第二代和第三代慢病毒包装系统

腺病毒包装系统是什么？腺病毒包装系统详细介绍

腺病毒包装系统是什么？腺病毒包装系统详细介绍目前根据需要已经开发三代腺病毒载体：E1区或者E1&E3缺失的载体被称作第一代腺病毒载体；E2区或者E2&E4缺失的载体被称作第二代腺病毒载体；依赖于辅助病毒的腺病毒载体（Helper-Dependent Ad，HD-Ad）通常也称作无偿腺病毒或者高容量载体被划分为第三代腺病毒载体。

经典的双质粒共转染法（同源重组）原理是同源重组。

在腺病毒左臂区域（通常缺失E1基因区）插入目的基因表达盒构成腺病毒穿梭质粒，与带有腺病毒全基因组（通常缺失E1基因区）的大质粒共同转染携带E1基因区的细胞如293细胞，两种质粒在293细胞内通过同源重组形成重组腺病毒基因组，并包装成病毒颗粒。

主要缺点是重组效率比较低。

AdEasyTM包装系统AdEasyTM包装系统主要的特点是利用Cre/loxP系统在大肠杆菌中完成外源基因插入腺病毒基因组的过程，获得环状的重组腺病毒基因组，并且具有在细菌中复制的必需元件。

将重组腺病毒基因组酶切线性化后转染293细胞，避免了双质粒共转染得到重组腺病毒。

由于获得重组腺病毒质粒有明显的筛选方法，操作步骤也比较好掌握，因此这个系统一出现就受到极大的欢迎。

使用这个系统需要注意以下问题：要用能表达RecA重组酶的特定的大肠杆菌，建议建立菌种库以免细菌发生变化；由于重组是在细菌中发生的，微小的基因组变化不易发现；要获得高品质的重组腺病毒毒种（高病毒产量、高目的基因表达）应挑选多个重组腺病毒质粒，分别转染293细胞，获得多个重组病毒来筛选。

AdMax包装系统AdMax包装系统是通过Cre/loxP获得重组病毒，这个过程发生在293细胞中，从而避免在细菌中重组。

将克隆了外源基因的腺病毒穿梭质粒与携带了腺病毒大部分基因组的包装质粒共转染293细胞，利用Cre/loxP系统的作用实现重组，产生重组腺病毒。

这个系统有多种优势，包括操作简便、重组效率高、获得的病毒产率高（一般大于104vp/cell）、目的基因的表达水平高（因为mCMV启动子比hCMV 启动子强若干倍）等。

慢病毒(过表达)包装步骤

慢病毒（过表达）包装步骤秦超1.转染复苏293T细胞,传2-3代进行转染，转染推荐使用合元公司的慢病毒转染试剂。

转染步骤：（以10cm培养皿为例）⑴最好在铺细胞后20h左右进行转染，控制转染前细胞密度70%—90%，保证细胞处于良好的状态,转染前一小时把一半培养基（约5ml）换成新的（含血清，因为此转染试剂不需换液）。

⑵加psin 10ug，pspax2 10ug，pmd2.g 5ug于800ul opti—mem，混匀⑶加40ul慢病毒转染试剂于800ul opti—mem，混匀，室温静置5min⑷将⑶所得的转染试剂稀释液滴加到⑵所得到的质粒稀释液中，边加边轻轻混匀，室温放置20min⑸取出细胞培养皿，将⑷得到的质粒转染试剂复合体加入到细胞培养基中，前后轻轻推摇使混合均匀，放回培养箱。

2.收毒(36—48h)收毒前如果质粒带有荧光标签可先看一下转染效率，一般达到60%即可.⑴将培养皿中的病毒上清液吸出到15cm离心管中，然后2000rpm离心10min,以沉淀细胞碎片。

⑵取上清用0.22um滤清过滤到浓缩管(用蛋白质浓缩管即可）中。

4000rpm离心至所需体积。

⑶浓缩完毕后，吸出浓缩后的病毒液,按每次的接毒量分装，-80℃冻存。

由于反复冻融会降低慢病毒滴度，因此避免反复冻融。

3.接毒接毒前12-20h铺细胞，使接毒时细胞密度约为40％—50%，务必使用生长状态良好的细胞。

将分装好的慢病毒滴加到细胞中，加polybrene使其终浓度为8ug/ml细胞密度60%—70%时可以再接毒一次。

4.检测及培养细胞系（48h)如果带有荧光标签可直接显微镜看一下感染效率，如需用药杀用puromycin杀三天（对照组完全杀死），剩下的即为基因整合进去的细胞。

如需培养成细胞系,可继续培养。

如果剩下的细胞较少可用高浓度血清，待细胞聚团时用胰酶消化一下，使细胞铺匀。

慢病毒包装原理-介绍【范本模板】

慢病毒包装系统简介及应用一、慢病毒包装简介及其用途慢病毒（ Lentivirus ）载体是以 HIV—1 （人类免疫缺陷 I 型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体.区别一般的逆转录病毒载体,它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。

慢病毒载体的研究发展得很快，研究的也非常深入。

该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。

在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞,从而达到良好的的基因治疗效果,在美国已经开展了临床研究，效果非常理想，因此具有广阔的应用前景。

目前慢病毒也被广泛地应用于表达 RNAi 的研究中。

由于有些类型细胞脂质体转染效果差，转移到细胞内的 siRNA 半衰期短,体外合成 siRNA 对基因表达的抑制作用通常是短暂的，因而使其应用受到较大的限制.采用事先在体外构建能够表达 siRNA 的载体，然后转移到细胞内转录 siRNA 的策略,不但使脂质体有效转染的细胞种类增加，而且对基因表达抑制效果也不逊色于体外合成 siRNA ,在长期稳定表达载体的细胞中,甚至可以发挥长期阻断基因表达的作用。

