第八章 病毒感染的分子生物学检验ppt课件
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病毒学- 病毒的检验PPT课件
病毒学- 病毒的检验
常用的病毒检验方法包括：
一、病毒的分离鉴定 二、病毒感染性的检测 三、病毒颗粒检测 四、病毒的血清学检查 五、病毒的分子(蛋白和核酸)检测
一、病毒的分离鉴定
病毒的分离与鉴定可为病毒感染提供最为直 接的病原学证据，同时可为进一步的病毒学 研究提供材料。 病毒的分离和鉴定（含义）：指从病人、带 毒者、外界环境中采集标本经过适当的处理, 采用一系列物理、化学、生物学等手段,将病 毒从标本中分离出来,并通过有关特异性方法 鉴定属于何种病毒,这一方法称为病毒的分离 与鉴定。
（2）鸡胚培养法
鸡胚对多种病毒敏感。 不同病毒在鸡胚的不同部位的生长特性差异 很大,因此选择适当的接种途径是病毒分离成 功的关键。 一般采用孵化9～14天的鸡胚，根据病毒种类 不同，将病毒标本 接种于鸡胚的不同部位， 最常用的鸡胚接种部位有：尿囊腔、绒毛尿 囊膜、卵黄囊和羊膜腔等。
（3）细胞培养 (cell culture)法或 组织培养法 (tissue culture)
病毒的分离与鉴定包括：
1病毒的形态学观察→4、 病毒的理化特性测定→5、病毒的血清
学鉴定及病毒的分子生物学鉴定等基本
过程。
（一）标本的采取与送检
病料采集适当与否,直接影响病毒的检测结果。 一般可采集发病或死亡动物的组织病料、分泌 物或粪便等,主要因动物及病毒的种类而异, 例如检测犬细小病毒或轮状病毒,一般应采腹泻 幼犬或犊牛的粪便;
标本处理：
采集样本在接种细胞、鸡胚或动物之前,都需要做适 当的处理,以保证病毒分离的成功几率。 采集的器官或组织样本：如肺脏、脑、肝、脾、淋巴 结等,可取一小块进行充分研磨,加入含青、链霉素的 Hanks液,离心取上清液作为接种物; 鼻液、脓汁、乳汁等分泌物或渗出液、粪便,应加入 高浓度的抗生素,充分混匀后,置4℃冰箱内处理2~4h 或过夜,离心后取上清做接种用; 咽喉拭子在取样后应迅速将其浸泡入含有2%小牛血 清和一定浓度的青、链霉素的Hanks液中,充分刷洗 棉拭子,反复冻融3~5次,离心后取上清液作为接种材料。
常用的病毒检验方法包括：
一、病毒的分离鉴定 二、病毒感染性的检测 三、病毒颗粒检测 四、病毒的血清学检查 五、病毒的分子(蛋白和核酸)检测
一、病毒的分离鉴定
病毒的分离与鉴定可为病毒感染提供最为直 接的病原学证据，同时可为进一步的病毒学 研究提供材料。 病毒的分离和鉴定（含义）：指从病人、带 毒者、外界环境中采集标本经过适当的处理, 采用一系列物理、化学、生物学等手段,将病 毒从标本中分离出来,并通过有关特异性方法 鉴定属于何种病毒,这一方法称为病毒的分离 与鉴定。
（2）鸡胚培养法
鸡胚对多种病毒敏感。 不同病毒在鸡胚的不同部位的生长特性差异 很大,因此选择适当的接种途径是病毒分离成 功的关键。 一般采用孵化9～14天的鸡胚，根据病毒种类 不同，将病毒标本 接种于鸡胚的不同部位， 最常用的鸡胚接种部位有：尿囊腔、绒毛尿 囊膜、卵黄囊和羊膜腔等。
（3）细胞培养 (cell culture)法或 组织培养法 (tissue culture)
病毒的分离与鉴定包括：
1病毒的形态学观察→4、 病毒的理化特性测定→5、病毒的血清
学鉴定及病毒的分子生物学鉴定等基本
过程。
（一）标本的采取与送检
病料采集适当与否,直接影响病毒的检测结果。 一般可采集发病或死亡动物的组织病料、分泌 物或粪便等,主要因动物及病毒的种类而异, 例如检测犬细小病毒或轮状病毒,一般应采腹泻 幼犬或犊牛的粪便;
标本处理：
采集样本在接种细胞、鸡胚或动物之前,都需要做适 当的处理,以保证病毒分离的成功几率。 采集的器官或组织样本：如肺脏、脑、肝、脾、淋巴 结等,可取一小块进行充分研磨,加入含青、链霉素的 Hanks液,离心取上清液作为接种物; 鼻液、脓汁、乳汁等分泌物或渗出液、粪便,应加入 高浓度的抗生素,充分混匀后,置4℃冰箱内处理2~4h 或过夜,离心后取上清做接种用; 咽喉拭子在取样后应迅速将其浸泡入含有2%小牛血 清和一定浓度的青、链霉素的Hanks液中,充分刷洗 棉拭子,反复冻融3~5次,离心后取上清液作为接种材料。
病毒的分子生物学幻灯片PPT
• 腺病毒分布十分广泛， 从各种胎生哺乳动物、 鸟类和两栖类动物中都已分离到。
• 腺病毒科分两个属： 1、哺乳动物腺病毒属 (Mastadenovirus) 2、禽腺病毒属(Ariadenovirus)。
• 腺病毒感染细胞后可关闭宿主细胞某些 基因的表达，大量合成病毒蛋白质，致 使细胞的功能失常。
病毒的分子生物学幻灯片PPT
