植物组织培养脱毒方法综述
植物组织培养脱毒快繁技术的综述
植物组织培养脱毒快繁技术的综述摘要：脱除病毒是植物组织培养深入探讨研究中的一个技术难题。
本文结合在桂林莱茵生物科技股份有限公司的实践情况，简要介绍植物组织培养的基本原理和方法，综述植物脱除病毒的热处理、茎尖培养和抗病毒药剂三种方法的原理、发展史和技术方法，并介绍了几种常用的病毒检测方法。
本文以马铃薯为例，重点介绍了利用热处理加茎尖组织培养法获得马铃薯脱毒苗的具体技术方法，脱毒率可达100%。
同时还对植物组织培养脱毒快繁技术的应用前景作了分析。
关键词：茎尖培养，组织培养，快繁脱毒技术，病毒检测，应用前景1植物组织培养研究概况1.1研究简史自从1943年怀特（White）提出植物细胞“全能性”（Totipotency）学说及诸多后学者（Steward，1958，Guha和Marteshwari，1964）相继证实后，引发植物组织和细胞培养快繁技术的勃然兴起。
我国的专家学者在20世纪70年代后也在此领域做了大量的研究和开发工作，创造了很多新方法、新技术，提出不少新成果，开拓了植物组织培养快繁技术的新局面[1]。
目前采用组织培养脱病毒快繁及离体快繁生产株苗的技术已发展相当成熟[2]。
脱毒株苗具有无杂菌、适应能力较强、繁育较快、质量优、抗性好、分蘖性强、繁殖系数高、大批量生产、周年供应、便于运输等优点，已得到有关专家的鉴定及高度评价和种植试验区、种植产区果农的认可。
例如脱毒马铃薯、脱毒红薯、脱毒生姜、脱毒大蒜、脱毒草莓、脱毒苗木、脱毒花卉等等，已成为现代农民致富的新宠[2]。
1.2植物组织培养和脱毒快繁的定义植物组织培养（Plant tissue culture）是指在无菌的条件下，将离体的植物（根、茎、叶、花、果实、种子等）、组织（形成层、花药组织、胚乳、皮层等）、细胞（体细胞和生殖细胞）以及原生质体，培养在人工配制的培养基上，给予适当的培养条件，使其长成完整的植株。
由于培养物是脱离植物母体，在玻璃瓶中进行培养，所以也叫做离体培养。
第三章植物脱毒技术
2、分子生物学检测法
（1）PCR检测法
待测脱毒植物病毒总DNA序列
ACGGGTTATCGGTCGAATAACACGGGCAATTTTACGATTAGACTAACGGGGAGAC TGCCCAATAGCCA 引物 TGCCC 随机引物
ACGGGTTATCGGTCGAATAACACGGGCAATTTTACGATTAGACTAACGGGGAGAC
●同时同样的处理效果也不一样（具有不确定性）。
●对植株有伤害，只有部分植株成活。
●对寄主植物进行较长时间的高温处理有可能钝化植物组织 中的阻抗因子，使寄主植物中抗病毒因子难于活化，从而 增加无效植株的发生率。
三、热处理结合茎尖脱毒
1 把切取的草莓芽洗净后 2 先经过高温短时间热处理，杀死部分病毒； 3 然后在无菌条件下对经过处理的材料，在解剖镜下解剖， 4 切取分生组织尖端0.2-0.3mm生长点， 5 迅速接种到最佳启动培养基上，在25℃下暗培养。 6 待长出愈伤组织后转入光培养， 7 接种到另一种丛芽培养基上，即产生丛生芽及绿苗。 8 将绿苗接种在生根培养基上， 9 20天后待根长2-5cm时即可炼苗移栽，成活率达到95% 以上。
（三）酶联免疫吸附检测法
（四）其它鉴定方法
1、电镜检测法
病毒颗粒一般小于0.1um的微粒，人的眼睛观 察不到，光学显微镜仅观察200nm的微粒，而电子 显微镜则将分辨能力增大至0.5nm。通过电子显微 镜在病毒的薄样品或部分纯化的病毒悬浮液中容易 观察到。采用电子显微镜法鉴定病毒，直接观察有 无病毒颗粒存在，并观察有关病毒颗粒大小、形状 和结构，由于这些特征稳定，对病毒鉴定有很大的 作用。
• 4、生根诱导
组织培养第九章植物脱毒技术
感
9、静夜四无邻，荒居旧业贫。。22.5.222.5.2Monday, May 02, 2022
10、雨中黄叶树，灯下白头人。。18:02:4318:02:4318:025/2/2022 6:02:43 PM
11、以我独沈久，愧君相见频。。22.5.218:02:4318:02May-222-May-22
（三）培养基与培养方式 1、培养基：MS， White , Morel等 2、培养方式：一般采用半固体培养基。
（四）影响茎尖脱毒效果的因素（茎尖脱毒技术 的关键）
植物种类、病毒种类、剥离茎尖的大小（0.30.5mm带1-3个叶原基）、培养基营养
用于脱毒的适宜茎尖大小
植物
病毒名称
马铃薯卷叶病毒 马
感染。 生产场所应隔离病毒感染途径， 做好土壤消
毒或防蚜等工作。在此种植区及种植规模小的地 方，要较长时间才会感染。而在种植时间长、轮 作及种植规模大的产地则在短期内就可感染。
一旦感染，影响产量质量的，就应重新采用 无病毒苗，以保证生产的质量。
思考： 1、说明植物茎尖培养脱毒技术原理及其影响 因素 2、热处理脱毒原理是什么? 3、分别说明植物指示植物法和抗血清鉴定法 原理 4、写出我国的脱毒苗繁育生产体系 5、查阅资料，了解我国脱毒马铃薯生产状况
第二节 脱毒苗鉴定 一、直接检查法
直接观察待侧植株生长状态是否异常，茎叶上有 无特定病毒引起的可见症状，从而可判断病毒是否 存在。 二、指示植物法
将一些对病毒反映敏感，症状特征显著的植物 作为指示植物，用以检验待测植物体内特定病毒的 存在。即指示植物法。
特点：条件简单，操作方便，经济而有效，只 能测出病毒的相对感染力。
矮化
玉米矮化病、泡桐丛 枝病、小麦丛矮病
植物组培脱毒技术及在花卉上的应用
组织培养技术在名贵花卉上的应用前景摘要：综述了组织培养技术的形成、研究进展、意义及其应用植物组培脱毒技术的培养条件，并重点阐述了组织培养方法及其在名贵花卉上的应用以及病毒检测的重要性，最后浅析了组织培养技术存在的问题及展望。