在所构建的 siRNA 表达载体中，是由 RNA 聚合酶Ⅲ启动子来指导 RNA 合成的,这是因为 RNA 聚合酶Ⅲ有明确的起始和终止序列，而且合成的 RNA 不会带 poly A 尾。

当RNA 聚合酶Ⅲ遇到连续 4 个或 5 个 T 时，它指导的转录就会停止，在转录产物 3' 端形成 1～4 个U 。

U6 和 H1 RNA 启动子是两种 RNA 聚合酶Ⅲ依赖的启动子，其特点是启动子自身元素均位于转录区的上游，适合于表达～ 21ntRNA 和～ 50ntRNA 茎环结构( stem loop ）。

在 siRNA 表达载体中，构成 siRNA 的正义与反义链，可由各自的启动子分别转录，然后两条链互补结合形成 siRNA ；也可由载体直接表达小发卡状 RNA（small hairpin RNA， shRNA），载体包含位于 RNA 聚合酶Ⅲ启动子和 4 ~ 5 T转录终止位点之间的茎环结构序列，转录后即可折叠成具有 1~4 个 U 3 ’突出端的茎环结构，在细胞内进一步加工成 siRNA 。

第三代慢病毒高效率包装系统的建立

崔奎青
陆凤花
石德顺 ”
广西大学动物繁殖研究所，宁，３０５南５００
摘要慢病毒介导法是最有前途的转基因动物生产方法之一，滴度慢病毒颗粒的包装是慢病毒转基因高动物技术的关键。本研究应用含有增强型绿色荧光蛋白基因（ＧＦ）ｅＰ的第３代慢病毒载体系统，用脂质体转染法将慢病毒系统４质粒共转染２３９Ｔ包装细胞，培养４～２ｈ收集病毒上清液，８７通过超速离心进行浓缩，用采
ｉｇｅｈｎｅｅｎｆｏｅｃｎｒｔｎｇｎ（ＧＰ，ｓｇｔｅｉｏｅｔｎ００ｍｅｉｅａｓｃｏｔｏ．ｎａｃｄｒｅｕｒｓｅｔｏｅｅｅｅＦ）ｕｉｐｆａｅ０ｄａｄｔｎｆｔｎｍｅｄｎｇｌｐｉｎｈＬｃｍｉ２ｔｒｅｉｈ
Ｖｉｓｓｐｒａｅｗａｏｌｃｅｆｅ８７ｏｒ，ｎｈｎｃｎｅｔａｅｙｕｔｃｎｒｆｇ．ａｇ－ｃｌｅｌｉｒｕｅｎｔｓｃｌｔｄａｒ４－２ｈｕｓａｄｔｅｏｃｎｒｔｄｂｌａｅｔｉｅＬｒｅｓａｅｒａ — ｍｅｕｅｔｒｕｔ
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第二代和第三代慢病毒包装系统定稿版

第二代和第三代慢病毒包装系统精编W O R D版IBM system office room 【A0816H-A0912AAAHH-GX8Q8-GNTHHJ8】第二代和第三代慢病毒包装系统将HIV-1 基因组中的顺式作用元件(如包装信号、长末端重复序列) 和编码反式作用蛋白的序列进行分离。

载体系统包括包装成分和载体成分：包装成分由 HIV-1 基因组去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列而构建，能反式提供产生病毒颗粒所需的蛋白；载体成分与包装成分互补，含有包装、逆转录和整合所需的 HIV-1顺式作用序列。

同时具有异源启动子控制下的多克隆位点及在此位点插入的目的基因。

第一代包装系统中，除vpu之外的辅助基因都被保留下来，Env包膜蛋白由VSV-G蛋白代替，应用 VSV-G 包膜的假构型慢病毒载体扩大了载体的靶细胞嗜性范围，而且增加了载体的稳定性。

3质粒系统，包括包装质粒、包膜蛋白质粒和转移质粒。

其中包装质粒在 CMV 启动子的控制下，表达 HIV 21 复制所需的全部反式激活蛋白，但不产生病毒包膜蛋白及辅助蛋白vpu；包膜蛋白质粒编码水泡性口炎病毒G蛋白 (VSV 2G)，应用 VSV 2G 包膜的假构型慢病毒载体扩大了载体的靶细胞嗜性范围，而且增加了载体的稳定性，允许通过高速离心对载体进行浓缩，提高了滴度；转移质粒中除含有包装、逆转录及整合所需的顺式序列，还保留 350 bp 的 gag 和 RRE，并在其中插入目的基因或标志基因( 绿色荧光蛋白 GFP) 。

在第二代系统中辅助基因vif、vpr、nef被进一步剔除，这些辅助基因的去除并不影响病毒的滴度和感染能力，同时增加了载体的安全性。

第二代系统中5’LTR 634bp，3' LTR 634bp，5’LTR前不需要强启动子。

4质粒系统。

第三代系统中，tat调节基因也被剔除，对5’LTR进行了改造，换上了异源启动子，从而不需依赖tat基因（Tat 基因编码蛋白可与LTR结合，增加病毒所有基因转录率）；构建自身失活的慢病毒载体（SIN），即删除了U3区的3’LTR, 使载体失去HIV-1增强子及启动子序列，即使存在所有的病毒蛋白也不能转录出RNA；一些增强包装病毒滴度的元件被加入，如cPPT、WPRE。

慢病毒包装技术和应用

慢病毒包装技术和应用慢病毒载体（lentivirus vector，LV）是实验室常用的病毒包装载体，在基因转染方面具有很多特有的优势，可以转染分裂期和非分裂期的细胞，基因转染效率高，可以导入较大基因片段等。