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12.1 病毒分子生物学研究的内容
• 病毒分子生物学是用现代分子生物学的 新理论、新技术和新方法对病毒基因组 的结构与功能，基因组的复制、表达和 调控，病毒与宿主的相互作用关系等进 行研究的一门学科。
• 人类对病毒的研究成果在现代分子生物 学的发展史上，做出了重大的贡献。许 多分子生物学上的重大突破都是以病毒 作为模式或研究材料而进行的。
• 病毒进入活的易感宿主细胞后，借助于 宿主细胞本身提供的原料、能量、酶等， 以自我复制的方式进行繁殖。
• 病毒基因的表达包括转录和翻译两个过程。
• 正链RNA病毒的基因组除了作为模板复制出 子代RNA之外，还有mRNA的作用。作为翻 译的模板，一般先翻译出单一的大分子肽链， 然后再由蛋白酶降解为不同功能的结构蛋白 等。
12.2 DNA病毒的分子生物学
• DNA病毒基因组有单链和双链两种结构， 并以线状或环状形式存在，大部分为单 一分子，也有的由数个片段的DNA分子 构成分段的基因组。
• 动物DNA病毒多为双链DNA基因组，腺病毒、 痘病毒、疱疹病毒都是双链线状DNA基因组， 末端有重复序列，经退火能形成环形分子。
• 腺病毒(Aflenovirus)是一种典型的双链DNA病 毒，下面以腺病毒的基因表达调控为例，简 要介绍DNA病毒的分子生物学。
病毒感染PPT课件
由病毒或其他IFN诱生剂诱使人或动 物细胞产生的一类具有抗病毒、抗肿瘤 和免疫调节作用的糖蛋白。
(1)IFN的性质:
干扰素分子量小 4 ℃可保存较长时间，-20 ℃可长期保存活性，
56 ℃可灭活 可被蛋白酶破坏
(2) 种类：抗原性
IFN类型 主要来源 特点
α-IFN I型
Β-IFN
干扰素与敏感细胞表面的干扰素受体结合―――触发信 号传递等一系列的生物化学过程－－－激活细胞内基因 合成多种抗病毒蛋白（AVP）－－－抑制病毒蛋白的合 成。
干扰素
宿主细胞核酸
磷酸二脂酶
抗
2,5,寡腺苷酸 病
合成酶
毒
蛋
蛋白激酶 白
病毒核酸
晚期蛋白
早期蛋白
干扰素的抗病毒作用机制
（二） 、特异性抗病毒免疫
（一） 、非特异性免疫
细胞作用
NK细胞：
1）杀伤过程不受MHC限制，也不依赖抗体 2）对靶细胞无特异性 3）杀伤作用出现早；4 h 4）部分细胞因子可激活
中性粒细胞：能吞噬病毒，但不能将其杀灭，病毒在
其中还能增殖，反而将病毒带至全身引起扩散。
（一） 、非特异性免疫
干扰素（interferon，IFN）
水痘带状疱疹病毒（VZV） 单纯疱疹病毒I型（HSV-1）
c.慢发病毒感染
潜伏期 发作期 死亡
潜伏期长，可达数月、数年甚至数十年；无症状； 分离不出病毒。
一旦发病病情进行性加重，最终患者死亡。
寻常病毒 非寻常病毒
HIV prion
3、病毒携带者
部分隐性感染者一直不产生对该病毒 的免疫力，无症状，带病毒可在体内 繁殖并向外播散
1、体液免疫病理作用
有包膜病毒侵入细胞后，诱发细胞表面出现新 抗原，这种抗原与特异性抗体结合后，在补体 参与下引起细胞的破坏。
(1)IFN的性质:
干扰素分子量小 4 ℃可保存较长时间，-20 ℃可长期保存活性，
56 ℃可灭活 可被蛋白酶破坏
(2) 种类：抗原性
IFN类型 主要来源 特点
α-IFN I型
Β-IFN
干扰素与敏感细胞表面的干扰素受体结合―――触发信 号传递等一系列的生物化学过程－－－激活细胞内基因 合成多种抗病毒蛋白（AVP）－－－抑制病毒蛋白的合 成。
干扰素
宿主细胞核酸
磷酸二脂酶
抗
2,5,寡腺苷酸 病
合成酶
毒
蛋
蛋白激酶 白
病毒核酸
晚期蛋白
早期蛋白
干扰素的抗病毒作用机制
（二） 、特异性抗病毒免疫
（一） 、非特异性免疫
细胞作用
NK细胞：
1）杀伤过程不受MHC限制，也不依赖抗体 2）对靶细胞无特异性 3）杀伤作用出现早；4 h 4）部分细胞因子可激活
中性粒细胞：能吞噬病毒，但不能将其杀灭，病毒在
其中还能增殖，反而将病毒带至全身引起扩散。
（一） 、非特异性免疫
干扰素（interferon，IFN）
水痘带状疱疹病毒（VZV） 单纯疱疹病毒I型（HSV-1）
c.慢发病毒感染
潜伏期 发作期 死亡
潜伏期长，可达数月、数年甚至数十年；无症状； 分离不出病毒。
一旦发病病情进行性加重，最终患者死亡。
寻常病毒 非寻常病毒
HIV prion
3、病毒携带者
部分隐性感染者一直不产生对该病毒 的免疫力，无症状，带病毒可在体内 繁殖并向外播散
1、体液免疫病理作用
有包膜病毒侵入细胞后，诱发细胞表面出现新 抗原，这种抗原与特异性抗体结合后，在补体 参与下引起细胞的破坏。
病毒学-病毒的检验-医学课件
病毒的进化与变异
02
病毒检验的基本原理与方法