关键词：组织培养；名贵花卉；应用；病毒检测；前景1组织培养技术概述1．1组织培养技术的形成危害植物的病毒、植物菌原体、类细菌有几百种，果树、花卉、蔬菜等植物病毒也不下500多种，绝大多数植物种类是靠无性繁殖的，由于病毒通过无性繁殖传递，在母体内逐代积累，种性退化严重，表现为植物生长受到抑制，形态畸变，产量下降，品质变劣，严重时只好拔除病株，因而造成很大经济损失，而目前生产上对病毒病的防治尚无特效药物。
自从2O世纪5O年代发现通过植物组织培养的方法，可以脱除严重患病毒病植物的病毒，恢复种性，提高产量、质量，组织培养脱毒技术便在生产实践中得到广泛应用，且有不少国家已将其纳入常规良种繁育体系，有的还专门建立了大规模的无病毒苗生产基地。
1．2组织培养技术研究进展white于1943年首先发现，在感染烟草花叶病毒的烟草植株生长点附近病毒的浓度很低，甚至没有病毒，并且病毒的含量随植株部位和年龄而异。
Morel等在这个启示下，于1952年利用感染花叶病毒的大丽菊茎尖分生组织培养，得到了无毒植株。
自1952年以来，通过茎尖分生组织培养或热处理与分生组织培养结合的方法获得成功的实例有100余种，其中最成功的实例之一是马铃薯的脱毒培养Ⅲ。
随着植物细胞培养技术的发展，2O世纪5O年代末通过愈伤组织培养脱毒获得成功。
7O年代初植物原生质体培养成完整的植株，为利用原生质体培育无毒植株提供了可能性。
1975年Shepard_5 通过对瘟染病毒的烟草原生质体的培养得到了无毒植株。
1972年Navarro等将果树嫁接方法与茎尖分生组织培养法两者有机结合，创立了一种新的植物组织培养脱毒技术，即茎尖显微嫁接法。
组织培养第九章植物脱毒技术
•显微镜下 获取茎尖
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•接种
•盖好瓶塞
组织培养第九章植物脱毒技术
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•脱毒马铃薯试管苗
组织培养第九章植物脱毒技术
3．培养
25+2℃ ，1500-5000LX，10-16h 一般光照培养比暗培养效果好。其间应更换新 鲜培养基。提高培养基中BA的浓度可形成大量从 生芽。 4．生根诱导 诱导生根的方法是将2-3cm高的无根苗转入生 根培养基继续培养1-2个月可生根。
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组织培养第九章植物脱毒技术
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组织培养第九章植物脱毒技术
四、分子生物学鉴定 1、双链RNA法
通过提取纯纯化待测植物RNA，并对其进行电 泳分析，可确定dsRNA存在，从而判断待检植物是 否带病毒。 2、互补DNA（c DNA）检测法
也叫DNA分子杂交法
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叶片上产生黄斑、沿叶脉条斑
叶和茎干锈斑、坏死斑 叶片出现褪绿斑点、线纹斑及环斑、 局部坏死、畸形；叶脉间出现星状 透明斑
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组织培养第九章植物脱毒技术
葡萄卷叶病毒 葡萄茎沟病毒 葡萄栓皮病毒 葡萄金黄病毒
欧亚种葡萄 Kober 5BB LN33 Baco 22A
葡萄脉坏死病 110R
葡萄脉斑驳病 河岸葡萄
苹果 柑橘 葡萄 草莓
桃 梨
感染病 毒种类
36 23 26 24 23 11
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组织培养第九章植物脱毒技术
• 所谓脱毒就是采用一定的方法除去植 物体内病毒的技术。 • 无病毒苗：指不含该种植物的主要危 害病毒，即经检测主要病毒在植物体内的 存在表现阴性反应的苗木。
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植物组织培养脱毒技术
植物病毒大部分属于单链RNA病毒，少数为DNA病毒。其基 本形态有杆状、丝状和等轴对称的近球形二十面体。植物病 毒虽是严格的细胞内寄生物，但专一性并不强，往往一种病 毒可寄生在不同种、属甚至不同科的植物上。如烟草花叶病 毒能侵染十多个科，200多种草本和木本植物。
已知的植物病毒种类有600多种，绝大多数种子植物易发生 病毒病。植物被病毒感染后，一般表现出三类症状：①因寄 主细胞的叶绿素或叶绿体被破坏，使植物出现花叶或黄化病 症。②阻碍植株发育，使植株发生矮化、丛枝或畸形等。③ 杀死植物细胞使植株出现枯斑或坏死。
三、植物病毒对植物的侵染途径
由于植物病毒一般无专门吸附结构，而且植物细胞表面至今也 未发现有病毒特异性受体部位，因而植物病毒的侵染途径主要 是通过伤口。如：①借昆虫刺吸式口器损伤植物而侵入细胞。 ②借带病汁液与植物伤口相接触而侵入。③借人工嫁接时的伤 口而侵入。
植物病毒侵入植物细胞后，病毒按其各自的核酸类型进行复制。 其增殖过程因病毒类型不同其细节也很不相同，但步骤大致相 似。
热处理有一定的局限性，一方面热处理只能降低植株内病毒的 含量，单独处理难以获得无毒材料；另一方面热处理时间过长， 会造成植株代谢紊乱，加大品种变异的可能性。生产上通常采 用热处理结合茎尖培养的脱毒方式，获得较高
二、茎尖脱毒
研究表明，茎尖和根尖 的分生组织中一般是无 毒或仅含极低浓度的病 毒粒子。
茎尖由顶端分生组织及 其下的1～3个叶原基构 成。一般大小在0.1～1 ㎜之间.
