Cytophaga hutchinsonii β-葡萄糖苷酸及flexirubin色素的功能研究

Cytophaga hutchinsonii β-葡萄糖苷酸及flexirubin色素的

功能研究

随着工业的发展和人口的增加,资源短缺和环境污染成为困扰人类发展的两个重要难题。进入新世纪以来化石资源日益枯竭,开发清洁的的可再生能源已成为人们的迫切需要。

以纤维素为主要成分的生物质资源是地球上含量最丰富的可再生资源,对纤维素资源的开发利用越来越受到人们的重视。但由于纤维素结构致密、不溶于水、本身存在结晶区等原因,纤维素的生物转化效率很低。

因此研究纤维素的生物降解途径,提高生物转化的效率是纤维素资源利用的前提条件。Cytophaga hutchinsonii是拟杆菌门（Bacteroidetes）一种好氧的革兰氏阴性细菌。

C.hutchinsonii 可以快速彻底地降解结晶纤维素,但其既不分泌游离的纤维素酶也没有纤维小体结构,同时纤维素酶系中没有内切纤维素酶存在,纤维素酶也不含有CBM结构。因此C.hutchinsonii的纤维素降解机制不同于已知的好氧微生物游离纤维素酶机制以及厌氧微生物的纤维小体降解机制,可能是一种全新且未知的降解机制。

对这种高效的结晶纤维素降解机制的研究有助于提高人们对纤维素降解机制的认识,并对纤维素生物转化利用提供帮助。之前由于C.hutchinsonii遗传操作体系的不成熟,对其纤维素降解机制研究进展十分缓慢。

近年来C.hutchinsonii遗传操作体系的不断发展为纤维素降解机制的研究奠定了基础。纤维二糖是纤维素的结构的基本组成单位,并且纤维二糖还是纤维素降解的重要中间产物。

因此探究C.hutchinsonii对纤维二糖的降解及利用过程对C.hutchinsonii 纤维素降解机制的研究有重要意义。本文通过基因敲除等手段探究

C.hutchinsonii的四个β-葡葡糖苷酶各自的功能及其在纤维素降解中作用。

同时利用离子色谱手段对纤维寡糖和纤维素降解过程的中间产物进行检测,以期望可以探寻C.hutchinsonii纤维素的降解途径。采用新的吸附蛋白提取方法鉴定出一批C.hutchinsonii的吸附蛋白,研究了纤维素诱导吸附蛋白

CHU₀344的功能。

同时利用转座子插入突变方法筛选到一株色素缺失菌株,研究了

flexirubin色素多烯链合成中关键β-羟酰-ACP脱水酶的作用以及flexirubin

色素的生物学功能。具体内容及结果如下:1.C.hutchinsonii β-葡萄糖苷酶功能及其对纤维素降解的影响,C.hutchinsonii纤维素降解产物检测及其双途经

降解体系。

我们研究了C.hutchinsonii β-葡萄糖苷酶的功能,及其在纤维素降解中

的作用。同时首次研究发现C.hutchinsonii存在细胞表面纤维素降解途径,并证实C.hutchinsonii存在细胞内降解途径,从而提出新的双途径降解模型。

β-葡萄糖苷酶在纤维素降解过程中主要起到降解中间产物纤维二糖的作用。同时有部分β-葡萄糖苷酶具有转糖基作用。

C.hutchinsonii经过基因组分析预测发现有四个β-葡萄糖苷酶基因:bglA （chu₂268）、bglB（chu₂273）、bglC

（chu₃577）和bglD（chu₃784）。所有的四个β-葡萄

糖苷酶都属于糖苷水解酶GH3家族,其中BglA,BglB,BglC被预测为脂蛋白。

通过SignalP4.1预测发现只有BglB含有信号肽,但是BglA,BglC和BglD

蛋白的前30位氨基酸均含有大量的疏水性氨基酸,因此推测在这些蛋白中同样含有信号肽。为研究四个β-葡萄糖苷酶在纤维二糖和纤维素降解中各自起的作用,首先检测野生菌株中在不同培养条件下四个酶在RNA水平和蛋白水平的表达情况。