病毒检验是指通过实验室技术和方法，对病毒进行分离、鉴定、检测和计数等操作，以提供关于病毒的种类、数量、毒力等信息的过程。
病毒检验的定义
病毒检验对于诊断病毒感染、研究病毒感染的机制、流行病学调查以及疫苗研发等方面都具有非常重要的意义。
病毒检验的重要性
病毒检验的定义与重要性
谢谢您的观看
THANKS
病毒分类
病毒的定义与分类
宿主范围
每种病毒都有特定的宿主范围，包括动物、植物和微生物等。
致病性
病毒的致病性取决于其侵袭宿主细胞和免疫反应的能力，不同的病毒可以引起不同的疾病症状。
病毒的宿主范围与致病性
病毒进化
病毒在传播和繁殖过程中会发生基因突变和基因重组等进化现象。
病毒变异
病毒变异可以导致病毒的抗原性改变、毒力增强或传播途径多样化等。
要点三
预防措施
加强宣传教育，提高公众对病毒感染的防护意识；加强场所卫生管理，做好消毒和隔离措施；控制疫情传播途径，如封闭疫区、限制人员流动等。
要点一
要点二
临床治疗
病毒感染尚无特效药物，以对症治疗和支持治疗为主，同时针对不同病毒感染的特点进行特殊治疗。
疫苗接种
针对部分病毒感染，如流感病毒，接种疫苗可有效降低感染风险和减轻病情。
xx年xx月xx日
病毒学-病毒的检验-医学课件
CATALOGUE
目录
病毒学概述病毒检验的基本原理与方法病毒学应用病毒感染的诊断与防控病毒学研究的发展趋势与挑战
01
病毒学概述
病毒是一种微生物，具有遗传物质（DNA或RNA）和蛋白质外壳，通过感染宿主细胞进行复制和传播。
病毒学-病毒的检验PPT
分子生物学检验
基因测序
对病毒基因组进行测序分析，可精确 鉴定病毒种类和变异情况，为病毒溯 源和防控提供重要依据。
基因芯片技术
利用芯片上固化的探针与病毒核酸进 行杂交，实现对病毒基因组的快速检 测和分型。
免疫学检验
血清学试验
通过检测血清中的病毒抗体，了解机体对病毒的免疫应答和病毒感染状态，如抗 体效价检测、中和试验等。
病毒的纯化与鉴定
纯化方法
采用物理、化学或免疫学方法对病毒 进行纯化，以去除杂质。
鉴定方法
纯化与鉴定注意事项
确保纯化的病毒具有代表性，且无交 叉污染，同时要选择适当的鉴定方法， 以保证结果的准确性和可靠性。
通过电镜观察、免疫学检测、分子生 物学等方法对病毒进行鉴定。
04 病毒的基因组与蛋白质组 研究
免疫荧光技术
利用荧光物质标记抗体或抗原，与细胞或组织中的相应抗原或抗体结合，通过荧 光显微镜观察实现病毒的定位和定性检测。
03 病毒的分离与培养
病毒的分离
01
02
03
分离方法
根据病毒的特性，选择合 适的分离方法，如细胞培 养、鸡胚接种、动物接种 等。
分离过程
将病毒从感染的细胞、组 织或动物中分离出来，并 进行初步的纯化。
病毒基因组的结构与功能
病毒基因组的结构
病毒基因组通常由单链或双链DNA或RNA构成，具有特定的 基因排列顺序。
病毒基因组的功能
病毒基因组通过编码蛋白质和调控蛋白来行使复制、转录、 翻译等功能，以实现病毒的增殖和感染过程。
病毒蛋白质的结构与功能
病毒蛋白质的结构
病毒蛋白质具有特定的空间构象和氨 基酸序列，决定了其生物学功能。
病毒培养
将病毒接种在敏感细胞或动物中 ，观察病毒的繁殖过程和细胞病 变，是形态学检验的重要手段。
感染性疾病的分子生物学检验 医学课件
33
分子生物学检验 ∙
HIV基因组
基因组为RNA双分子，与其它逆转录病毒基本相同 其正链RNA分子大小为
HIV-1 9.3 kb 有3 组共8个基因 HIV-2 9.7 kb 有3 组共9个基因
5’端有帽子结构，3’端有poly(A)结构
34
分子生物学检验 ∙
HIV基因组
第一组：逆转录病毒共同的结构基因和侧翼末端重复顺序 （long terminal repeats）
潜伏感染期间，病原体一般不排出体外 病原携带状态 ------ 可以没有临床症状，而能排出病原体
带病原体的种类不同：带病毒者、带菌者与带虫者 不同携带状态 潜伏期携带者、健康携带者、急性与慢性
携带者 是很多传染病的重要传染源
3
分子生物学检验 ∙
感染性疾病的分子生物学检验策略
一般性检出策略（检出病原体）：
第三组：负调控病毒的感染性，成熟或释放的基因
vif（viral infectivity factor） vpu（viral protein U） vpr（viral protein R）
gag（group of antigen)基因：编码核心蛋白 pol （polymerase）基因：编码逆转录酶，DNA聚合酶 env（envelop）基因：编码包膜蛋白 LTRs：不编码任何蛋白，可起始其它病毒基因的表达，无种属特异性
第二组：参与基因表达的调节基因
tat（trans-acting transcriptional gene） rev（regulator of expression of viral protein） nef（negative regulator factor）