四、植物病毒病的防治
目前防治植物病毒病的基本策略是：防重于治和综合防治。 一般采取以下措施：
1、选育抗病品种 选育病毒不能侵入或即使侵入也无法复 制的抗病品种和对病毒感染有较强适应性的耐病品种。
植物组织培养脱毒技术综述
植物组织培养脱毒技术综述作者：李美娜来源：《农家科技下旬刊》2015年第06期摘要：植物病毒分布广、危害大，对农业和花卉产业的发展产生了巨大的冲击。
国内外的系统研究和生产实践证明，培育和栽培无病毒种苗是防治作物病毒病的根本措施。
本文通过查阅国内外研究文献和资料，综合阐述了热处理脱毒法、组织培养脱毒法、微体嫁接离体培养脱毒法等方法以及几种常用的病毒检测方法。
关键词：植物组织培养；脱毒技术；检测技术植物病毒分布广、危害大，对农业和花卉产业的发展产生了巨大的冲击。
近年来，随着我国从国外引种花卉的种植面积的扩大以及不规范的繁殖技术，病毒病开始流行，严重影响了中国花卉产业的发展。
目前国内外多用组织培养脱毒方法来阻止病毒病的继续传播以便提高植物的产量和质量。
世界上不少国家十分重视这项工作，把脱除病毒纳入常规良种繁殖的一个重要程序，建立了大规模的无病毒苗生产基地，为生产提供无病毒良种种苗，已经在生产上发挥了重要作用，取得了显著的经济效益。
无病毒良种种苗的优点有：（1）产量提高。
通过脱毒可大大提高作物的产量，如草莓脱毒可提高产量20%—30%、马铃薯脱毒可提高产量40%以上、地瓜脱毒可提高产量30%—50%、苹果脱毒可提高产量15%—45%。
（2）品质提高。
脱毒后的植物所结果实品质提高，如地瓜脱毒可提高出干率0.1%—1.5%；苹果着色好，糖度高；观赏植物生长健壮、花大、花艳，优质花增加，商品价值提高。
（3）抗病性增强。
脱毒后，植物本身抗性提高。
对病虫的抗性增强，如地瓜脱毒后可增强抗茎线虫病；另外，脱毒时，还会同时脱除有些细菌、真菌、线虫等。
一、脱毒技术当前脱除植物病毒的方法有热处理脱毒法、组织培养脱毒法、微体嫁接离体培养脱毒法3类。
其中组织培养脱毒法又包括微茎尖培养脱毒、愈伤组织培养脱毒法、珠心组织培养脱毒法3种方法。
1.茎尖培养脱毒。
（1）茎尖培养脱毒原理。
在染病毒植株体内，病毒分布并不均匀，在生长点病毒含量最低。
植物脱毒组培的方法和原理
植物脱毒组培的方法和原理
植物脱毒组培是一种通过细胞或组织培养技术去除植物组织中的病毒或其他病原体的方法。
其方法包括以下几个步骤：
1. 选择合适的母本植株：选择健康没有病毒污染的植物作为母本植株。
2. 提取母本组织：从母本植株中提取出组织，如叶片、茎段、种子等。
3. 建立细胞或组织培养：将提取的组织转移到营养培养基上，提供适宜的营养物质和激素，促使组织细胞分裂和生长。
4. 建立病毒感染模型：将营养培养基中加入病毒悬浮液或病毒感染的植物部分，使细胞或组织感染上病毒。
5. 选择抗病株系：在病毒感染的条件下，筛选出能够抵抗病毒感染的细胞或组织，这些细胞或组织可以表现出无病毒或低病毒含量的状态。
6. 培养和繁殖抗病株系：将筛选出的抗病细胞或组织进行继代培养，使其继续增殖和繁殖。
植物脱毒组培的原理主要基于以下几个方面：
1. 细胞或组织培养条件的控制：适宜的培养基成分和激素浓度能够促进细胞分裂和生长，同时也能够改变细胞的物质代谢和
抵抗能力，有利于抗病性的培养。
2. 细胞再分化的能力：在培养条件下，植物组织细胞有再分化为器官样组织的能力，可以通过再分化获得无病毒细胞或组织。
3. 病毒感染的选择性：某些植物病毒在体内能够引起明显的病症，但在体外无法复制，通过在体外培养条件下去除病毒复制的环境，可以选择出无病毒的细胞或组织。
4. 细胞或组织的抗病机制：植物组织细胞通过产生抗病蛋白、抗氧化物质等手段，形成对病毒感染的抵抗能力，通过培养和筛选可以选择出具有这种抗病机制的细胞或组织。
植物脱毒组培方法的应用可以用于繁殖无病毒植株、培育新品种、保存稀有植物等。
植物组织培养脱毒外植体脱毒方法[发明专利]
![植物组织培养脱毒外植体脱毒方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/003c5c10492fb4daa58da0116c175f0e7cd119cb.png)
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201611092064.4(22)申请日 2016.12.01(71)申请人 大连大学地址 116622 辽宁省大连市经济技术开发区学府大街10号(72)发明人 侯义龙 (74)专利代理机构 大连智高专利事务所(特殊普通合伙) 21235代理人 胡景波(51)Int.Cl.A01H 4/00(2006.01)(54)发明名称植物组织培养脱毒外植体脱毒方法(57)摘要本发明属于植物脱毒技术领域，特别涉及植物组织培养脱毒外植体脱毒方法。
该方法包括以下步骤：选取植物成熟组织，将其进行灭菌处理后于初代培养基进行初代培养，在初代培养的基础上进行增殖培养，在增殖培养的基础上进行病毒检测，挑选病毒阴性的继代苗扩大繁殖量后进行生根培养，至长出良好的根系后驯化、移栽。
本发明采用成熟组织作为外植体，使得组织培养脱毒操作变得更加简单，大大提高分化率和成活率，脱毒的成功率高。