目前被广泛用于RNAi的研究，为基因功能研究和特定基因表达调节提供了可能性。

另外，慢病毒包装在临床中可作为基因治疗载体发挥重要作用。

慢病毒载体慢病毒属于反转录病毒的一种。

慢病毒载体是在人类免疫缺陷型病毒（HIV-1）基础上构建的载体。

HIV-1包含3个结构基因gag、env和pol，2个调控基因rev、tat，以及4个辅助基因vif、vpr、vpu和nef。

图1. HIV-1的基因结构。

为了提高生物安全性，慢病毒载体的建立经历了四个阶段：1、第一代质粒系统。

去除HIV基因组中的反式作用蛋白基因序列，包装上含有目标基因的重组载体和能为反式提供病毒颗粒所需蛋白的包装质粒，共转染包装细胞。

2、第二代的三质粒系统。

将HIV基因组中的顺式作用序列结构和编码反式作用蛋白的序列去除，分别克隆到独立的质粒中。

三个质粒包括包装质粒（含有CMV启动子）、包膜质粒（含有VSV-G基因，替代env基因，可提高宿主范围）和载体质粒（含有目标基因）。

图2. 第二代慢病毒质粒。

3、第三代三质粒系统。

为了提高安全系数，在第二代的基础上去除了HIV所有辅助基因序列，只保留了gag、pol和rev基因。

4、第四代四质粒系统。

在第三代质粒的基础上，将env基因独立克隆到一个质粒上，另外，除去tat基因。

四个质粒包括pGag/Pol，pRev，pVSV-G，和包含目的基因的载体。

图3. 第三代和第四代慢病毒质粒。

其他病毒载体除了慢病毒载体，常见的，还有腺病毒，腺相关病毒（AAV）等。

腺病毒载体是瞬时表达的首选载体，基因转染效率高，安全性高，缺点是不能整合到宿主细胞基因组，包装周期长，约6-8周。

腺相关病毒安全性高、免疫原性低、具有明显组织嗜性等特点，因此非常适合临床基因治疗，缺点是包装周期较长，约6-8周。

慢病毒包装

慢病毒包装慢病毒是逆转录病毒的一种，它需要相对较长的孵育时间，所以称之为“慢”病毒，Lenti在拉丁文中就是慢的意思。

它包括人免疫缺陷病毒、猫免疫缺陷病毒、猿免疫缺陷病毒、牛免疫缺陷病毒等。

其中研究最多的是HIV-1慢病毒。

慢病毒载体是以慢病毒基因组为基础，所需的目的基因取代部分基因构建而成。

目前使用的慢病毒载体多采用HIV-1基因组改造而来。

与一般的逆转录病毒载体相比，慢病毒载体对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力而具有更广的宿主范围。

慢病毒载体还可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而实现持久表达。

在感染能力方面可以有效感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，又很少引发机体免疫反应，能达到良好的基因治疗效果，具有广阔的应用前景。

随着人们对慢病毒载体的深入研究，为了提高慢病毒在临床上使用的安全性，慢病毒载体的优化也在不断的探讨中。

慢病毒载体的发展经历了三个阶段，第一代慢病毒载体系统是以三质粒系统为代表，在构建时把HIV-1基因组中进行包装、逆转录和整合所需的顺式作用原件与编码反式作用蛋白的序列分离，分别构建在三个质粒表达系统上，即包装质粒、包膜质粒和载体质粒。

包装质粒在巨细胞病毒启动子的作用下，控制除env以外所有病毒结构基因的表达；包膜质粒编码水泡口炎病毒G糖蛋白；载体质粒中含有目的基因。

用这三种质粒共转染包装细胞如人胚胎肾293T细胞，在细胞上清中即可收获只有一次感染能力、而无复制能力的慢病毒颗粒。

第一代慢病毒载体系统的特点是在构建三种包装质粒时，为了降低产生有复制能力的病毒的可能性，尽可能减少三种质粒之间的同源序列，但包装质粒中仍然保留HIV的附属基因。

第二代慢病毒载体系统是在第一代的基础上进行改进，在包装质粒中删除了HIV的所有附属基因。

这些附属基因的去除并不影响病毒的滴度和感染能力，同时增加了载体的安全性。

第三代慢病毒载体系统又增加了两个安全特性：一是构建自身失活的慢病毒载体，即删除了U3区的3′LTR, 使载体失去HIV-1增强子及启动子序列，即使存在所有的病毒蛋白也不能转录出RNA；二是去除了tat基因，用异源启动子序列代替，这样原始的HIV基因组中的9个慢病毒载体中只保留了3个。

第三代慢病毒高效率包装系统的建立

基因组学与应用生物学，2009年，第28卷，第2期，第326－330页Genomics and Applied Biology,2009,Vol.28,No.2,326－330实验技术与方法Techniques and Methodology第三代慢病毒高效率包装系统的建立张磊*刘庆友*胡天张晓溪崔奎青陆凤花石德顺**广西大学动物繁殖研究所,南宁,530005*同等贡献作者**通讯作者,ardsshi@摘要慢病毒介导法是最有前途的转基因动物生产方法之一，高滴度慢病毒颗粒的包装是慢病毒转基因动物技术的关键。

本研究应用含有增强型绿色荧光蛋白基因(eGFP)的第3代慢病毒载体系统，用脂质体转染法将慢病毒系统4质粒共转染293T 包装细胞，培养48~72h 收集病毒上清液，通过超速离心进行浓缩，采用批量快速测定法(LaSRT)测定病毒滴度。

