标记物，便于重组体
（三）转导作用(transduction)：当病毒从被 感染的（供体）细胞释放出来、再次感染 另一（受体）细胞时，发生在供体细胞与 受体细胞之间的DNA转移及基因重组即为 转导作用。
有多个单一酶切位点，称为多克隆位点； • 分子量小，以容纳较大的外源DNA。
第十四章基因重组与基因工程2
（三）外源基因与载体的连接
第十四章基因重组与基因工程2
1、粘性末端连接： • 同一限制酶切割位点连接 • 配伍末端连接
第十四章基因重组与基因工程2
第十四章基因重组与基因工程2
（五）重组体的筛选
1、直接选择： 抗药性标记选择
插入失活法 标志补救 分子杂交法：
原位杂交、Southern印迹
第十四章基因重组与基因工程2
第十四章基因重组与基因工程2
原 位 杂 交
第十四章基因重组与基因工程2
2、非直接选择法： 免疫学方法：如免疫化学方法 酶免检测法
指一套完整单倍体DNA（染色体DNA） 和线粒体DNA的全部序列。
第十四章基因重组与基因工程2
（四）基因载体（克隆载体）：为携带目 的基因，实现其无性繁殖或表达有意义 的蛋白质所采用的一些DNA分子。
常用载体：质粒DNA、噬菌体DNA、病 毒DNA
第十四章基因重组与基因工程2
克隆载体(cloning vector)：为使插入的外 源DNA序列被扩增而特意设计的载体。 表达载体(expression vector)：为使插入的 外源DNA序列可转录翻译成多肽链而特意 设计的载体。
组织或培养细胞 mRNA
载体
cDNA
cDNA与载体连接基因工程2
（二）克隆载体的选择 常用载体：质粒DNA、噬菌体DNA、病 毒DNA
第十四章基因重组与基因工程2
载体的选择标准： • 能自主复制； • 具有两个以上的遗传标记物，便于重组体
（三）转导作用(transduction)：当病毒从被 感染的（供体）细胞释放出来、再次感染 另一（受体）细胞时，发生在供体细胞与 受体细胞之间的DNA转移及基因重组即为 转导作用。
-第十四章 基因重组与基因工程
•
人生不是自发的自我发展，而是一长 串机缘 。事件 和决定 ，这些 机缘、 事件和 决定在 它们实 现的当 时是取 决于我 们的意 志的。2 020年1 1月4日 星期三 1时20 分14秒 Wednes day , November 04, 2020
•
感情上的亲密，发展友谊；钱财上的 亲密， 破坏友 谊。20. 11.4202 0年11 月4日星 期三1 时20分1 4秒20. 11.4
➢ 整合后的外来DNA仍然可随染色体 DNA一起复制，并在适当的条件下进 行表达，但也可在相当长的一段时间内 不表达。
三、整合和转导
整合在宿主细胞染色体DNA中的外来 DNA，可以被切离出来，同时也可带走 一部分的宿主DNA，这一过程称为转导 (transduction)。 来源于宿主DNA的基因称为转导基因。 噬菌体感染宿主细胞后出现的溶菌途径 和溶源菌途径就是典型的整合和转导的 例子。
第十四章 基因重组与基因工程
Chapter 14 gene recombination and genetic engineering
基因重组与基因工程
基因重组(gene recombination)是指DNA片段在 细胞内、细胞间，甚至在不同物种之间进行交 换，交换后的片段仍然具有复制和表达的功能。 基因工程(genetic engineering）是指采用人工 方法将不同来源的DNA进行重组，并将重组后 的DNA引入宿主细胞中进行增殖或表达的过程。
第一节 自然界的基因转移和重组
一、接合作用 当细胞与细胞相互接触时，DNA分 子即从一个细胞向另一个细胞转移， 这种遗传物质的转移方式称为接合 作用（conjugation）。
一、接合作用
接合作用的典型的例子是细菌所含的一 种质粒DNA--F因子，该因子含细菌性 鞭毛蛋白编码基因，当F+细菌与F-细菌 接触时，性鞭毛连接就会在两细胞间形 成，F因子被酶切成单链并通过性鞭毛 连接桥向F-细胞转移，从而使F-细菌转 变为F+细菌。
分子生物学原理--基因工程ppt课件
分子生物学原理
整合
• 整合： 噬菌体感染大肠杆菌的第一步
噬菌体粘附于细胞壁上，将自身的 DNA注入菌体中。 此 DNA可与细菌染色 体重组，成为细菌染色体的一部分。
• 溶原菌：整合了噬菌体基因组的细菌。
• 裂解： 噬菌体感染大肠杆菌的第二步
DNA利用菌体的酶系统，复制自身及 外壳蛋白，组装成大量新 噬菌体，并将 细菌涨破。
第十四章 基因重组与基因工程
10/28/2024
分子生物学原理
基因重组：genomic recombination 重组DNA：recombinant DNA
10/28/2024
分子生物学原理
第一节、自然界的基因重组
• 转化：transformation • 整合：integration • 转导：transduction • 转位：transposition
10/28/2024
分子生物学原理
转位
• 转位：一个或一组基因从一处转到基因 组的另一个位置。
• 这些游动的基因称为转位子(transposon)。
10/28/2024
分子生物学原理
转 位
10/28/2024
分子生物学原理
第二节、基因工程
• 基因工程：是用分离纯化或人工合成的 DNA在体外与载体DNA结合，成为重组 DNA，用以转化宿主，筛选出能表达重 组DNA的活细胞，加以纯化、传代、扩 增，成为克隆。也叫基因克隆或重组 DNA技术。
切割后与原来载体比较。
• 利用核酸杂交和放射自显影进行鉴定：用目 的基因作探针监测宿主DNA是否重组体。
10/28/2024
分子生物学原理
DNA重组体的筛选与鉴定
•灭 活法筛 选重组 体。
生物化学与分子生物学试题及参考答案(六)
生物化学试题及答案（14）第十四章基因重组与基因工程[测试题]一、名词解释：1. 基因工程（genetic engineering）。
2. 接合作用(conjugation )。
3. 转化作用(transforation )。
4. 转导作用(transduction )。
5. 转座(transposition )。
6. 转座子(transposons )。
7. 同源重组(homologous recombination )。
8. 基本重组(general recombination )。
9. DNA克隆（DNA cloning ）。
10. 复制子( replicon )。
11. 限制性核酸内切酶(restriction endonuclease )。
12. 回文结构（palindrome ）。
13. 配伍末端（compatible end ）。
14. 目的DNA （target DNA）。