1 样本处理（样本处理区） 2 扩增试剂准备（PCR前准备区） 3 加样（样本处理区） 4 RT-PCR反应（检测区）
分子生物学检验 ∙
HIV基因组
基因组为RNA双分子，与其它逆转录病毒基本相同 其正链RNA分子大小为
HIV-1 9.3 kb 有3 组共8个基因 HIV-2 9.7 kb 有3 组共9个基因
5’端有帽子结构，3’端有poly(A)结构
34
分子生物学检验 ∙
HIV基因组
第一组：逆转录病毒共同的结构基因和侧翼末端重复顺序 （long terminal repeats）
潜伏感染期间，病原体一般不排出体外 病原携带状态 ------ 可以没有临床症状，而能排出病原体
带病原体的种类不同：带病毒者、带菌者与带虫者 不同携带状态 潜伏期携带者、健康携带者、急性与慢性
携带者 是很多传染病的重要传染源
3
分子生物学检验 ∙
感染性疾病的分子生物学检验策略
一般性检出策略（检出病原体）：
第三组：负调控病毒的感染性，成熟或释放的基因
vif（viral infectivity factor） vpu（viral protein U） vpr（viral protein R）
gag（group of antigen)基因：编码核心蛋白 pol （polymerase）基因：编码逆转录酶，DNA聚合酶 env（envelop）基因：编码包膜蛋白 LTRs：不编码任何蛋白，可起始其它病毒基因的表达，无种属特异性
第二组：参与基因表达的调节基因
tat（trans-acting transcriptional gene） rev（regulator of expression of viral protein） nef（negative regulator factor）
1 样本处理（样本处理区） 2 扩增试剂准备（PCR前准备区） 3 加样（样本处理区） 4 RT-PCR反应（检测区）
病毒感染的检查方法与防治原则介绍ppt演示课件
. 19
二、人工被动免疫常用生物制品
免疫血清
血清丙种球蛋白 细胞因子等
.
20
三、病毒感染的治疗 核苷类药物 碘苷 阿昔洛韦 非核苷类反转录酶抑制剂 抗病毒 化学制剂 蛋白酶抑制剂 其他抗病毒药物 干扰素和干扰素诱生剂 中草药
反义寡核苷酸
基因治疗剂 干扰RNA 治疗性疫苗 核酶（ribozyme）
.
5
第一节
病毒感染的检查
电镜直接观察 病毒颗粒 光镜检查包含体
检
测
查病毒
病毒抗原 分离培养 病毒核酸 病毒酶类：如逆转录酶
内
容
查特异性抗体
. 6
一、标本的采集与送检
原则基本与细菌相似，但应注意：
1.标本用“双抗”或两性霉素B处理
2.低温保存，尽快送检
3.血清学诊断采双份血清
. 7
二、病毒的分离与鉴定 （一）病毒分离培养方法类型 细胞培养（cell culture）
病毒学
病毒感染的 检查方法与防治原则
.
1
Hale Waihona Puke 教 学 目 标熟悉： 人工主动免疫和人工被动免疫的常用 生物制品。 了解： 病毒感染的实验室诊断方法。有效抗 病毒药物的抗病毒机制及应用价值。
.
2
思考：
病毒如此之小和活细胞内寄生，我们
如何分离培养及检查？ 血清学诊断和分子生物学检查的理论 基础是什么？ 可通过什么方式预防病毒的感染？
. 12
细胞变圆、聚集、坏死、溶解或脱落 如腺病毒等多数病毒
. 13
红细胞吸附（hemadsorption） HA＋红细胞表面HA受体→细胞吸附
腮腺炎病毒感染细胞 (HA) ＋ 红细胞吸附抑制试验 病毒胞膜表面血凝素 .
二、人工被动免疫常用生物制品
免疫血清
血清丙种球蛋白 细胞因子等
.
20
三、病毒感染的治疗 核苷类药物 碘苷 阿昔洛韦 非核苷类反转录酶抑制剂 抗病毒 化学制剂 蛋白酶抑制剂 其他抗病毒药物 干扰素和干扰素诱生剂 中草药
反义寡核苷酸
基因治疗剂 干扰RNA 治疗性疫苗 核酶（ribozyme）
.
5
第一节
病毒感染的检查
电镜直接观察 病毒颗粒 光镜检查包含体
检
测
查病毒
病毒抗原 分离培养 病毒核酸 病毒酶类：如逆转录酶
内
容
查特异性抗体
. 6
一、标本的采集与送检
原则基本与细菌相似，但应注意：
1.标本用“双抗”或两性霉素B处理
2.低温保存，尽快送检
3.血清学诊断采双份血清
. 7
二、病毒的分离与鉴定 （一）病毒分离培养方法类型 细胞培养（cell culture）
病毒学
病毒感染的 检查方法与防治原则
.
1
Hale Waihona Puke 教 学 目 标熟悉： 人工主动免疫和人工被动免疫的常用 生物制品。 了解： 病毒感染的实验室诊断方法。有效抗 病毒药物的抗病毒机制及应用价值。
.
