第十二章 植物脱毒技术

（二）植物脱病毒方法
物理方法
化学方法
生物方法
高温处理
珠心培养
愈伤脱毒
热处理脱毒
茎尖培养
微体嫁接
1、通过热处理消除病毒
基本原理：
在高于正常的某一温度范围（35－40℃) 下，植物组织中的很多病毒可被部分地或完全钝 化，但很少伤害甚至不伤害寄主组织。 病毒DNA分子进入细胞后随植物细胞DNA 一起复制。 • 热处理并不能杀死病毒，只能钝化病毒 活性，使病毒在植物体内增殖减缓或增殖停止， 失去传染能力。
热处理的优缺点
• 优点: 方法简单，效果明显。 • 缺点:
• 1)具有局限性，不能去除所有病毒。只对圆形病 毒（苹果花叶病毒），或对线状病毒（马铃薯 卷叶病毒）有效；而对杆状病毒（千日红病毒） 无效。
• 2)热处理后只有小部分植株能够存活。极易使植 物材料受热枯死，造成损失 • 3）延长热处理时间，病毒钝化效果好，同时也 可能会钝化植物组织中的抗性因子而降低处理 效果。
12、3植物脱毒的原理和方法
（一）植物脱毒原理：
1）植物病毒本身不具有主动转 移的能力。 • 在一个植物体内，病毒易于通过维 管系统而移动，但在分生组织中不存在 维管系统。病毒在细胞间移动只能通过 胞间连丝，速度很慢，难赶上活跃生长 的茎尖；
2）在旺盛分裂的分生细胞中，代谢 活性高，竞争抑制了病毒的复制。 3）在植物体内，可能存在着病毒钝 化系统，它在分生组织中比其他 任何区域具有更高的活性。 4）在茎尖存在高水平内源生长素， 也可能抑制病毒的增殖 。
②、在旺盛分裂的分生细胞中，代谢活性 很高，使病毒无法进行复制； ③、倘若在植物体内确实存在着“病毒钝 化系统”的话，它在分生组织中应比在任 何其他区域都有更高的活性，因而分生组 织不受侵染； ④、在 茎尖中存在高水平内源生长素，可 以抑制病毒的增殖。 • 茎尖培养不但可以去病毒，而且可以去掉 所有的病原菌(包括细菌、真菌等）。
12、4、1
外植体名称
在应用组织培养方法以获得无 病菌植物时，所用的所用的外植 体可以是茎尖，也可以是茎的顶 端分生组织。在这里，顶端分生 组织是指茎的最幼龄叶原基上方 的一部分，最大直径约为100um， 最大长度约为250um。 茎尖是由顶端分生组织及 其下方的1-3个叶原基一起构成的 （如图13、2），虽然通过顶端分 生组织培养消除病毒的机会较高， 但在大多数已发表的的工作中， 无毒植物都市通过茎尖培养得到 的。
外植体消毒
浸泡5min
器械消毒
酒精灯灼烧
酒精擦拭培养皿
• 2、茎尖剥离和接种 • 将已消毒的芽放在带滤纸的培养 皿上—器械固定—解剖镜下剥去幼叶 —切下带1-2个叶原基的生长点（0.30.5mm）—切下的茎尖转至培养基上 （顶部向上）。
酒精擦拭
旋转灼烧
显微镜下 获取茎尖
接种
盖好瓶塞
脱毒马铃薯试管苗
• （一）培养基
MS培养基是常用的较好的适于茎 尖培养的培养基之一。下表是几种常用 于茎尖培养的培养基。 虽然较大的茎尖外植体（ 500μm）或更长在不含生长调节剂的培 养基中也能产生一些完整的植株，但一 般来说，含有少量（0.1－0.5mg/L的生 长素或细胞分裂素或二者皆有常常是有 利的。 在各种不同的生长素中，应 当避免使用2，4－D，因为它通常能诱导 外植体形成愈伤组织，广泛使用的生长 素是NAA和IAA，其中NAA由于比较稳定， 效果更好。