权利要求书1页 说明书5页 附图1页CN 106665352 A 2017.05.17C N 106665352A1.植物组织培养脱毒外植体脱毒方法，其特征在于，包括以下步骤：选取植物成熟组织，将其进行灭菌处理后于初代培养基进行初代培养，在初代培养的基础上进行增殖培养，在增殖培养的基础上进行病毒检测，挑选病毒阴性的继代苗扩大繁殖量后进行生根培养，至长出良好的根系后驯化、移栽。
2.根据权利要求1所述的植物组织培养脱毒外植体脱毒方法，其特征在于，所述的方法具体为：(1)将休眠季或生长季的植物成熟组织用流水清洗，放入30～50wt％大蒜水溶液中灭菌20～40min；(2)灭菌后的外植体立即接种在初代培养基中，待诱导出愈伤组织后转移到继代培养基中进行增殖培养；(3)待增殖培养的无根苗达到较大数量时，取50～10mg叶片进行病毒检测，将检测结果为阴性的继代苗继续在增殖培养基中培养；(4)待继代苗培养至一定数量后转移至生根培养基中进行生根培养；(5)待长出良好的根系后驯化、移栽。
果树组织培养脱毒技术与检测方法
再浇回头水，以后注意保持苗床湿润。
2.3砧木管理移后待苗返青时，即可薄施腐熟人粪尿或0.5%～1.0%尿素+复合肥液，30～40d后每20d施1次。
拔除营养袋内外杂草，苗高30cm时摘心，促进茎干增粗。
3嫁接苗培育3.1嫁接时期10月至第二年4月均可嫁接，选择晴天进行较好。
在结果树树冠外围中上部取当年生或1年生生长充实的木栓化或半木栓化的枝条作接穗，一般即采即接，如不能当天嫁接的，应用吸水纸或湿毛巾包裹，套上薄膜袋，存放阴凉处保存。
3.2嫁接方法采用单芽或枝条切接，砧木离地面15～25cm，茎粗达0.5cm以上的均可嫁接。
先在离地15～25cm处剪断，然后用嫁接刀把剪口向上削45度左右斜面，再在斜面下端木质部直削口长2cm的切口。
接穗长3～10cm，下端削成45度左右，插时砧穗形成层对准、贴紧，然后用嫁接薄膜把砧木切口和接穗密封包扎好。
3.3嫁接苗管理嫁接后15d内不浇水，以利接口愈合。
接后15～30d，接穗和砧木部陆续萌芽，早期把砧木部的芽全部抹除，接穗萌芽过密的抹除后留2～3个。
接后1个月左右，对嫁接未成活的砧木及时补接，使苗圃生长一致，提高出圃率。
待嫁接苗第一枝梢稳定后，每月施稀薄人粪尿或0.5%～1.0%尿素+复合肥液。
出圃前15d，应停止施肥浇水以炼苗。
嫁接苗高60cm以上、茎粗1.0cm以上，便可出圃定植。
通过多年生产实践表明，采用简易塑料薄膜小拱棚进行杨桃种子催芽，能达到冬天保温增温和夏天防雨的效果，减少幼苗期立枯病和猝倒病的暴发。
通过一整套科学的管理技术，幼苗移栽成活率达96%以上，袋装苗嫁接成活率95%以上，出圃率90%以上，取得了较好的效果。
果树是多年生植物，在长期无性繁殖过程中，大多感染和积累了多种病毒。
1965年世界各国在落叶果树上共发现84种病毒病，到2003年增加到180种。
目前，我国各地调查鉴定明确的果树病毒及类病毒病害约60种[1]，因而每年都必须更新母株。
病原菌的侵染并不都会造成植物的死亡，很多病毒甚至可能不表现任何可见症状，然而，在果树中病毒的存在会减少其产品的产量和质量。
植物组织培养脱毒方法综述
植物组织培养脱毒方法综述摘要：植物病毒是制约花卉产业发展的重要因素，通过茎尖处理、茎尖结合热处理、冷处理、化学药剂处理及愈伤组织处理等方法可以去除植物病毒。
通过查阅国内外研究文献和资料，综合阐述了茎尖培养脱毒、热处理脱毒、化学药剂培养脱毒、愈伤组织脱毒、冷处理脱毒等方法。
关键词：组织培养；脱毒；茎尖培养正文：植物病毒分布广、危害大，对世界花卉产业的发展产生了巨大的冲击。
近年来。
随着我国从国外引种花卉的种植面积的扩大以及不规范的繁殖技术，病毒病开始流行，严重影响了中国花卉产业的发展。
目前国内外多用组织培养脱毒方法来阻止病毒病的继续传播以便提高植物的产量和质量。
因此，本文对当前植物组织培养脱病毒方法作了综述，以期从中得到启示，进一步促进植物脱毒方法及应用的相关研究。
植物组织培养脱毒方法有茎尖培养脱毒、热处理脱毒、冷处理脱毒、化学药剂处理脱毒、花药培养脱毒、愈伤组织脱毒、珠心胚培养脱毒、茎尖微体嫁接脱毒等，其中由于茎尖培养脱毒效果好，是目前植物无病毒苗培育应用最广泛、最重要的一个途径。
研究表明，如果将不同的方法结合起来应用效果会更好，通常将茎尖结合热处理来脱毒。
1、茎尖培养脱毒茎尖培养脱毒原理：在染病毒植株体内，病毒分布并不均匀，在生长点病毒含量最低。
病毒通过维管束和胞间连丝传播，在分生区内无维管束，病毒扩散慢，加之植物细胞不断分裂增生，所以病毒含量少，在茎尖生长点几乎检测不出病毒，因此切取茎尖愈小愈好，但实际操作中茎尖取太小不易培养成活，过大又不能去毒。
1．1 茎尖培养的方法及注意事项将消毒后的材料放置在20～40倍解剖显微镜下，用解剖刀剥取0．1～1 mm 的茎尖，迅速放入培养基中，如果在空气中暴露时间过长，就会因失水引起茎尖死亡。
赵军良等人的研究表明，带有一个叶原基的茎尖，脱毒效果最好，成活率最高[3]。
不同的植物材料茎尖剥取的方法和最适合脱毒的茎尖大小不同。
在菊花的茎尖培养中，在超净工作台内将消毒后的茎尖中用肉眼能看到的叶柄切除，在实体解剖镜下用解剖刀剥离顶芽至露出带有1～2片叶原基的生长点，生长点大小约在0.3～0.5 mm左右。
植物脱毒方法
植物脱毒方法
1、茎尖培养脱毒:病毒在植物体内的分布并不均匀,越靠近茎端的病毒的感染深度越低,生长点则几乎不含或含病毒很少。
2、愈伤组织培养脱毒法:通过植物的器官和组织的培养,脱分化诱导产生愈伤组织,然后从愈伤组织再分化产生芽,长成小植株,可以得到无病毒苗。