2
思考：
病毒如此之小和活细胞内寄生，我们
如何分离培养及检查？ 血清学诊断和分子生物学检查的理论 基础是什么？ 可通过什么方式预防病毒的感染？
. 12
细胞变圆、聚集、坏死、溶解或脱落 如腺病毒等多数病毒
. 13
红细胞吸附（hemadsorption） HA＋红细胞表面HA受体→细胞吸附
腮腺炎病毒感染细胞 (HA) ＋ 红细胞吸附抑制试验 病毒胞膜表面血凝素 .
微生物第八章病原学诊断与防治PPT课件
▪ 用已知的细菌或抗原检测患者体液中有无相应特异性抗体 和其效价的动态变化，可作为感染性疾病的辅助诊断。由 于一般采取病人血清进行试验，故称为血清学诊断 (serological diagnosis)。
▪ 血清学诊断试验最好取患者急性期和恢复期双份血清，当 后者的抗体效价比前者升高大于等于4倍时方有意义。
标本
形态结构检查
分离培养与鉴定
病原菌抗原检测 其它检测
光镜、电镜、染色法
培养 形态 生化 特征 特征 反应
血清学 动物 反应 试验
药敏 试验
沉淀反应 细菌代谢产物
协同凝集
（气相色谱）
免疫荧光 PCR查细菌核酸
对流免疫电泳 噬菌体分型
酶免疫测定
细菌素测定
免疫印迹 分子生物学技术
二、血清学诊断
▪ 人体受致病菌感染后，免疫系统产生特异性抗体。抗体的 量常随病程而增加，表现为效价（滴度）升高。
二、病毒的分离培养与鉴定
（一）病毒的分离 动物接种：选择易感动物及适宜接种部位，观察发病情况 鸡胚培养：不同病毒选择不同接种部位（绒毛尿囊膜，尿
囊腔，羊膜腔，卵黄囊），分离流感病毒最常用。
细胞培养：分离病毒最常用的方法
（1）原代细胞—来源于动物、鸡胚、人胚组织细胞，对多种 病毒敏感，但只能传2-3代。
检测病毒特异性IgM抗体可诊断急性感染。
（四） 检测病毒核酸
1 核酸杂交
斑点杂交（dot hybridization） 原位杂交（in site hybridization） DNA印迹杂交（Southern blot） RNA印迹杂交 （Northern blot）
2 核酸扩增
聚合酶链反应 （polymerase chain reaction，PCR） 连接酶链反应（ligase chain reaction，LCR） 反转录PCR（Reverse transcrptase PCR，RT-PCR）
▪ 血清学诊断试验最好取患者急性期和恢复期双份血清，当 后者的抗体效价比前者升高大于等于4倍时方有意义。
标本
形态结构检查
分离培养与鉴定
病原菌抗原检测 其它检测
光镜、电镜、染色法
培养 形态 生化 特征 特征 反应
血清学 动物 反应 试验
药敏 试验
沉淀反应 细菌代谢产物
协同凝集
（气相色谱）
免疫荧光 PCR查细菌核酸
对流免疫电泳 噬菌体分型
酶免疫测定
细菌素测定
免疫印迹 分子生物学技术
二、血清学诊断
▪ 人体受致病菌感染后，免疫系统产生特异性抗体。抗体的 量常随病程而增加，表现为效价（滴度）升高。
二、病毒的分离培养与鉴定
（一）病毒的分离 动物接种：选择易感动物及适宜接种部位，观察发病情况 鸡胚培养：不同病毒选择不同接种部位（绒毛尿囊膜，尿
囊腔，羊膜腔，卵黄囊），分离流感病毒最常用。
细胞培养：分离病毒最常用的方法
（1）原代细胞—来源于动物、鸡胚、人胚组织细胞，对多种 病毒敏感，但只能传2-3代。
检测病毒特异性IgM抗体可诊断急性感染。
（四） 检测病毒核酸
1 核酸杂交
斑点杂交（dot hybridization） 原位杂交（in site hybridization） DNA印迹杂交（Southern blot） RNA印迹杂交 （Northern blot）
2 核酸扩增
聚合酶链反应 （polymerase chain reaction，PCR） 连接酶链反应（ligase chain reaction，LCR） 反转录PCR（Reverse transcrptase PCR，RT-PCR）
病毒感染实验诊断ppt课件
②不出现细胞病变现象。 ③细胞培养液pH的变化。
2.中和试验
病毒与特异性抗体进行免疫反应， 使病毒失去感染性，在细胞培养 和活的机体内不出现病变的试验。 常用细胞培养进行中和试验。如 果特异性抗体能中和病毒，使之 失去感染性，不出现细胞病变效 应，则该病毒为特异性抗体的同 型病毒，
用于病毒的分型诊断最具敏感和 准确性。也可用于检查患者病后 或人工免疫后，机体血清中抗体 增加情况。
2．电子显微镜检查 (1)电镜直接检查：早期病毒感染标 本的病毒颗粒。如“秋季泻”患儿 粪便中的轮状病毒、甲肝患者粪 便中的HAV，疱疹病毒的疱疹液， HBV患者血清，均可观察到特征性 病毒颗粒。
(2)免疫电镜检查：在标本中加入 抗体。使病毒聚集成块负染观 察，更易发现病毒体，灵敏度 可提高100倍。
9．免疫荧光抗体染色
将感染细胞固定，用特异抗血 清荧光标记染色，在荧光显微镜 下，可见细胞内荧光，即可确定 型别。