15. 互补DNA (complementary DNA；cDNA )。
16. 克隆载体(cloning vector )。
17. 表达载体(expression vector )。
18. 质粒(plasmid )。
19. α—互补(alpha complementation )。
20. 基因组DNA文库( genomic DNA library )。
21. 标志补救(marker rescue )。
22. 转染（transfection ）。
23. 基因组DNA （genomic DNA）。
24. 感受态细胞（competent cell ）。
25. 聚合酶链反应(polymerase chain reaction )。
26. cDNA文库(cDNA library )。
27. 保守性转座(conservative transposition )。
28. 复制性转座(duplicative transposition )。
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DNA聚合酶Ⅰ
Klenow片段 反转录酶
多聚核苷酸激酶
① 合成双链cDNA分子或片段连接 ② 缺口平移制作高比活探针 ③ DNA序列分析 ④ 填补3´末端
又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的53 聚合、35外切活性，而无53外切活性。常用于 cDNA第二链合成，双链DNA 3末端标记等
目录
λ噬菌体的生活史 溶菌生长途径 (lysis pathway) 溶源菌生长途径 (lysogenic pathway)
目录
三、位点特异重组，即特异位点间 发生的整合
➢ 位点特异重组(site-specific recombination) 是由整合酶催化，在两个DNA序列的特异 位点间发生的整合。
内切酶
(recBCD)
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DNA 连接酶
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Holiday中间体
目录
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5´ 内切酶 3´
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(recBCD)
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5´ (recA) 3´
5´
3´
5´
内切酶
(recBCD)
生物化学考试前答疑 时间：本周四、周五进行。 地点：生化楼 具体安排请到生化楼看通知。
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第21章
DNA重组和重组DNA 技术
DNA Recombination and Recombinant DNA Technology
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第一节
自然界DNA重组和基因转移 是经常发生的
DNA Recombination and Gene Transfer Occur Frequently in Nature
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由转座子介导的转座
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第二节
重组DNA技术 又称DNA克隆或分子克隆
DNA Recombination Technique is also Called DNA Cloning or Molecular Clone
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一、重组DNA技术相关概念
（一） DNA克隆
➢ 克隆(clone):源于希腊文klone，原意是指以 无性繁殖或营养繁殖的方式培育植物。
➢ 目的： ① 分离获得某一感兴趣的基因或DNA ② 获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）
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➢DNA克隆的基本要素 ➢ 工具酶 ➢ 目的DNA片段 ➢ 载体DNA ➢ 宿主细胞
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重组DNA技术中常用的工具酶
工具酶
功
能
限制性核酸内切酶 识别特异序列，切割DNA
DNA连接酶
催化DNA中相邻的5´磷酸基和3´羟基末端之间形成磷酸 二酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接
5´
3´
3´
5´
5´
3´
二、细菌的基因转移与重组有四种方式
（一）接合作用
当细胞与细胞、或细菌通过菌毛相互 接触时，质粒DNA从一个细胞（细菌）转 移至另一细胞（细菌）的DNA转移称为接 合作用(conjugation)。
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➢ 质粒 细菌染色体外的小型环状双链DNA分子。
➢ 可接合质粒如 F 因子(F factor)
GGATCC CCTAGG
G CCTAG
+GATCGC
BstⅠ
GGATCC CCTAGG
GCCTAG+
GATCC G
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➢ 同尾酶
有些限制性内切酶虽然识别序列不完全 相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端， 称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配 伍未端(compatible end)。
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（一）λ噬菌体DNA的整合
λ噬菌体的整合酶识别噬菌体和宿主染 色体的特异靶位点发生选择性整合；
细菌附着位点(attB)和噬菌体附着位点 (attP) 都含有相同的核心序列，称为O区， 该区由15bp组成：
5’GCTTTTTTATACTAA3’ 3’CGAAAAAATATGATT5’