3、珠心胚培养脱毒:病毒一般不通过种子传播,由珠心细胞发育成的胚再生的植株是无毒的,并具有与母本相同的遗传特性。
4、茎尖微体嫁接:将实生苗砧木在人工培养基上种植培育,再从成年无病树枝上切取0.4—1.0mm茎尖,在砧木上进行试管微体嫁接,以获得无病毒幼苗。
5、花药培养脱毒。
6、热处理脱毒:一些病毒对热不稳定,在高于常温的温度下(35-40°C),即钝化失活。
7、化学处理:抑制或杀死病毒。
7.植物组织的脱毒培养(植物组织培养)
第七章植物组织的脱毒培养一、植物病毒的危害病毒:一类结构简单生物，由核酸和蛋白质分子组成。
病毒结构简单，没有完整的酶系统来独立地进行物质代谢和能量代谢，只能依靠寄主生物的酶系统实现生理代谢过程，因此，具有寄生性。
病毒侵入寄主后，在寄主细胞中进行自我复制而迅速增殖，并扩展到植物全株发病。
病毒病不同于真菌和细菌病害，不能用杀菌剂和抗菌素进行防治，与细胞共生，一旦染病，只能采用拨除病株的措施。
病毒危害：1）导致植物产量和品质的大幅度降低。
2）通过无性繁殖或者种子传给下一代。
通过植物组织培养方法，可脱除植物病毒，恢复种性，使品种复壮，提高产量品质。
二、植物组织中病毒的分布病毒在植物组织中分布不均匀：在顶端分生组织中含毒少，在老组织中病毒增加。
（茎尖培养脱毒的理论依据）植物茎尖分生组织无病毒原理（原因）：(1) 能量竞争：病毒核酸和植物细胞分裂时DNA合成均需要消耗大量的能量，而分生组织细胞本身很活跃，其DNA 合成是自我提供能量自我复制，而病毒核酸的合成要靠植物提供能量来自我复制，因而就得不到足够的能量，从而就抑制了病毒核酸的复制。
(2) 传导抑制：病毒在植物体内的传播主要是通过维管束实现的，但在茎尖分生组织中，维管组织还不健全或不存在，从而抑制了病毒向分生组织的传导。
(3) 激素抑制：在分生组织中，生长素和细胞分裂素水平均很高，因而阻滞了病毒的侵入或者抑制病毒的合成。
(4) 酶缺乏：1969年，Stace-Smith提出，可能病毒的合成需要的酶系统在分生组织中缺乏或还没建立，因而病毒无法在分生组织中复制。
(5)抑制因子：1976年，Martin-Tanguy等提出了抑制因子假说，认为在分生组织中存在有某种抑制因子，如“酶钝化系统” 。
三、脱除植物病毒的方法(一)茎尖培养脱毒1、根据培养目的和取材大小可将茎尖培养分为:1）普通茎尖（Shoot tip）培养较大茎尖（几毫米至几十毫米的茎尖）培养技术。
技术简单，操作方便，茎尖易成活，成苗所需时间短，能加速繁殖速度。
植物组培脱毒技术及在花卉上的应用
植物组织培养课程作业植物组培脱毒技术及在花卉上的应用摘要：综述了植物组培脱毒技术的形成、研究进展、意义及其应用植物组培脱毒技术的培养条件，并重点阐述了植物组培脱毒方法及其在花卉上的应用以及病毒检测的重要性，最后浅析了植物组培脱毒技术存在的问题及展望。
关键词：植物组培脱毒；花卉；应用；病毒检测英文摘要：Methods of plant tissue introduces, the formation of the research progress and application, meaning plant tissue culture conditions of virus-free techniques, and focuses on plant tissue in the flower method and its overviews of the application and the importance of virus detection, and finally analyses the plant tissue introduces existing problems and prospect.1 植物组培脱毒技术概述1．1 植物组培脱毒技术的形成危害植物的病毒、植物菌原体、类细菌有几百种，果树、花卉、蔬菜等植物病毒也不下500多种，绝大多数植物种类是靠无性繁殖的，由于病毒通过无性繁殖传递，在母体内逐代积累，种性退化严重，表现为植物生长受到抑制，形态畸变，产量下降，品质变劣，严重时只好拔除病株，因而造成很大经济损失，而目前生产上对病毒病的防治尚无特效药物。
自从2O世纪5O年代发现通过植物组织培养的方法，可以脱除严重患病毒病植物的病毒，恢复种性，提高产量、质量，组织培养脱毒技术便在生产实践中得到广泛应用，且有不少国家已将其纳入常规良种繁育体系，有的还专门建立了大规模的无病毒苗生产基地。
植物组织培养技术植物脱毒快繁技术
能会产生变异植株。
植物组织培养技术植物脱毒快繁技 术
理由：①病毒的复制速度赶不上细胞的增殖 速度；② 有些细胞通过突变获得了抗病毒 的抗性。
缺点：植株遗传性不稳定，可能会产生变异 植株
植物组织培养技术植物脱毒快繁技 术
（二）茎尖微体嫁接
1. 概念：将无病毒茎尖（ 0.4~1.0mm ）嫁接在培养基 上培养的实生砧木上，以获得脱毒苗木的技术。
植物组织培养技术植物脱毒快繁技 术
无病毒植株培育的意义
1. 去除病毒危害，提高作物品质与产量。采用生物、物理、 化学等途径防治病毒病收效甚微，甚至毫无成效。而通过 组织培养的方法可以脱除严重患病毒植物的病毒种类，提 高产量、质量。因此，到60至70年代在花卉、蔬菜和果 树等得到广泛的应用。 2. 减少环境污染，有利于保护环境 栽培去病毒植物可 减少药剂的使用。
植物组织培养技术植物脱毒快繁技 术
茎尖培养的继代培养和生根培养和一般器 官的培养相同。