和单独采用热疗法相比，茎尖培 养具有更广泛的适用性。很多不能由 单独的热处理消除的病毒，可以通过 茎尖培养和热处理相结合，或单独的 茎尖培养而消除。因而，茎尖培养现 在已经成为消除病毒的一个很常用的 手段。
12、4通过茎尖培养消除病菌
• 1）原理及依据 • 病毒在植物体内分布不均，茎尖处 含量最少 • 病毒DNA分子与细胞分裂蛋白质 合成竞争 • 2）操作程序 • 外植体经表面消毒灭菌后，在解剖 镜下，经无菌操作切取小茎尖，接种到 备用培养基上，放入培养室内进行培养， 并及时观察和记录培养结果。
马铃薯病毒病
马铃薯新品种推广后，随着 种植年限的增加，产量逐年下降 ，植株变矮，薯快变小，并伴有 茎叶异常现象，如花叶、叶片卷 曲或皱缩等。这种现象称之为退 化。 引起马铃薯退化的主要原因 就是病毒病。
花卉
一般来说，病毒侵染花卉后，使花 卉表现褪色、组织坏死和畸形等症状。 但是，有些情况，使花卉的叶和花发生 变异而更具有观赏价值。 菊花中的“绿牡丹”,由于受病毒和 类菌原体的侵染，使菊花花冠卷曲，花 朵呈绿色，而且通过无性繁殖，可以保 存下来。 “矮化因子”实际是一种侵染植物 的病毒，它引起一些木本植物的矮化， 可以将它们利用到果树栽培和盆景制作 中去。
• 3．培养 25+2℃ ，1500-5000LX，10-16h 一般光照培养比暗培养效果好 。其间应更换新鲜培养基。提高培养 基中BA的浓度可形成大量从生芽。 4．生根诱导 诱导生根的方法是将2-3cm高 的无根苗转入生根培养基继续培养1-2 个月可生根。
12、4、3在茎尖中影响脱毒效果的因素
• 全世界已发现植物病毒有近788种。 • 病毒的危害：
• 1、组织和细胞病变
• 2、新陈代谢等生理机能受到干扰 • 3、外观表现不正常状态 • 由于危害可通过营养体传给后代，病毒 对寄主植物可造成毁灭性危害，导致大幅度
减产，甚至全株死亡。世界作物生产中，病
毒危害程度仅次于真菌。
甘蔗黑穗病
2006年，这一疾病能使作 物的生长速度与收成降低百分之 三十，从而使澳大利亚昆州总值 十五亿澳元的蔗糖产业受到灾难 性威胁。有关方面还发现这一疾 病已经传染至该农场中的许多其 它作物。 感染黑穗病的作物呈现弯曲状 ，从作物顶部朝下呈灰至黑色。
• 2、快速繁殖品种，使优良品种迅 速应用。
离体繁殖周期短
• • •
•
◆不受季节限制 ◆繁殖系数高
所不能比的
◆繁殖速度是任何其 他方法
又称之为快繁。
• 3、生产无病毒种苗，防止品种退 化。 • 4、节约耕地，提高农产品的商品 率 • 5、便于运输。
常规的块根、块茎等，体细胞大、 含水量高，包装、运输十分不便。 • 离体繁殖的种苗体积小，易携带， 运输十分方便。
•
作为一种物理效应可以加速植物细胞的分 裂，使植物细胞在与病毒繁殖的竞争中取胜。
植物生长区与热处理区关系图解
• 香石竹（康乃馨）在38℃～40℃下经两个月 处理可除去全部病毒。
• 马铃薯在37℃下处理10～20天能除去卷叶 病毒。
热空气处理脱毒法 试验母株在高温生长室中生 长一段时间，其顶端分生组 织比次生分生组织生长迅速 ，后切取其茎尖分生组织进 行离体培养。 • 生长室温度35-40℃ • 光照3000—10000 lx
（二）外植体大小