结果显示，用脂质体转染法包装的慢病毒能成功地感染293T 细胞，经检测病毒滴度达到5×108IU/mL 以上，初步建成了高滴度慢病毒包装平台，为慢病毒介导制作转基因动物奠定了良好的研究基础。

关键词慢病毒,病毒包装,转基因动物The Construction of High-efficiency Packaging System of the 3rd LentivirusZhang Lei *Liu Qingyou *Hu Tian Zhang Xiaoxi Cui Kuiqing Lu FenghuaShi Deshun **Animal Reproduction Institute,Guangxi University,Nanning,530005*The authors who contribute equally **Corresponding author,ardsshi@ DOI ：10.3969/gab.028.000326Abstract Lentivirus-mediated method is one of the most promising methods of producing transgenic animals,high-titer lentiviral particles packaging is the key of lentivirus-mediated transgenic animal technology.In this study,293T cells were co-transfected with four plasmids,which are the 3rd generation of lentiviral vector systems contain-ing enhanced green fluorescent protein gene (eGFP),using the Lipofectamine 2000mediated transfection method.Virus supernate was collected after 48~72hours,and then concentrated by rge-scale real-time titration (LaSRT)was applied to test the titer of virus.The results showed that 293T cells could be successfully in-fected by the virus packaged using Lipofectamine-mediated transfection,as evidenced of that the virus titer reached higher than 5×108IU/mL,indicating that a high-titer lentiviral packaging platform was preliminary estabilished.This result will be beneficial for the further study of producing transgenic animal by lentivirus-mediated method.Keywords Lentivirus,Virus packageing,Transgenic animals /doi/10.3969/gab.028.000326基金项目：本研究由国家863计划(2007AA100505),广西青年科学基金(桂科青0991002)和广西亚热带生物资源保护利用重点实验室开放课题(SB0702)资助慢病毒(lentivirus)属于逆转录病毒科(Retrovi-dae)，为RNA 病毒，包括人免疫缺陷病毒(HIV )和猴免疫缺陷病毒(SIV )等。

慢病毒包装原理-介绍之欧阳育创编

慢病毒包装系统简介及应用一、慢病毒包装简介及其用途慢病毒（ Lentivirus ）载体是以 HIV-1 （人类免疫缺陷 I 型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。

区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。

慢病毒载体的研究发展得很快，研究的也非常深入。

该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。

在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果，在美国已经开展了临床研究，效果非常理想，因此具有广阔的应用前景。

目前慢病毒也被广泛地应用于表达 RNAi 的研究中。

由于有些类型细胞脂质体转染效果差，转移到细胞内的 siRNA 半衰期短，体外合成 siRNA 对基因表达的抑制作用通常是短暂的，因而使其应用受到较大的限制。

采用事先在体外构建能够表达siRNA 的载体，然后转移到细胞内转录 siRNA 的策略，不但使脂质体有效转染的细胞种类增加，而且对基因表达抑制效果也不逊色于体外合成 siRNA ，在长期稳定表达载体的细胞中，甚至可以发挥长期阻断基因表达的作用。

在所构建的 siRNA 表达载体中，是由 RNA 聚合酶Ⅲ启动子来指导 RNA 合成的，这是因为 RNA 聚合酶Ⅲ有明确的起始和终止序列，而且合成的 RNA 不会带 poly A 尾。

当 RNA 聚合酶Ⅲ遇到连续 4 个或 5 个 T 时，它指导的转录就会停止，在转录产物 3' 端形成 1~4 个U 。

U6 和 H1 RNA 启动子是两种 RNA 聚合酶Ⅲ依赖的启动子，其特点是启动子自身元素均位于转录区的上游，适合于表达～ 21ntRNA 和～ 50ntRNA 茎环结构（ stem loop ）。

在siRNA 表达载体中，构成 siRNA 的正义与反义链，可由各自的启动子分别转录，然后两条链互补结合形成 siRNA ；也可由载体直接表达小发卡状 RNA(small hairpin RNA, shRNA)，载体包含位于 RNA 聚合酶Ⅲ启动子和 4 ～ 5 T转录终止位点之间的茎环结构序列，转录后即可折叠成具有 1~4 个 U 3 ' 突出端的茎环结构，在细胞内进一步加工成 siRNA 。