茎尖培养脱毒，由于其脱毒效果好，后代 稳定，所以是目前培育无病毒苗最广泛和最 重要的一个途径。
植物组织培养技术植物脱毒快繁技 术
4、影响微茎尖成活及脱毒的因素 （1）母体材料病毒侵染程度
被单一病毒感染的植株脱毒较容易，复合感染的较难。
植物组织培养技术植物脱毒快繁技 术
1、愈伤组织培养脱毒
愈伤组织细胞带病原菌不均一，部分细胞不带病 毒，由这些细胞再生的植株是无病毒的。多次继代的 愈伤组织中病毒含量下降，甚至检测不出病毒。
植物组织培养技术植物脱毒快繁技 术
愈伤组织的某些细胞不带病毒原因：
1、病毒的复制速度赶不上细胞的增殖速度；
2、有些细胞通过突变获得了抗病毒的抗性。
植物组织培养项目六 植物脱毒技术
5）电镜检测法
用电子显微镜直接观察经脱毒培养的叶片，检查是否 有病毒粒子存在，还可测量病毒颗粒的大小、形状（ 杆状、线状、球状）和结构。
二、脱毒苗的保存
1. 隔离保存：避免脱毒苗再次感染病毒，脱毒
苗需隔离与保存，最好将无病毒母本园建立
在相对隔离的山上（300 目的防虫网室），
管理得当可保存5 ~ 10 年。
2. 长期保存
将无病毒苗原种的器官或幼小植株接种在 培养基上，低温离体保存。
1）低温保存： 1-9 ℃ 的低温、并低光照保存，只需半 年或1年更换1次培养基（最小生长法）
2）冷冻保存（超低温保存）：液氮（-196 ℃）
①材料选择
植方式移入蛭石、河沙、椰壳等基质中培养。
3. 理化方法脱毒
1）物理方法
① 高温处理（热处理 / 温热疗法）：病毒对热
不稳定，高于常温的温度（ 35-40 ℃ ）下钝
化失活。
温汤处理：50 ℃左右热水中浸泡数分钟至几 小时（适用于离体材料和休眠器官的处理）
热风处理：盆栽植物移入室内或生长箱中， 35-40 ℃
2）茎尖大小与脱毒效果：顶端分生组织即生长点（最大直
径0.1 mm）；也可是带1-3个幼叶原基的茎尖（0.3-0.5 mm） 最适合作外植体，脱毒效果好。
方法
1）取样与消毒：取植株顶芽或侧芽梢段 消毒方法：剪取顶芽梢段（侧芽） 3-5 cm 。剥去大
叶，自来水冲洗干净，用 75%酒精浸泡 30 s左右，再
处理几十分钟至数月。 处理温度和处理时间因植物种类、器官类别、生理状 况、待脱除病毒的种类等而异。 变温处理可消除病毒但不伤及植物。
植物组培热处理脱毒原理
植物组培热处理脱毒原理
植物组培热处理脱毒是一种常见的植物组织培养技术，其原理是通过高温杀菌的方式，去除植物体内的病毒、细菌和真菌等微生物，使植物能够得到更好的生长和发育。
组织培养是指从植物体中取出一小段组织，经过适当处理后，培养在含有营养物质和
激素的培养基中，使其在无菌条件下生长和分化。
组织培养技术已被广泛应用于植物的疫苗、生根和繁殖等方面，大大促进了植物研究和生产的发展。
然而，在进行组织培养技术时，植物体内常常存在各种病毒、细菌和真菌等微生物。
这些微生物往往会对植物的生长和发育造成严重的危害，导致组织死亡、变色和凋萎等现象，从而影响培养的效果。
因此，在进行组织培养时，必须进行脱毒处理，以确保培养的
顺利进行。
植物组培热处理脱毒就是一种常见的脱毒处理方法。
它的原理是利用高温杀菌的方式，将培养物暴露在高温环境中，使其中的病毒、细菌和真菌等微生物被彻底杀死。
一般来说，热处理温度一般为55℃~60℃，时间约为30min~60min。
具体操作步骤如下：
1. 将已经准备好的培养物放入培养瓶中，加入适当的脱毒液（如未加糖的MS培养基）。
2. 将培养瓶密封好，放入加热设备中进行热处理。
3. 培养瓶中的培养物应保持水平，避免挤压和震荡，以免造成组织的损伤。
4. 热处理完成后，将培养物取出，置于标准的组织培养环境中，等待其生长和发
育。
植物组织培养脱毒
第九章植物组织培养脱毒一、植物病毒的危害和培养无病毒植物的意义1、植物病毒的危害病毒给植物生产带来的损失是很大的，如草莓病毒的危害，使草莓产量严重降低，品质大大退化。
葡萄扇叶病毒使葡萄减产10%-18%。
花卉病毒的危害一般会影响花卉的观赏价值，其表现是花少而小，产生畸形、变色等。
而且病毒危害与细菌、真菌不同，不能通过化学药剂进行防治。
2、病毒的特性及其浸染病毒是指在活体细胞内寄生增殖的不具细胞结构的生命体。
病毒在植物体内的主要传播途径有：☐介体传播。
如蚜虫、叶蝉、螨类等。
☐机械传播（汁液摩擦传播）。
☐无性繁殖材料和嫁接传播。
☐种子和花粉传播。
3、无病毒苗培育的意义无病毒良种种苗的优点产量提高品质提高抗病性增强如草莓可增产20%—50%，植株结果多，单果重增加，上等果比例提高。
菊花切花品种的脱毒株，表现出株高增加，切花数增多，花朵较大等特点。
“无病毒”概念通常所说的无病毒应为“特定无病毒或特定无病原菌”.无病毒苗是一个相对概念,并不是绝对不带有任何病毒,只是不带有对当地生产危害最大的几种病毒而已.二、脱除植物病毒的原理及方法•热处理脱毒法•微体嫁接离体培养脱毒法•微茎尖培养脱毒法•珠心组织培养脱毒法组织培养脱毒法•愈伤组织培养脱毒法1、热处理脱毒植物细胞分裂和病毒繁殖之间存在着相互竞争。
在快速分裂的细胞中是正常核蛋白合成占优势，而在细胞伸长期间是病毒核蛋白的合成占优势，因此加速分生组织细胞的分裂，是能获得无病毒植株的。
热处理可以钝化病毒的活性，使其增殖减缓或停止，失去传染能力。
但并不能杀死病毒。
热处理方法愈伤组织热处理 热空气处理热处理脱毒的局限性并非所有病毒都对热处理敏感延长热处理时间，病毒钝化效果好，同时也可能钝化植物中的抗性因子而降低处理效果。