通过荧光定量PCR和蛋白活性电泳检测,发现在葡萄糖培养条件下只有bglB 基因存在表达。在纤维二糖或纤维素培养条件下BglA和BglB都存在表达,但BglA的表达水平远低于BglB。

BglC的两种条件下表达水平都很低,而BglD现有的实验条件下检测不到表达。因此我们推测BglA和BglB在C.hutchinsoni 纤维二糖和纤维素降解中期关键作用。

随后我们通过同源双交换重组技术对四个β3-葡萄糖苷酶进行基因敲除,得到单敲除菌株△ bglA、△bglB、和△bglD 同时对主要的β-葡萄糖苷酶进行多敲除得到△bglA/hglB和△bglA/bglB/bglC突变株。表型检测发现单敲除菌株中有△bglB在纤维二糖和纤维素培养时存在延迟,其它单敲除菌株不受影响。

但双敲除菌株和三敲除菌株丧失降解纤维二糖和纤维素的能力。酶活检测发现在葡萄糖培养条件下单独敲除bglB后菌体丧失全部β-葡萄糖苷酶酶活,而在纤维素培养条件下敲除bglB后菌体保留20%的酶活,但△ bglA/bglB丧失所有酶活,其它单敲除菌株不会影响菌体的β-葡萄糖苷酶酶活。

同时检测菌体的纤维二糖降解能力,发现△bglB在降解纤维二糖时存在延迟并且降解速率明显降低,△bglA/bglB完全丧失降解纤维二糖的能力。所有结果表明BglB在C.hutchinsoni 纤维二糖和纤维素降解中起关键作用,BglA可以被诱导产生从而部分弥补△bgl中β-葡萄糖苷酶缺失带来的影响。

在纤维素降解方面,所有单敲除菌株均可以降解纤维素,△bglA/bglB无法在液体条件下降解纤维素,但是在固体平板上可以降解滤纸。通过研究发现固体平板中的少量营养物质可以促使△bglA/bglB 降解纤维素,并且在液体条件下外加少量葡萄糖时△bglA/bglB 可以降解纤维素。

但△bglA/bglB 缺失β-葡萄糖苷酶活性,在外加葡萄糖条件下仍不能降解纤维二糖。这些结果表明C.hutchinsonii可以通过不需要β-葡萄糖苷酶参与的途径降解纤维素。

经过定量分析发现当△ bglAbglB在外加少量葡萄糖条件下降解纤维素时,超过55%的纤维素被转化为纤维二糖,其它部分纤维素被菌体转化为葡萄糖供菌体生长。我们基于离子色谱的手段建立了C.hutchinsonii 细胞外和细胞内纤维寡糖的检测方法。

当野生菌体与纤维二糖共同孵育时,短时间内菌体即可将纤维二糖完全转化为葡萄糖并在细胞外大量积累,但在整个过程中细胞体内检测不到纤维二糖和葡萄糖的积累。同时通过酶活测定结果以及Western blot检测发现

C.hutchinsonii中β-葡萄糖苷酶既存在于细胞表面又存在于周质空间。

由此我们推断外源的纤维二糖在细胞表面降解为葡萄糖后再被菌体利用。长期以来,人们在C.hutchinsonii的发酵液中没有检测到明显的还原糖。

我们通过离子色谱的手段成功的在纤维素培养早期检测到明显的葡萄糖积累。另外当野生株菌体与纤维素孵育时,在体外可以检测到大量的葡萄糖以及少量的纤维二糖和纤维三糖积累。

同时细胞表而存在β-葡萄糖苷酶和纤维素内切酶,这表明C.hutchinsonii 存在细胞表面纤维素降解途径。我们首次在C.hutchinsonii降解纤维素过程中,