慢病毒包装原理介绍

慢病毒包装系统简介及应用一、慢病毒包装简介及其用途慢病毒 Lentivirus 载体是以 HIV-1 人类免疫缺陷 I 型病毒为基础发展起来的基因治疗载体;区别一般的逆转录病毒载体,它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力;慢病毒载体的研究发展得很快,研究的也非常深入;该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上,从而达到持久性表达;在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞,从而达到良好的的基因治疗效果,在美国已经开展了临床研究,效果非常理想,因此具有广阔的应用前景;目前慢病毒也被广泛地应用于表达 RNAi 的研究中;由于有些类型细胞脂质体转染效果差,转移到细胞内的 siRNA 半衰期短,体外合成 siRNA 对基因表达的抑制作用通常是短暂的,因而使其应用受到较大的限制;采用事先在体外构建能够表达 siRNA 的载体,然后转移到细胞内转录 siRNA 的策略,不但使脂质体有效转染的细胞种类增加,而且对基因表达抑制效果也不逊色于体外合成 siRNA ,在长期稳定表达载体的细胞中,甚至可以发挥长期阻断基因表达的作用;在所构建的 siRNA 表达载体中,是由 RNA 聚合酶Ⅲ启动子来指导 RNA 合成的,这是因为 RNA 聚合酶Ⅲ有明确的起始和终止序列,而且合成的 RNA 不会带 poly A 尾;当 RNA 聚合酶Ⅲ遇到连续 4 个或 5 个 T 时,它指导的转录就会停止,在转录产物 3' 端形成 1~4 个U ; U6 和 H1 RNA 启动子是两种 RNA 聚合酶Ⅲ依赖的启动子,其特点是启动子自身元素均位于转录区的上游,适合于表达～ 21ntRNA 和～ 50ntRNA 茎环结构 stem loop ;在 siRNA 表达载体中,构成 siRNA 的正义与反义链,可由各自的启动子分别转录,然后两条链互补结合形成 siRNA ；也可由载体直接表达小发卡状 RNAsmall hairpin RNA, shRNA,载体包含位于RNA 聚合酶Ⅲ启动子和 4 ～ 5 T转录终止位点之间的茎环结构序列,转录后即可折叠成具有 1~4 个U 3 ' 突出端的茎环结构,在细胞内进一步加工成 siRNA ;构建载体前通常要通过合成 siRNA 的方法,寻找高效的 siRNA ,然后从中挑选符合载体要求的序列,将其引入 siRNA 表达载体;慢病毒载体 Lentiviral vector 较逆转录病毒载体有更广的宿主范围,慢病毒能够有效感染非周期性和有丝分裂后的细胞;慢病毒载体能够产生表达 shRNA 的高滴度的慢病毒,在周期性和非周期性细胞、干细胞、受精卵以及分化的后代细胞中表达 shRNA ,实现在多种类型的细胞和转基因小鼠中特异而稳定的基因表达的功能性沉默,为在原代的人和动物细胞组织中快速而高效地研究基因功能,以及产生特定基因表达降低的动物提供了可能性;慢病毒表达载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息;慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装 RNA 到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白;为产生高滴度的病毒颗粒,需要利用表达载体和包装质粒同时共转染细胞,在细胞中进行病毒的包装,包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中,离心取得上清液后,可以直接用于宿主细胞的感染,目的基因进入到宿主细胞之后,经过反转录,整合到基因组,从而高水平的表达效应分子;二、这一系统的目的,主要是为了解决以下问题：1. 对于一些较难转染的细胞,如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等,能大大提高目的基因转导效率,而且目的基因整合到宿主细胞基因组的几率大大增加,这就为 RNAi,cDNA 克隆以及报告基因的研究提供了一个有利的途径;2. 进行稳转细胞株的筛选；3. 为活体动物模型实验提供高质量的包含目的基因的病毒液；在细胞相关的实验操作中,对于一些按常规方法难以转染甚至无法转染的细胞,通过病毒介导的实验能够大大提高基因的转导效率,以达到目的基因的高效瞬时表达;三、慢病毒载体介绍慢病毒载体 Lentiviral vector, LVs 是在 HIV-1 病毒基础上改造而成的病毒载体系统,它能高效的将目的基因或 RNAi 导入动物和人的原代细胞或细胞系;慢病毒载体基因组是正链 RNA ,其基因组进入细胞后,在细胞浆中被其自身携带的反转录酶反转为 DNA ,形成 DNA 整合前复合体,进入细胞核后, DNA 整合到细胞基因组中;整合后的 DNA 转录 mRNA ,回到细胞浆中,表达目的蛋白；或产生 RNAi 干扰;慢病毒载体介导的基因表达或 RNAi 干扰作用持续且稳定,原因是目的基因整合到宿主细胞基因组中,并随细胞基因组的分裂而分裂;另外,慢病毒载体能有效感染并整合到非分裂细胞中;以上特性使慢病毒载体与其它病毒载体相比,比如不整合的腺病毒载体、整合率低的腺相关病毒载体、只整合分裂细胞的传统逆转录病毒载体,有鲜明的特色;大量文献研究表明,慢病毒载体介导的目的基因长期表达的组织或细胞包括脑、肝脏、肌肉、视网膜、造血干细胞、骨髓间充质干细胞、巨噬细胞等;慢病毒载体不表达任何 HIV-1 蛋白,免疫原性低,在注射部位无细胞免疫反应,体液免疫反应也较低,不影响病毒载体的第 2 次注射;四、慢病毒载体的构建1. 构建原理慢病毒属于逆转录病毒科,但其基因组结构复杂,除 gag、pol 和 env 这 3 个和单纯逆转录病毒相似的结构基因外,还包括 4 个辅助基因,vif、vpr、nef、vpu 和 2 个调节基因 tat 和 rev ; HIV 21 是慢病毒中最具特征性的病毒,第一个慢病毒载体系统即以此病毒为基础进行构建的;慢病毒载体的构建原理就是将 HIV 21 基因组中的顺式作用元件如包装信号、长末端重复序列和编码反式作用蛋白的序列进行分离;载体系统包括包装成分和载体成分：包装成分由 HIV 21 基因组去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列而构建,能反式提供产生病毒颗粒所需的蛋白；载体成分与包装成分互补,含有包装、逆转录和整合所需的 HIV 21顺式作用序列;同时具有异源启动子控制下的多克隆位点及在此位点插入的目的基因;为降低两种成分同源重组产生有复制能力的病毒 RCV 的可能性,将包装成分的 5 ′ LTR 换成巨细胞病毒 CMV 立即早期启动子,3 ′ LTR 换成 SV 40 polyA 位点等;将包装成分分别构建在两个质粒上,即一个表达 gag 和 pol、另一个表达 env ;根据这个原理,Naldini 和 Kafri 等构建了三质粒表达系统;2. 三质粒表达系统三质粒表达系统包括包装质粒、包膜蛋白质粒和转移质粒;其中包装质粒在 CMV 启动子的控制下,表达 HIV 21 复制所需的全部反式激活蛋白,但不产生病毒包膜蛋白及辅助蛋白 vpu；包膜蛋白质粒编码水泡性口炎病毒 G 蛋白 V SV 2G,应用 VSV 2G 包膜的假构型慢病毒载体扩大了载体的靶细胞嗜性范围,而且增加了载体的稳定性,允许通过高速离心对载体进行浓缩,提高了滴度；转移质粒中除含有包装、逆转录及整合所需的顺式序列,还保留 350 bp 的 gag 和 RRE,并在其中插入目的基因或标志基因绿色荧光蛋白 GFP ;将载体系统分成三个质粒最大的益处是使序列重叠的机会大大减少,减少载体重组过程中产生 RCV 的可能性;通过三质粒共转染 293T 细胞,超速离心后病毒滴度可达 109IU /m l ;3. 四质粒表达系统为了减少 HIV 21 包装结构的序列同源性,进一步减少重组成 RCV 的可能性,Dull 等人将辅助基因去除;但由于 gag2pol 的转运需要 rev,因此,在上述的三质粒系统的基础上,构建成四质粒表达系统,该系统加上含 rev 的质粒减少了产生 RCV 的可能性,而且对非分裂期细胞转导效率无影响;五、慢病毒载体应用1. 将目的基因 /RNAi 基因转入难以转染的细胞,比如神经元细胞、干细胞或其它原代细胞；2. 将目的基因 /RNAi 基因转入动物组织,以期获得长期表达；3. 构建稳定表达目的蛋白 /RNAi 的细胞系,再用exvivo的方法导入动物体内；4. 基因治疗；5. 转基因动物；6. 基因敲除；7. 药物研究：构建表达受体蛋白的细胞系,研究药物的作用；8. 快速建立生产目的蛋白的细胞系,非常有前途的真核细胞表达方法;。