热处理后只有一小部分植株能够存活。
2 微体嫁接离体培养脱毒法也称“试管嫁接”，是把极小（小于0.2mm）的茎尖作为接穗接到实生砧木上（无菌种子培养获无菌苗，种子实生苗不带毒），然后将嫁接后的砧木接种到新的培养基上培养。
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植物组织培养脱毒方法综述符国芳,李 青(北京林业大学,北京100083)摘要:植物病毒是制约花卉产业发展的重要因素,通过茎尖处理、茎尖结合热处理、冷处理、化学药剂处理及愈伤组织处理等方法可以去除植物病毒。
通过查阅国内外研究文献和资料,综合阐述了茎尖培养脱毒、热处理脱毒、化学药剂培养脱毒、愈伤组织脱毒、冷处理脱毒等方法。
关键词:组织培养;脱毒;茎尖培养中图分类号:S432 4+1 文献标识码:A 文章编号:1002-7351(2007)03-0255-04Summarization on the methods of virus elimination by plant tissue cultureFU Guo fang,LI Qing(Beijing Forestry U niversity ,Beij ing 100083,China)Abstract:Plant virus is the factor that inhibits flow er industr y development Plant v irus can be eliminated by shoot tip treatment,shoot t ip and heat treatment,cold treatment,chemical treatment and callus treatment,so o n By searching the research bibliog ra phies home and abr oad,this paper describes the methods to eliminate v irus by shoot t ip culture,heat treatment,chemical treat ment,callus treatment and cold treatment,so onKey words:tissue culture;vir us elimination;shoot tip culture植物病毒分布广、危害大,对世界花卉产业的发展产生了巨大的冲击。
近年来,随着我国从国外引种花卉的种植面积的扩大以及不规范的繁殖技术,病毒病开始流行,严重影响了中国花卉产业的发展。
目前国内外多用组织培养脱毒方法来阻止病毒病的继续传播以便提高植物的产量和质量。
因此,本文对当前植物组织培养脱病毒方法作了综述,以期从中得到启示,进一步促进植物脱毒方法及应用的相关研究。
植物组织培养脱毒方法有茎尖培养脱毒、热处理脱毒、冷处理脱毒、化学药剂处理脱毒、花药培养脱毒、愈伤组织脱毒、珠心胚培养脱毒、茎尖微体嫁接脱毒等,其中由于茎尖培养脱毒效果好,是目前植物无病毒苗培育应用最广泛、最重要的一个途径[1]。
研究表明,如果将不同的方法结合起来应用效果会更好,通常将茎尖结合热处理来脱毒。
1 茎尖培养脱毒茎尖培养脱毒原理:在染病毒植株体内,病毒分布并不均匀,在生长点病毒含量最低。
病毒通过维管束和胞间连丝传播,在分生区内无维管束,病毒扩散慢,加之植物细胞不断分裂增生,所以病毒含量少,在茎尖生长点几乎检测不出病毒,因此切取茎尖愈小愈好,但实际操作中茎尖取太小不易培养成活,过大又不能去毒[2]。
1 1 茎尖培养的方法及注意事项将消毒后的材料放置在20~40倍解剖显微镜下,用解剖刀剥取0 1~1mm 的茎尖,迅速放入培养基中,如果在空气中暴露时间过长,就会因失水引起茎尖死亡。
赵军良等人的研究表明,带有一个叶原基的茎尖,脱毒效果最好,成活率最高[3]。
不同的植物材料茎尖剥取的方法和最适合脱毒的茎尖大小不同。
在菊花的茎尖培养中,在超净工作台内将消毒后的茎尖中用肉眼能看到的叶柄切除,在实体解剖镜下用解剖刀剥离顶芽至露出带有1~2片叶原基的生长点,生长点大小约在0 3~0 5mm 左右,大于以上尺寸脱毒率将会下降,反之成活率将会下降,迅速将摘出的生长点置于培养基中[4]。
就香石竹而言,切掉叶柄后,收稿日期:2007-01-08;修回日期:2007-03-15作者简介:符国芳(1982-),女(土家族),湖南张家界人,北京林业大学硕士研究生,从事园林植物组织培养研究。
第34卷第3期2007年9月福建林业科技Jour of F ujian Forestry Sci and T ech V ol 34 N o 3Sep ,2007生长点是在几重叶原基的包围下,要从外到内逐一切掉外层叶原基,当生长点露出时把包括1~2片叶原基在内的生长点切下,迅速移入事先预备好的培养基内,注意生长点的方向及不要把生长点埋在培养基内[5]。
在康乃馨的茎尖培养中取带有1~2个叶原基、长0 2~0 3mm 的茎尖接种到培养基上,接种时只须沾取茎尖置于轻轻划破的培养基表面即可[6]。
洋葱可用0 5~0 7mm 茎尖培养,能有效地脱除洋葱中的O YDV 和GLV 病毒[7]。
在对白葱的茎尖脱毒研究表明,以带有1片叶原基大小为0 2~0 6mm 的茎尖外植体较为适宜[8]。
1 2 茎尖培养可能出现的问题及防治方法茎尖培养可能出现褐化、玻璃化等现象,这会严重影响植物的成活率,所以必须解决这些问题。