第三节病毒感染快速诊断
通过测定病毒的特异标志成分，如 特殊形态、特异的抗原成分及病毒 的核酸，早期确认病毒的感染，是 病毒学诊断的重大发展。
一、形态学检查
1．光学显微镜 观察病毒感染细胞出现的包涵体。 根据特点可作出辅助诊断。狂犬病 病毒在脑细胞出现嗜酸性的圆形或 椭圆形包涵体，称为内基小体。巨 细胞病毒在上皮细胞的细胞核内出 现周围绕有一轮晕似“猫头鹰眼”样 大型嗜酸性包涵体。
5．聚合酶链反应(PCR)
选择病毒的特异保守片段作为靶基 因，进行引物设计和扩增可诊断病 毒性感染。选择病毒的易变区，结 合RFLP，测序等技术可以对病毒进 行分型和突变的研究。
(1可通过RT-PCR技术， 将RNA逆转录为cDNA，再进行 PCR扩增。
传代细胞系
8病毒感染的分子生物学检验
DNA 转录 RNA中间体（前基因组）逆转录DNA
6、DNA病毒一般比RNA病毒大，生活周期较复杂
10
RNA病毒基因组特点
1. RNA病毒基因组：多为ssRNA，少数dsRNA 2. 基因组所携带的遗传信息都在同一条链上 3. 许多哺乳动物retro-V为双倍体(+) RNA，它可与宿
主基因重组，干扰宿主基因表达调控 4. 变异率很高 5. 复制和转录常独立于宿主细胞核 6. 均需经逆转录完成基因组复制，错误率高
毒基因表达有关
27
HBV基因组编码产物
病毒颗粒装配，基因组复制，基因表达调控
➢ S基因区→ 外膜蛋白(HBsAg等) ➢ C基因区 → e抗原（HBeAg）
pre-C → 前-C蛋白 C区→ C蛋白(HBcAg)
➢ P基因区→ HBV多聚酶蛋白 ➢ X基因区→ X蛋白（HSxAg）
28
36
HBV耐药性分析
➢ 抗HBV药物：核苷酸类似物（拉米夫定lamivudine，阿德
福韦adefovir等） 服拉米夫定0.5-1年，20%患者产生耐药，服2年，38%耐
药，服4年，66%耐药…
➢ HBV发生耐药突变后肝功能恶化的比例显著增高 ➢ 耐药原因：HBV变异较高
病毒复制须经过RNA中间体的逆转录过程，DNAP具逆转 录酶性质，缺乏严格的校正功能
病毒复制水平下降，病毒蛋白合成减少，血清中 标志物滴度下降 ➢ 功能复杂，能直接或间接损害宿主细胞，导致肝 细胞凋亡、死亡、癌变
34
HBV的分子生物学检验
➢ 病毒核酸的检测 ➢ 病毒的耐药性分析 ➢ 病毒的基因分型
35
HBV核酸检测
HBV DNA是病毒复制和传染性的直接标志 ➢ 普通PCR：特异性引物（保守区） ➢ 荧光定量PCR：灵敏度高，量化 ➢ 支链DNA：灵敏度较低，检测范围较窄 ➢ 核酸杂交：特异性高，灵敏度较低 ➢ 基因芯片：多位点（保守区）
6、DNA病毒一般比RNA病毒大，生活周期较复杂
10
RNA病毒基因组特点
1. RNA病毒基因组：多为ssRNA，少数dsRNA 2. 基因组所携带的遗传信息都在同一条链上 3. 许多哺乳动物retro-V为双倍体(+) RNA，它可与宿
主基因重组，干扰宿主基因表达调控 4. 变异率很高 5. 复制和转录常独立于宿主细胞核 6. 均需经逆转录完成基因组复制，错误率高
毒基因表达有关
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HBV基因组编码产物
病毒颗粒装配，基因组复制，基因表达调控
➢ S基因区→ 外膜蛋白(HBsAg等) ➢ C基因区 → e抗原（HBeAg）
pre-C → 前-C蛋白 C区→ C蛋白(HBcAg)
➢ P基因区→ HBV多聚酶蛋白 ➢ X基因区→ X蛋白（HSxAg）
28
36
HBV耐药性分析
➢ 抗HBV药物：核苷酸类似物（拉米夫定lamivudine，阿德
福韦adefovir等） 服拉米夫定0.5-1年，20%患者产生耐药，服2年，38%耐
药，服4年，66%耐药…
➢ HBV发生耐药突变后肝功能恶化的比例显著增高 ➢ 耐药原因：HBV变异较高
病毒复制须经过RNA中间体的逆转录过程，DNAP具逆转 录酶性质，缺乏严格的校正功能
病毒复制水平下降，病毒蛋白合成减少，血清中 标志物滴度下降 ➢ 功能复杂，能直接或间接损害宿主细胞，导致肝 细胞凋亡、死亡、癌变
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HBV的分子生物学检验
➢ 病毒核酸的检测 ➢ 病毒的耐药性分析 ➢ 病毒的基因分型
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HBV核酸检测
HBV DNA是病毒复制和传染性的直接标志 ➢ 普通PCR：特异性引物（保守区） ➢ 荧光定量PCR：灵敏度高，量化 ➢ 支链DNA：灵敏度较低，检测范围较窄 ➢ 核酸杂交：特异性高，灵敏度较低 ➢ 基因芯片：多位点（保守区）
第八章病毒感染分子生物学检验
001fg，检测范围为2.5ⅹ102~2.5ⅹ109copies/ml