慢病毒包装总结

慢病毒包装总结慢病毒的成分现在的慢病毒包装系统通常包括几个质粒，这几个质粒上分别含有慢病毒复制的成分，这样做的目的就是为了增加安全性，毕竟如果只用一个成分的话，危险系数很高，人一旦接触这种病毒就有可能遇到危险。

而把这几个成分分散在几个质粒中，很难在体外形成危险的病毒颗粒。

第二代慢病毒包装系统含有3个质粒，第3代慢病毒包装系统含有4个质粒。

这两代病毒包装系统都含有以下相同的成分：第一，编码目的蛋白或转录目的基因的转移质粒。

其实就是你自己的目的质粒，也就是通常需要自己做载体的质粒。

目的基因的两侧都含有长末端重复序列（LTR，long terminal repeat），LTR的作用就是辅助目的基因插入到宿主细胞的基因组。

许多慢病毒质粒都是基于HIV-1病毒改造的。

为了安全目的，这些目的质粒的复能能力并不完全，它们的3'LTR有所删减，这样病毒插入到基因组后会自我失活（self-inactivating）（SIN）。

第二，包装质粒，毒包装的结构蛋白编码质粒。

第三，包膜质粒，编码蛋白质外壳。

第二代慢病毒利用病毒的LTR启动子用于基因的表达，第三代慢病毒利用一个杂合的LTR启动子进行基因表达。

第二代慢病毒下图是第二代慢病毒系统：这个系统含有3个质粒，第1个质粒：包装质粒，它编码Gag，PoI，Rev与Tat基因。

第2个质粒：包膜质粒，含有VSV-G，编码蛋白Env。

第3个质粒：目的质粒，含有病毒的LTRs和psi包装信号（图片未画出），除非有内部启动子，否则这个目的质粒的目的基因是由5'LTR驱动的，它是一个弱启动子，需要Tat元件的来激活它。

所有的第2代慢病毒目的质粒必须要用第2代慢病毒包装系统，因此它的LTR是Tat依赖性的。

第三代慢病毒第3代慢病毒如下所示：设计第3代病毒的目的主要还是提高安全性。

在第3代病毒中，将第2代病毒的包装质粒分成了2个质粒，一个编码Rev，另外一个编码Gag和PoI。

【资源】自己整理的慢病毒质粒的知识

【资源】自己整理的慢病毒质粒的知识慢病毒——基因转移的潜在新载体用于基因治疗的载体系统可分为病毒性载体和非病毒性载体两类。

目前常用的病毒载体包括逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、疱疹病毒载体、痘苗病毒载体等,但是这些载体均存在不足之处,严重影响了基因治疗的有效性及安全性。

在基因治疗中广泛应用的逆转录病毒载体存在的主要问题,是无法高效转导非分裂期细胞,而腺病毒载体虽然能转导非分裂期细胞,但在体内不能实现目的基因稳定的长期表达,且反复应用容易引起免疫反应。

慢病毒载体不但可以感染非分裂期细胞,还具有容纳外源性目的基因片段大、免疫反应小等优点,在基因治疗中具有广泛的应用前景。

现以HIV-1 为例,就慢病毒载体的生物学特征、慢病毒载体的构建、在基因治疗中的应用以及生物安全性等方面作一综述。

一、慢病毒载体的生物学特征慢病毒包括灵长类慢病毒,如人类免疫缺陷病毒(HIV) 和猴免疫缺陷病毒(SIV) ,以及非灵长类慢病毒如猫免疫缺陷病毒( FIV) 、马传染性贫血病毒(EIAV) 、牛免疫缺陷病毒(BIV) 和维斯纳-梅迪病毒(VMV)等。

