第十四章基因重组和基因工程

GGATCC CCTAGG
切口 ：平端切口、粘端切口
目录
HindⅡ
GTCGAC CAGCTG
Bam HⅠ
GGATCC CCTAGG
GTC CAG
+
GAC CTG
平端切口
GCCTAG+ GATCGC 粘端切口
目录
➢同功异源酶：
来源不同的限制酶，但能识别和切割 同一位点，这些酶称同功异源酶。
Bam HⅠ
轻链的基因片段：
L
V
J
C
重链的基因片段：
L
V
D
J
C
目录
CACAGTG(12/23)ACAAAAACC
GTGTCCAC
TGTTTTTGG
基因片段
重组信号序列
➢ 重链(IgH)基因的V-D-J重排和轻链(IgL)基 因的V-J重排均发生在特异位点上。在V片 段的下游，J片段的上游以及D片段的两侧 均存在保守的重组信号序列(recombination signal sequence, RSS)。此重排的重组酶基 因rag (recombination activating gene)共有 两个，分别产生蛋白质RAG1和RAG2。
• 二个分离的反向重复(inverted repeats, IR)序列 • 特有的正向重复序列 • 一个转座酶（transposase)编码基因
IR Transposase Gene IR
目录
➢插入序列发生转座的形式： 保守性转座(conservative transposition) 复制性转座(duplicative transposition)
目录
（一）λ噬菌体DNA的整合
λ噬菌体的整合酶识别噬菌体和宿主染 色体的特异靶位点发生选择性整合；
细菌附着位点(attB)和噬菌体附着位点 (attP) 都含有相同的核心序列，称为O区， 该区由15bp组成：
5’GCTTTTTTATACTAA3’ 3’CGAAAAAATATGATT5’
目录
目录
反转录病毒整合酶可特异地识别、整合反转 录病毒cDNA的长末端重复序列(long terminal repeat, LTR)。
目录
λ噬菌体的生活史 溶菌生长途径 (lysis pathway) 溶源菌生长途径 (lysogenic pathway)
目录
三、位点特异重组，即特异位点间 发生的整合
➢ 位点特异重组(site-specific recombination) 是由整合酶催化，在两个DNA序列的特异 位点间发生的整合。
① 合成cDNA ② 替代DNA聚合酶I进行填补，标记或DNA序列分析
催化多聚核苷酸5´羟基末端磷酸化，或标记探针
末端转移酶
在3´羟基末端进行同质多聚物加尾
碱性磷酸酶 切除末端磷酸基
限制性核酸内切酶(restriction endonuclease)
➢ 定义： 限制性核酸内切酶(restriction endonuclease,
➢ 目的： ① 分离获得某一感兴趣的基因或DNA ② 获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）
目录
➢DNA克隆的基本要素 ➢ 工具酶 ➢ 目的DNA片段 ➢ 载体DNA ➢ 宿主细胞
目录
重组DNA技术中常用的工具酶
工具酶
功
能
限制性核酸内切酶 识别特异序列，切割DNA
DNA连接酶
催化DNA中相邻的5´磷酸基和3´羟基末端之间形成磷酸 二酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接
目录
➢ 命名：
Hin dⅢ
Haemophilus influenzae d株 流感嗜血杆菌d株的第三种酶
属系 株 序
第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写； 第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写； 第四个字母代表株； 用罗马数字表示发现的先后次序。
目录
Ⅱ类酶识别序列特点—— 回文结构(palindrome)
GGATCC CCTAGG
G CCTAG
+GATCGC
BstⅠ
GGATCC CCTAGG
GCCTAG+
GATCC G
目录
➢ 同尾酶
有些限制性内切酶虽然识别序列不完全 相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端， 称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配 伍未端(compatible end)。