• 在最适培养条件下，外植体的大 小可以决定茎尖的存活率。外植体越 大，产生再生植株的机会也就越多， 在木薯中，只有200 μm长的外植体 能够形成完整的植株，再小的茎尖或是形成愈伤组织，或是只能长根。小 外植体可能也不利于茎的生根。然而 ，不应当离开脱毒效率（它与外植体 的大小呈负相关）单独看待外植体的 存活率，因此，外植体应小到足以能 根除病毒，大到足以能发育成一个完 整的植株。
植物组织培养
第十二章 植物脱毒技术
Good Morning
目的与要求
了解脱毒意义，学习植物茎尖脱毒 原理及其操作程序，了解其他组织脱毒 方法及应用，掌握植物理化脱毒方法。 学习植物脱毒苗的鉴定方法，掌握各方 法的鉴定原理，了解植物脱毒苗的保存 和繁殖方法。具备植物茎尖脱毒技术基 础，具有指示植物鉴定脱毒苗的基本能 力，有脱毒苗保存的认知。
•
热处理，可通过热水或热空气进 行。 热水对休眠芽效果较好；热空 气对活跃生长的茎尖效果较好，既 能消除病毒，又能使寄主植物又较 高的存活机会。热空气处理比较容 易进行：把旺盛生长的植物移入到 一个热疗室中，在35~40℃处理一定 时间即可。处理时间的长短，可由 几 分钟到数周不等。
•
热处理时，最初几天空气温度 应逐步增高，直到达到要求为止。 若钝化病毒所需要的连续高温处理 会伤害寄主组织，则应当试验高低 温交替的效果。在热处理期间应当 保持适当的湿度和光照。而且要对 植物进行修剪，以增加植物忍受热 处理的能力。
•
但是，若一个无性系的整个群 体都已受到侵染，获得无病植株的 惟一办法，就是由该植株的营养体 部分把病原菌消除，并由这些组织 中再生出完整的植株。一旦获得了 一个不带病原菌的植株，然后就可 在不致受到重新侵染的条件下，对 它进行营养繁殖。
•
众所周知，病毒在植物体内的分布是不 均匀的。在受侵染的植株中，顶端分生组织 一般说或者是无毒的，或者是只携有浓度很 低的病毒。在较老的组织中，病毒数量随着 与茎尖距离的加大而增加。分生组织所以能 逃避病毒的侵染，可能的原因是：①在一个 植物体内，病毒易于通过维管系统而移动， 但在分生组织中不存在维管系统。病毒在细 胞间移动的另一个途径是通过胞间连丝，但 它的速度很慢，难以追赶上活跃生长的茎尖 ；
•
因此，为了提高产量和促进活 体植物材料的国际交换，根除病毒 和其他病原菌是非常必要的。虽然 通过杀细菌和杀真菌的药物处理， 可以治愈受细菌和真菌侵染的植物 ，但现在还没有什么药物处理可以 治愈受病毒侵染的植物。作物，特 别是无性繁殖。
•
由于大部分病毒都不是通过种子 传播的，因此，若是使用未受侵染或 侵染程度较轻的个体的种子进行繁殖 ，就有可能得到无病毒植株。不过有 性繁殖后代常常表现遗传变异性，在 园艺和造林业中，品种的无性繁殖十 分重要，而这一般都是通过营养繁殖 实现的。如果在一个品种中，并非全 部母株都受到了侵染，那么只要选出 一个或几个无病株进行营养繁殖，也 有可能建立起无病的核心原种。
12、1
引言
多数农作物，特别是无性繁殖作物， 都易受到一种或一种以上病原菌的周身浸 染。例如，已知草莓能感染62种病毒和类 菌质体，因而每年都必须更新母株。病原 菌的侵染不一定都会造成植物的死亡，很 多病毒甚至可能不表现任何可见症状。然 而，在植物中病毒的存在会减少作物的产 量和（或）品质。据报道，当以特定的无 毒植株取代了被病毒侵染的母株之后，产 量最多可增加 300％（平均为30％）。