目前,HIV-1、HIV-2、SIV、FIV 及EIAV被广泛研究用作基因治疗的载体,而其中又以HIV-1最为热门。

1.1 HIV-1 病毒形态与结构成熟的HIV-1 病毒直径100～120nm、呈20 面体对称结构、球形,电镜下可见一致密圆锥状核心,内有病毒RNA 分子和酶,后者包括逆转录酶、整合酶(integrase) 和蛋白酶(protease)。

HIV-1的最外层为脂蛋白包膜,膜上有表面蛋白(gp120) 和相嵌蛋白(gp41) 两种糖蛋白,gp120为刺突,gp41为跨膜蛋白。

包膜内面为P17 构成的基质蛋白(matrix) ,包膜内为衣壳蛋白(P24)包裹的RNA。

1.2 HIV-1 病毒基因组结构及其功能特征HIV-1 的基因组由两条相同的正股RNA 链在5′端通过部分碱基互补配对而成二聚体。

细胞治疗产品CDE问答来了！CDE刚刚发布《细胞治疗产品申报临床试验药学研究问题与解答（第一期）》

细胞治疗产品CDE问答来了！CDE刚刚发布《细胞治疗产品申报临床试验药学研究问题与解答（第一期）》近年来，按照药品进行研发并申报临床试验的细胞治疗产品大量涌现。

细胞治疗产品来源多样，生物学特性复杂，对生产过程要求高，其研发技术与评价体系仍处于不断发展阶段。

国家药品监督管理局于2017年发布了《细胞治疗产品研究与评价技术指导原则》及相关问题解读，在该指导原则及问题解读的基础上，药品审评中心结合近期细胞治疗产品IND申报资料审评和沟通交流过程中出现的共性问题，提出以下建议供申请人参考。

由于细胞治疗产品技术发展迅速，随着相关领域技术的进步和审评认知的积累，对该类产品的技术要求也将会不断更新、充实和完善。

1、细胞治疗产品临床试验用样品的生产环境是什么要求？如何进行过程控制？答复：人体临床试验用病毒、细胞均需在符合药品GMP条件下生产。

生产中使用的质粒视具体使用情况具体分析，如果质粒是直接用于人体细胞体外基因编辑操作的载体，建议在GMP条件下生产。

请申请人结合国内现行GMP的要求，同时可参考国外针对细胞治疗产品的GMP要求来进行生产过程的控制。

细胞治疗产品无法耐受病毒灭活工艺的操作处置，也无法进行终端灭菌或除菌过滤，因此对于这类产品的生产过程控制尤为重要。

生产过程中应在适当的生产环节，设立生产过程控制的检测项目和验收标准，以确保产品生产过程得到监控，并且保证不同批次间质量控制的一致性。

另外，还应结合生产工艺、生产设备、操作与管理规范等，制定防控不同批次产品的混淆、污染及交叉污染的措施，并确保生产全过程（包括从组织/细胞采集过程、生产、运输到临床应用整个过程）的可追溯性。

2、细胞治疗产品细胞培养过程中是否可以使用动物血清或人血清？答复：细胞治疗产品生产过程中，应尽量避免使用动物和人来源的血清，如必须使用，申请人应提供充分的研究资料，说明在细胞培养过程中使用血清的必要性。

在确需使用血清的前体下，还需提供所使用的血清种类的选择依据、使用量的合理性、明确血清的来源和质量标准，建立质量控制体系、对残留量进行检测并开展安全性风险评估。

慢病毒包装原理-介绍PDF.pdf

慢病毒包装系统简介及应用一、慢病毒包装简介及其用途慢病毒（ Lentivirus ）载体是以 HIV-1 （人类免疫缺陷 I 型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。

区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。

慢病毒载体的研究发展得很快，研究的也非常深入。

该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。

在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果，在美国已经开展了临床研究，效果非常理想，因此具有广阔的应用前景。

目前慢病毒也被广泛地应用于表达 RNAi 的研究中。

由于有些类型细胞脂质体转染效果差，转移到细胞内的 siRNA 半衰期短，体外合成 siRNA 对基因表达的抑制作用通常是短暂的，因而使其应用受到较大的限制。

采用事先在体外构建能够表达 siRNA 的载体，然后转移到细胞内转录 siRNA 的策略，不但使脂质体有效转染的细胞种类增加，而且对基因表达抑制效果也不逊色于体外合成 siRNA ，在长期稳定表达载体的细胞中，甚至可以发挥长期阻断基因表达的作用。

在所构建的 siRNA 表达载体中，是由 RNA 聚合酶Ⅲ启动子来指导 RNA 合成的，这是因为 RNA 聚合酶Ⅲ有明确的起始和终止序列，而且合成的 RNA 不会带 poly A 尾。

当 RNA 聚合酶Ⅲ遇到连续 4 个或 5 个 T 时，它指导的转录就会停止，在转录产物 3' 端形成 1~4 个U 。

U6 和 H1 RNA 启动子是两种 RNA 聚合酶Ⅲ依赖的启动子，其特点是启动子自身元素均位于转录区的上游，适合于表达～ 21ntRNA 和～ 50ntRNA 茎环结构（ stem loop ）。

在 siRNA 表达载体中，构成 siRNA 的正义与反义链，可由各自的启动子分别转录，然后两条链互补结合形成 siRNA ；也可由载体直接表达小发卡状 RNA(small hairpin RNA, shRNA)，载体包含位于 RNA 聚合酶Ⅲ启动子和 4 ～ 5 T转录终止位点之间的茎环结构序列，转录后即可折叠成具有 1~4 个 U 3 ' 突出端的茎环结构，在细胞内进一步加工成 siRNA 。

第三代慢病毒高效率包装系统的建立_张磊

基因组学与应用生物学，2009年，第28卷，第2期，第326－330页Genomics and Applied Biology,2009,Vol.28,No.2,326－330实验技术与方法Techniques and Methodology第三代慢病毒高效率包装系统的建立张磊*刘庆友*胡天张晓溪崔奎青陆凤花石德顺**广西大学动物繁殖研究所,南宁,530005*同等贡献作者**通讯作者,ardsshi@摘要慢病毒介导法是最有前途的转基因动物生产方法之一，高滴度慢病毒颗粒的包装是慢病毒转基因动物技术的关键。