目录
一、同源重组是最基本的DNA重组方式
➢ 发生在同源序列间的重组称为同源重组 (homologous recombination)，又称基本重 组（general recombination）。是最基本的 DNA重组方式，通过链的断裂和再连接， 在两个DNA分子同源序列间进行单链或双 链片段的交换。
5´
3´
3´
5´
5´
3´
二、细菌的基因转移与重组有四种方式
（一）接合作用
当细胞与细胞、或细菌通过菌毛相互 接触时，质粒DNA从一个细胞（细菌）转 移至另一细胞（细菌）的DNA转移称为接 合作用(conjugation)。
目录
➢ 质粒 细菌染色体外的小型环状双链DNA分子。
➢ 可接合质粒如 F 因子(F factor)
目录
Ⅱ型限制酶只具有认知切割的作用。所认 知的位置多为短的回文序列；所剪切的碱 基序列通常即为所认知的序列。
Ⅲ型限制酶与第一型限制酶类似，同时具有修 饰及认知切割的作用。可认知短的不对称序列， 切割位与认知序列约距24-26个碱基对。
目录
➢ 生理意义： 与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰
系统，限制外源DNA，保护自身DNA。
RE)是识别DNA的特异序列, 并在识别位点或其 周围切割双链DNA的一类DNA内切酶。
Bam HⅠ
GGATCC CCTAGG
GCCTAG+
GATCC G
目录
➢ 分类： Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（基因工程技术中常用Ⅱ型） ➢ 作用： Ⅰ型限制酶同时具有修饰及认知切割的作 用；通常其切割位距离认知位可达数千个 碱基之远。
3´ 5´ 5´
3´ 5´ 3´
DNA侵扰 (recA)
3´
5´
5´ 3´
5´
3´
DNA 5´
3´
3´
5´ 连接酶 3´
5´
3´
5´
3´
5´
3´
3´
5´
3´
Holiday中间体
目录
➢ 片段重组体 ： 重组体含有一段异源双链区，其两侧来自同 一亲本DNA。
➢ 拼接重组体： 切开的链并非原来断裂的链，重组体异源双 链区的两侧来自不同亲本DNA。
➢ 以E.coli的同源重组为例，了解同源重组机 制的Holliday模型。
目录
Holliday模型的4个关键步骤： ➢ 两个同源染色体DNA排列整齐； ➢ 一个DNA的一条链断裂；
5´
3´
5´
3´
5´ 内切酶 3´
3´ 5´
5´
3´
(recBCD)
3´ 5´
3´ 5´ 5´
3´ 5´ 3´
目录
DNA聚合酶Ⅰ
Klenow片段 反转录酶
多聚核苷酸激酶
① 合成双链cDNA分子或片段连接 ② 缺口平移制作高比活探针 ③ DNA序列分析 ④ 填补3´末端
又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的53 聚合、35外切活性，而无53外切活性。常用于 cDNA第二链合成，双链DNA 3末端标记等
目录
➢ 插入序列(IS) 是从细菌的乳糖操纵子中 发现了一段自发的插入序列，阻止了被 插入的基因的转录，所以称为插入序列 (IS)。
➢ 转座是罕见事件，与自发突变率处于同 一数量级，约为每代10-6一10-7。
目录
（一）插入序列转座
➢ 插入序列(insertion sequences, IS)组成：
目录
插入序列的复制性转座
（二）转座子转座
➢ 转座子(transposons) ——可从一个染色体 位点转移到另一位点的分散重复序列。
➢ 转座子组成： 反向重复序列 转座酶编码基因 抗生素抗性等有用的基因
IR
Transposase Gene
有用基因 IR
目录
细菌的可流动性元件 A 插入序列：转座酶编码基因两侧连接反向末端重复序列(箭头所示) B 转座子Tn3：含有转座酶、β-内酰胺酶及阻遏蛋白编码基因 C 转座子Tn10：含四环素抗性基因及两个相同的插入序列IS10L
目录
由转座子介导的转座
目录
பைடு நூலகம்
第二节
重组DNA技术 又称DNA克隆或分子克隆
DNA Recombination Technique is also Called DNA Cloning or Molecular Clone
目录
一、重组DNA技术相关概念
（一） DNA克隆
➢ 克隆(clone):源于希腊文klone，原意是指以 无性繁殖或营养繁殖的方式培育植物。