。
第二十六页，共104页。
3. 支链DNA技术 (bDNA技术)
为一种与PCR不同的核酸探针杂交标记信号放大技术。
支链DNA是人工合成的带有许多侧链的DNA片段，在每个侧 链上都有可以标记可被激发的标志物。用bDNA信号放大 系统检测标本中的核酸时，靶核酸本身不被扩增，而是通过 多个探针组成逐级信号放大，以检测核酸。
第二十一页，共104页。
3、DNA多聚酶蛋白
HBV DNAP是由P基因区编码的一种依赖于RNA的DNA聚 合酶，具有逆转录酶的活性。 HBV DNAP存在HBV的核心中。 HBV DNAP含832~845个
氨基酸残基，其一级结构富含组氨酸，是一种碱性蛋白，分子量
约90kDa，需要在2阶镁离子存在条件下起作用。 根据HBV DNAP 的基因功能，大体上将其分成4个功能 性片段：从HBV DNAP的蛋白质N-端，依次为引物酶区 、隔离片区、逆转录酶区和RNaseH区。 HBV DNAP ORF突变可造成HBV复制停止，提示在这一 区域进行定点诱变的研究可为HBV治疗提供重要靶区。
一个完整的病毒体含300~400个S蛋白分子，40~80个中蛋白和 大蛋白分子。在病毒的非复制期几乎含的都是S蛋白，中蛋白小 于1%，无大蛋白；而在病毒的复制期S蛋白与中蛋白比例为10 ：1，大蛋白少于是1/20。
第十七页，共104页。
2、核心区蛋白 HBV DNA的核心基因区编码HBcAg和HBeAg。
第八页，共104页。
（一）乙型肝炎病毒基因组结构
HBV DNA是带有单链区的环状双链DNA分子，是已 知可感染人类最小的DNA病毒。 基因组长为3.2kb，相对分子量为(1.6~2.0)ⅹ106。 HBV的两条链长度不等。长链为负链L(-)：长度固定
。
第二十六页，共104页。
3. 支链DNA技术 (bDNA技术)
为一种与PCR不同的核酸探针杂交标记信号放大技术。
支链DNA是人工合成的带有许多侧链的DNA片段，在每个侧 链上都有可以标记可被激发的标志物。用bDNA信号放大 系统检测标本中的核酸时，靶核酸本身不被扩增，而是通过 多个探针组成逐级信号放大，以检测核酸。
第二十一页，共104页。
3、DNA多聚酶蛋白
HBV DNAP是由P基因区编码的一种依赖于RNA的DNA聚 合酶，具有逆转录酶的活性。 HBV DNAP存在HBV的核心中。 HBV DNAP含832~845个
氨基酸残基，其一级结构富含组氨酸，是一种碱性蛋白，分子量
约90kDa，需要在2阶镁离子存在条件下起作用。 根据HBV DNAP 的基因功能，大体上将其分成4个功能 性片段：从HBV DNAP的蛋白质N-端，依次为引物酶区 、隔离片区、逆转录酶区和RNaseH区。 HBV DNAP ORF突变可造成HBV复制停止，提示在这一 区域进行定点诱变的研究可为HBV治疗提供重要靶区。
一个完整的病毒体含300~400个S蛋白分子，40~80个中蛋白和 大蛋白分子。在病毒的非复制期几乎含的都是S蛋白，中蛋白小 于1%，无大蛋白；而在病毒的复制期S蛋白与中蛋白比例为10 ：1，大蛋白少于是1/20。
第十七页，共104页。
2、核心区蛋白 HBV DNA的核心基因区编码HBcAg和HBeAg。
第八页，共104页。
（一）乙型肝炎病毒基因组结构
HBV DNA是带有单链区的环状双链DNA分子，是已 知可感染人类最小的DNA病毒。 基因组长为3.2kb，相对分子量为(1.6~2.0)ⅹ106。 HBV的两条链长度不等。长链为负链L(-)：长度固定
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第一节 病毒感染的分子生物学检验策略
大约70%的人类感染性疾病是由病毒引起的,有超过400 种以上的病毒可感染人类。 病毒除引起急性感染外，与其他的病原微生物相比，导 致持续性感染比较多见。所谓持续性感染是指在原发感 染之后病毒不能从宿主中被清除，并且继续存留在机体 特定的细胞中。病毒在机体内可持续数月至数年，可出 现症状，也可不出现症状而长期带毒，成为重要的传染 源，如HBV、HIV等。因此对病毒感染的个体进行动态监 测病毒载量、分析病毒感染类型、检测耐药基因及抗议 病毒疗效观测等显得尤为重要。
第八章 病毒感染的分子生物学 检验
感染性疾病是由特定病原体感染机体后所产生的 一类疾病。病原体包括病毒、细菌、原虫、支原 体、衣原体、立克次体、螺旋体、放线菌和寄生 虫等。可采用微生物学、生物化学、免疫学和血 液学的方法对这些病原体进行检测，但是这些方 法受灵敏度和特异性的限制，在明确病因、潜在 感染、早期诊断以及对病原体进行分类、分型鉴 定等方面还存在着较大的缺陷。 随着分子生物学的突破性发展以及相关技术的进 步，优于传统诊断方法的分子诊断技术在疾病早 期诊断、疗效监测、耐药基因分析等凸显优势， 并被广泛应用于病原生物感染性疾病的检测中。