目录
目录
反转录病毒整合酶可特异地识别、整合反转 录病毒cDNA的长末端重复序列(long terminal repeat, LTR)。
➢ 通过分支移动产生异源双链DNA；
5´
3´
5´
3´
3´
5´ 分支迁移 3´
5´
3´
5´ (recA) 3´
5´
5´
3´
5´
3´
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➢ Holliday中间体切开并修复，形成两个双链 重组体DNA，分别为： 片段重组体(patch recombinant)
拼接重组体(splice recombinant)
• 二个分离的反向重复(inverted repeats, IR)序列 • 特有的正向重复序列 • 一个转座酶（transposase)编码基因
IR Transposase Gene IR
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➢插入序列发生转座的形式： 保守性转座(conservative transposition) 复制性转座(duplicative transposition)
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Ⅱ型限制酶只具有认知切割的作用。所认 知的位置多为短的回文序列；所剪切的碱 基序列通常即为所认知的序列。
Ⅲ型限制酶与第一型限制酶类似，同时具有修 饰及认知切割的作用。可认知短的不对称序列， 切割位与认知序列约距24-26个碱基对。
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➢ 生理意义： 与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰
系统，限制外源DNA，保护自身DNA。
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（二）细菌的特异位点重组
沙门菌H片段倒位决定鞭毛相转变。
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➢ hix为反向重复序列，它们之间的H片段 可在Hin控制下进行特异位点重组(倒位)。 H片段上有两个启动子P，其一驱动hin基 因 表 达 ， 另 一 正 向 时 驱 动 H2 和 rH1 基 因 表 达 ， 反 向 ( 倒 位 ) 时 H2 和 rH1 不 表 达 。 rH1为H1的阻遏蛋白基因。
① 合成cDNA ② 替代DNA聚合酶I进行填补，标记或DNA序列分析
催化多聚核苷酸5´羟基末端磷酸化，或标记探针
末端转移酶
在3´羟基末端进行同质多聚物加尾
碱性磷酸酶 切除末端磷酸基
限制性核酸内切酶(restriction endonuclease)
➢ 定义： 限制性核酸内切酶(restriction endonuclease,
GGATCC CCTAGG
切口 ：平端切口、粘端切口
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HindⅡ
GTCGAC CAGCTG
Bam HⅠ
GGATCC CCTAGG
GTC CAG
+
GAC CTG
平端切口
GCCTAG+ GATCGC 粘端切口
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➢同功异源酶：
来源不同的限制酶，但能识别和切割 同一位点，这些酶称同功异源酶。
Bam HⅠ
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DNA的特性：保守性，变异性，流动性 DNA重组是指不同的DNA分子断裂并连接，从
而产生DNA片段的交换并构成新的DNA分子的 过程。
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DNA重组 同源重组 (homologous recombination) 接合作用 (conjugation) 转化作用 (transformation) 转导作用 (transduction) 位点特异的重组(site-specific recombination) 转 座 (transposition)
➢ 以E.coli的同源重组为例，了解同源重组机 制的Holliday模型。
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Holliday模型的4个关键步骤： ➢ 两个同源染色体DNA排列整齐； ➢ 一个DNA的一条链断裂；
5´
3´
5´
3´
5´ 内切酶 3´
3´ 5´
5´
3´
(recBCD)
3´ 5´
3´ 5´ 5´
3´ 5´ 3´
目录
目录
沙门菌H片段倒位决定鞭毛相转变
DNA
启动序列
启动序列
hin
H2
I
H1
Hin重组酶
H2鞭毛素 阻遏蛋白
hin
H2
I
转位片段
H1
H1鞭毛素
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（三）免疫球蛋白基因的重排
➢ 免疫球蛋白(Ig)，由两条轻链(L链)和两条重链 (H链)组成，分别由三个独立的基因族编码， 其中两个编码轻链(和)，一个编码重链。
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一、同源重组是最基本的DNA重组方式
➢ 发生在同源序列间的重组称为同源重组 (homologous recombination)，又称基本重 组（general recombination）。是最基本的 DNA重组方式，通过链的断裂和再连接， 在两个DNA分子同源序列间进行单链或双 链片段的交换。
轻链的基因片段：
L
V
J
C
重链的基因片段：
L
V
D
J
C
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CACAGTG(12/23)ACAAAAACC
GTGTCCAC
TGTTTTTGG
基因片段
重组信号序列
➢ 重链(IgH)基因的V-D-J重排和轻链(IgL)基 因的V-J重排均发生在特异位点上。在V片 段的下游，J片段的上游以及D片段的两侧 均存在保守的重组信号序列(recombination signal sequence, RSS)。此重排的重组酶基 因rag (recombination activating gene)共有 两个，分别产生蛋白质RAG1和RAG2。