➢ 通过分支移动产生异源双链DNA；
5´
3´
5´
3´
3´
5´ 分支迁移 3´
5´
3´
5´ (recA) 3´
5´
5´
3´
5´
3´
目录
➢ Holliday中间体切开并修复，形成两个双链 重组体DNA，分别为： 片段重组体(patch recombinant)
拼接重组体(splice recombinant)
目录
（二）转化作用
通过自动获取或人为地供给外 源DNA，使细胞或培养的受体细胞 获得新的遗传表型，称为转化作用 (transformation)。
目录
例：溶菌时，裂解的DNA片段被另一细菌摄取。
目录
（三）转导作用
当病毒从被感染的（供体）细胞释放 出来、再次感染另一（供体）细胞时，发 生在供体细胞与受体细胞之间的DNA转移 及基因重组即为转导作用(transduction)。
目录
DNA的特性：保守性，变异性，流动性 DNA重组是指不同的DNA分子断裂并连接，从
而产生DNA片段的交换并构成新的DNA分子的 过程。
目录
DNA重组 同源重组 (homologous recombination) 接合作用 (conjugation) 转化作用 (transformation) 转导作用 (transduction) 位点特异的重组(site-specific recombination) 转 座 (transposition)
目录
沙门菌H片段倒位决定鞭毛相转变
DNA
启动序列
启动序列
hin
H2
I
H1
Hin重组酶
H2鞭毛素 阻遏蛋白
hin
H2
I
转位片段
H1
H1鞭毛素
目录
（三）免疫球蛋白基因的重排
➢ 免疫球蛋白(Ig)，由两条轻链(L链)和两条重链 (H链)组成，分别由三个独立的基因族编码， 其中两个编码轻链(和)，一个编码重链。
免疫球蛋白基因重排过程
V片段
间插DNA
RSS
单链切开
RSS
RAG1 RAG2
J片段
OH OH
分子内转酯反应
单链切开 转移核苷酸 修复、连接
V
J
四、转座重组
➢ 大多数基因在基因组内的位置是固定的， 但有些基因可以从一个位置移动到另一位 置。这些可移动的DNA序列包括插入序 列和转座子。
➢ 由插入序列和转座子介导的基因移位或重 排称为转座(transposition)。
目录
5´
3´
3´
5´
3´
5´
5´
3´
Holiday中间体
5´ 3´
内切酶 (ruvC)
5´ 3´
5´ 3´ 3´
5´
3´
5´
5´
3´
DNA
连接酶 3´ 5´
5´ 3´
5´
5´3´
3´
拼接重组体 片段重组体
3´ 5´
内切酶
5´3´
(ruvC)
3´5´
3´ 5´
5´
5´ 3´
3´
DNA
连接酶 3´ 5´
生物化学考试前答疑 时间：本周四、周五进行。 地点：生化楼 具体安排请到生化楼看通知。
目录
第21章
DNA重组和重组DNA 技术
DNA Recombination and Recombinant DNA Technology
目录
第一节
自然界DNA重组和基因转移 是经常发生的
DNA Recombination and Gene Transfer Occur Frequently in Nature
目录
（二）细菌的特异位点重组
沙门菌H片段倒位决定鞭毛相转变。
目录
➢ hix为反向重复序列，它们之间的H片段 可在Hin控制下进行特异位点重组(倒位)。 H片段上有两个启动子P，其一驱动hin基 因 表 达 ， 另 一 正 向 时 驱 动 H2 和 rH1 基 因 表 达 ， 反 向 ( 倒 位 ) 时 H2 和 rH1 不 表 达 。 rH1为H1的阻遏蛋白基因。
内切酶
(recBCD)
5´ 3´
3´ 5´
DNA 连接酶
5´ 3´
3´
3´ 5´
5´
3´
5´
5´
3´
3´
3´
Holiday中间体
目录
5´
3´
5´
3´
5´ 内切酶 3´
3´ 5´
5´
3´
(recBCD)
3´ 5´
5´
3´
5´
3´
5´ 分支迁移 3´
3´
5´ (recA) 3´
5´
3´
5´
内切酶
(recBCD)
➢ 技术水平：分子克隆(molecular clone) 细胞克隆 个体克隆（动物或植物）
目录
➢DNA克隆
应用酶学的方法，在体外将目的片段与载 体DNA连接，形成成一具有自我复制能力的重 组DNA分子，继而在宿主细胞进行复制、扩增， 从而获得大量同一DNA分子，也称基因克隆或 重组DNA (recombinant DNA) 。