褐化是由于外植体在培养过程中分泌的酚、醌类物质妨碍自身的生长,而活性炭可以吸附外植体在培养过程中的有害物质,从而达到防止褐化的目的。
在香蕉茎尖培养的培养基中加入活性炭或与维生素C 配合使用均能改善外植体褐变情况[9]。
玻璃化是植物组织培养过程中特有的一种生理失调或生理病变,很难继续用作继代培养和扩繁材料,生根困难,移栽后也很难成活。
实验表明,采用强光10000~20000lx ,在培养中提高糖和琼脂的浓度,降低细胞分裂素的用量,对克服香石竹茎尖培养玻璃化有明显效果[10]。
2 热处理脱毒热处理的原理是病毒由蛋白质组成,高温可以使蛋白质变性,所以通过高温钝化病毒。
热处理的材料可以是母株(已长芽的块茎),也可以是已经剥离的已长到1cm 左右的小植株[11]。
高温热处理是在恒温箱内进行,将籽球或小苗放入恒温箱中,起点温度可稍低些,逐渐升至处理温度,一般在35~54 条件下热处理几小时、几天甚至几个月[12]。
热处理通常与茎尖培养相结合脱毒,对于单用茎尖或热疗法难以脱除的病毒,可先进行热力处理,使植株茎尖无毒化,再采用茎尖组织培养法,这样可以提高脱毒成功的几率[13]。
赵祝成等人用水仙0 2~0 3mm 微茎尖培养、37 1 热力处理30d,可以有效脱除水仙病毒[16]。
香石竹置于38 环境中60d,其茎尖中的病毒即可被消除[10]。
在热处理茎尖的过程中,通常温度越高、时间越长、脱毒效果就越好,但是同时植物的生存率却呈下降趋势[14],所以温度选择应当考虑脱毒效果和植物耐性2个方面。
洪霓等在梨病毒的脱毒研究中采用2种处理,一为恒温处理,温度控制在37 1 ;二为变温处理,温度为32 和38 每隔8h 变换1次,发现变温处理比恒温处理植株死亡率低,脱毒效率高[15]。
热处理的缺陷是不能脱除所有病毒。
例如在侵染马铃薯的病毒之中,对于PLRV 、PVA 和PVY 不进行高温预处理,脱毒率也相当高,而高温预处理却可以显著提高对PAMV 、PVX 和PVS 的去除[17]。
一般而言,对于球状病毒和类似纹状的病毒以及类菌质体所导致的病害才有效,对杆状和线状病毒的作用不大。
3 化学药剂处理脱毒其原理是抗病毒药剂在三磷酸状态下会阻止病毒RNA 帽子结构形成[19]。
常用的抗病毒化学药物有三氮唑核苷(病毒唑),5 二氢尿嘧啶(DH T)和双乙酰 二氢 5 氮尿嘧啶(DA DH T),环已酰胺,放线菌素 D,碱性孔雀绿等[20]。
其中病毒唑是广谱性抗病毒药物,早在20世纪70年代末和80年代初,国外一些科学家就将这种抗动物病毒的药物应用于植物,成功地脱去了马铃薯X 病毒、黄瓜花叶病毒和苜蓿花叶病毒等[21]。
化学治疗剂常常加到植株生长的培养基上,能提高培养基中去除病毒的能力,可以显著提高产生无病毒植株的百分率[21]。
目前采用病毒抑制剂与茎尖培养相结合的脱毒方法,可以较容易地脱除多种病毒,而且这种方法对取材要求不严,接种茎尖可大于1mm,易于分化出苗,提高存活率[22]。
谢嘉华等人的研究表明,三氮唑核苷对黄瓜花叶病毒、马铃薯X 病毒、烟草花叶病毒等多种病毒的增殖有抑制作用,用添加三氮唑核苷的培养基培养带毒植株一段时间(2~3个月)后,取萌发的顶芽移植到不含三氮唑核苷的培养基中继代培养,可增加产生无病毒后代植株的百分率[23]。
根据尚佑芬等人的报道,培养基未加药剂处 256 福建林业科技第34卷理的茎尖苗脱毒率为33 3%,添加1 5%TS 病毒钝化剂处理后脱毒率提高49 5%[24]。
一些植物生长激素如NAA 、BAP 对降低百合外植体中病毒浓度也有一定效果(Chavdarov 1995)。
也有将茎尖培养与热处理、化学药剂处理相结合来脱毒的,在MS 培养基上,附加5mg L -1病毒唑培养唐菖蒲,再经38~40 热处理,切取微茎尖2次,去除了危害唐菖蒲的3种主要病毒TM V 、CM V 和T VY [25]。
4 愈伤组织脱毒愈伤组织脱毒已获成功的有草莓、唐菖蒲、老鹳草等[26]。
愈伤组织脱毒的原理是愈伤组织的某些细胞不带病毒,这是由于病毒的复制速度赶不上细胞的增殖速度,或者是有些细胞通过突变获得了抗病毒的抗性。
方法是通过花卉各种器官或组织诱导产生愈伤组织,然后从愈伤组织再诱导分化产生芽,长成小植株,可以得到无病毒苗。
刘文萍等人用唐菖蒲花蕾进行离体培养,可脱除烟草花叶病毒,脱毒率为60%[27]。
枸杞的花药可以诱导出愈伤组织,从而脱毒[28]。
这种方法的缺陷是植株遗传性不稳定,可能会产生变异植株,并且一些植物的愈伤组织尚不能产生再生植株。
5 冷处理脱毒低温处理脱毒的原理目前还不清楚,这方面的报道也不多见。
菊花植株在5 条件下经4~5个月处理后,切取茎尖进行培养可除去菊花矮化病毒(CSV)和菊花褪绿斑驳病毒(CCMV)[18]。
从理论上来说可以利用超低温进行脱毒处理,其原理是易感病毒的大细胞内含水量大,在超低温处理的过程中易受冻害而死亡,而不含病毒的小茎尖容易成活,分化成芽,长成脱毒苗。
但是目前暂时还没有这方面的报道。
6 其他方法脱毒利用高浓度二氧化碳和高温短期处理的方法脱去病毒,在葡萄上已初见成效[29]。
微体嫁接的原理将0 1~0 2mm 的茎尖作为接穗,嫁接到由试管中培养出来的无菌实生砧木上,继续进行试管培养,愈合成为完整的植株,这在桃、柑橘、苹果等果树上已获得成功,并且有的已在生产上应用。
日本用柑桔茎尖微嫁接繁殖无病毒柑桔营养系,美国用此方法使苹果无病毒苗工厂化育苗,并在全国普遍开展。