(二)乙型肝炎病毒基因组编码产物
HBV DNA主要有四个开放阅读 码框架，具有强大的蛋白质编 码功能。 pre-S1 pre-S2 S pre-S1蛋白 pre-S2蛋白 HBsAg
长链和短链DNA的5’端位置是固定的，但短链的3’端是 可变的。在负链的5’端一低分子量的蛋白质，在正链5’ 端有一段短RNA，它 们是引导DNA 合成的 引物。两条链的5 ’ 端 以250-300对碱基互 补结合 ，所以也称黏 性末端，是DNA保持 双链环状的基础，也 是HBV最常整合到肝 细胞染色体中的DNA。
Байду номын сангаас
在黏性末端的两侧还各有11个核苷酸 (5’-TCACCTCTGC-3’)构成的顺向重 复序列(DR)，DR1位于 长链的5 ’端，DR2位于 短链的5’端，中间相 隔223个核苷酸，DR是 DNA成环及病毒复制的 关键区域。
HBV基因组负链DNA核苷酸序列上含有6个开放 读码框架（ORF)，其中S、C、P、X 4个ORF 是早已公认的。 HBV DNA为了能在细 胞内独立复制，充分 利用其遗传物质，其 编码区有广泛的重叠， 以扩允其编码容量。 多个ORF 可读码2次 以上，编码2个以上蛋 白质。
一、病毒感染的一般性检出策略 病毒感染的分子诊断策略分为一般性检出策略和 完整性检出策略。 一般性检出策略，只能提供是否存在某种病病毒 感染，即针对病毒的特异性核酸序列通过常用核 酸杂交或PCR 技术直接检出病原体的核酸，临 床可用作判断有无感染和是何种病原体感染，是 快速诊断机体有无病毒感染的首选方法。 可以根据病毒本身的保守序列（如DNA分子中 的一个核苷酸片段或蛋白质中的氨基酸片段）设 计PCR引物或制备特异性探针。
1、S基因区 S基因区分为：前S1区、前S2区和S区。编码外膜蛋白， 前S区与病毒的嗜肝性有关。 S区和前S2区基因长度是固定的，前S1区基因在不同亚 型间有所差别，其氨基酸残基数在108~119范围。
2、C基因区 C基因区分为前C区和C区两部分。 C区由459 个核苷酸组成，编码产物为183 个氨基酸残 基组成的多肽序列，称为C蛋白（HBcAg）； 前C区由87个氨基酸残基组成，编码29个氨基酸残基组 成的多肽称为前C蛋白。 整个C基因区编码212氨基酸残基组成的多肽称为乙型 肝炎病毒e抗原（HBeAg）。
3、P基因区：是HBV DNA中最大的一个ORF，与其他基 因区均有重叠，编码产物是乙型肝炎病毒DNA的多聚酶 蛋白(HBV DNAP）。 P基因区中某些核苷酸也会发生点 突变，造成HBV DNA多聚酶的表达水平减少或完全阻断， 通过研究P基因的结构与功能，可进一步探索抗HBV治疗 的新方法。 4、X基因区：是HBV DNA中最小的一个ORF，编码产物 为x 蛋白(HBxAg)。 HBxAg 的氨基酸残基数在145~154 之间，功能尚未明确，可能是一种反式激活因子，与病 毒基因组的表达调控及 HBV DNA 的整合有关。x蛋白所 诱生的抗体常见于原发肝细胞癌患者体内。
清除病毒
反复清除
乙肝
肝纤维化 肝硬化 失代偿性肝硬化 肝癌
免疫功能正常 病毒清除
终生携带 无症状 无体征
e抗原/e抗体 血清转换 产生s抗体
一、乙型肝炎病毒的基因组结构特征
乙型肝炎病毒属嗜肝DNA病毒科。
嗜肝病毒科有独特的复制方式，病毒合成以RNA中间 体为模板，经反转录合成DNA链，在某些方面，HBV 与逆转录病毒有许多相似性。
（一）乙型肝炎病毒基因组结构
HBV DNA是带有单链区的环状双链DNA分子，是 已知可感染人类最小的DNA病毒。 基因组长为3.2kb，相对分子量为(1.6~2.0)ⅹ106。 HBV的两条链长度不等。长链为负链L(-)：长度固 定，携带有病毒全部的编码 信息。为模板编码病毒蛋白； 短链为正链S(+)：在不同的 分子中长度不等，约负链的 50%～100%。
二、病毒感染的完整性检出策略
完整性检出策略，即不仅对病原体的存在与否 做出明确判断，同时能够诊断出病毒携带者和 潜在性感染者，并能对病毒进行拷贝数测定、 基因分型（包括亚型）检测和耐药性鉴定。常 采用核酸杂交、PCR、基因芯片和DNA测序等 技术。
第二节 乙型肝炎病毒的分子生物学检测
乙型肝炎病毒（hepatitis B virus, HBV）是 引起病毒性肝炎的主要病原体之一。根据有 关资料统计，全球约有3.5亿乙肝病毒携带 者，我国约50％~70％的人群感染过乙肝病 毒，其中乙肝病毒携带者已超过1.3亿，肝 癌发病率也在增加。
HBV 感染后可以引起急性、慢性病毒肝炎，而 且与肝硬化和肝细胞癌的发生、发展有密切的 关系。
缓解
急性感染
稳定
代偿性肝硬化 肝硬化 肝癌
慢性肝炎
死亡
慢性携带者
疾病进展 30-50 年
非代偿性肝硬化
HBV感染者的可能转归
13岁
免疫系统
25-30岁
免疫系统 免疫功能低下 慢性
425岁
识别病毒
幼年 感染 终生不识别