本研究应用含有增强型绿色荧光蛋白基因(eGFP)的第3代慢病毒载体系统，用脂质体转染法将慢病毒系统4质粒共转染293T 包装细胞，培养48~72h 收集病毒上清液，通过超速离心进行浓缩，采用批量快速测定法(LaSRT)测定病毒滴度。

结果显示，用脂质体转染法包装的慢病毒能成功地感染293T 细胞，经检测病毒滴度达到5×108IU/mL 以上，初步建成了高滴度慢病毒包装平台，为慢病毒介导制作转基因动物奠定了良好的研究基础。

关键词慢病毒,病毒包装,转基因动物The Construction of High-efficiency Packaging System of the 3rd LentivirusZhang Lei *Liu Qingyou *Hu Tian Zhang Xiaoxi Cui Kuiqing Lu FenghuaShi Deshun **Animal Reproduction Institute,Guangxi University,Nanning,530005*The authors who contribute equally **Corresponding author,ardsshi@ DOI ：10.3969/gab.028.000326Abstract Lentivirus-mediated method is one of the most promising methods of producing transgenic animals,high-titer lentiviral particles packaging is the key of lentivirus-mediated transgenic animal technology.In this study,293T cells were co-transfected with four plasmids,which are the 3rd generation of lentiviral vector systems contain-ing enhanced green fluorescent protein gene (eGFP),using the Lipofectamine 2000mediated transfection method.Virus supernate was collected after 48~72hours,and then concentrated by rge-scale real-time titration (LaSRT)was applied to test the titer of virus.The results showed that 293T cells could be successfully in-fected by the virus packaged using Lipofectamine-mediated transfection,as evidenced of that the virus titer reached higher than 5×108IU/mL,indicating that a high-titer lentiviral packaging platform was preliminary estabilished.This result will be beneficial for the further study of producing transgenic animal by lentivirus-mediated method.Keywords Lentivirus,Virus packageing,Transgenic animals /doi/10.3969/gab.028.000326基金项目：本研究由国家863计划(2007AA100505),广西青年科学基金(桂科青0991002)和广西亚热带生物资源保护利用重点实验室开放课题(SB0702)资助慢病毒(lentivirus)属于逆转录病毒科(Retrovi-dae)，为RNA 病毒，包括人免疫缺陷病毒(HIV )和猴免疫缺陷病毒(SIV )等。

慢病毒载体的世代

慢病毒载体的世代使用慢病毒载体进行基因转移也不能免除风险，因为病毒基因组材料可以整合到宿主DNA中。

这可以通过导致这些基因的抑制或过度表达和插入突变来干扰宿主细胞基因的功能。

随着技术的进步和生物安全风险的发现，设计了具有增强安全功能的新一代慢病毒载体。

这些代在接下来分别描述，理解为“代越高，载体越安全”。

在所有三代中，包膜基因通常是异源的，即来自不同的病毒，例如VSV-G（不是HIV基因）。

第一代：包括一个包装系统，除了包含在另一个载体中的env基因（通常是异源的）之外，所有的HIV基因都包含在包装系统中。

第二代：研究人员发现，在永生化细胞系中，HIV复制不需要4种HIV辅助基因—vif、vpr、vpu和nef—。

这导致了第二代载体的工程化。

在该系统中，去除了4个辅助基因，留下了gag和pol阅读框以及tat和rev基因。

一般来说，具有野生型5'LTR的慢病毒载体需要第二代包装系统，因为它们需要tat激活。

第三代/自灭活(SIN)：在第三代载体中，3'LTR被修改，tat被剔除，rev在单独的质粒中提供。

由于5'LTR中的HIV启动子依赖于tat，因此没有tat的载体需要将其野生型启动子替换为异源增强子/启动子以确保转录。

这种启动子可以是病毒（如CMV）或细胞（如EF1-α）。

慢病毒载体世代汇总表*形成RCL的风险不仅存在于慢病毒载体生产过程中，而且存在于涉及感染野生型HIV的材料的实验中。

慢病毒载体与HIV之间的重组可导致产生安全性未知结果的新病毒。

出于这个原因，涉及未经HIV 筛查的人体材料的实验对实验室工作人员构成了更大的风险。

慢病毒载体包装二代与三代的区别

慢病毒载体包装二代与三代的区别慢病毒载体包装慢病毒载体（Lentivirus vectors）的特性：在非分裂和分裂细胞中稳定整合、转基因的长期表达、低免疫原性，使其成为基因治疗的理想基因转移载体。

转基因可以在非分裂或终末分化的非常静止的细胞（例如神经元）中实现。

我们的慢病毒载体来源于HIV-1病毒，序列经过精心优化，提高了生物安全性、基因表达水平和病毒转导效率。

慢病毒颗粒通常是在包装细胞中共表达病毒体包装元件和载体基因组来产生的。

我们开发出了一系列专有技术和试剂，从病毒滴度、纯度、活性以及一致性等方面提升了慢病毒包装工艺水平。

慢病毒类型VSV-G假病毒化的第三代慢病毒（默认）VSV-G假病毒化的第二代慢病毒使用其他膜蛋白进行假病毒化的慢病毒（如使用冠状病毒刺突蛋白）无膜蛋白的表面光秃的慢病毒（可用于转导时的阴性对照）注意：第三代慢病毒包装系统只能包装第三代的慢病毒转移载体。

但是第二代慢病毒包装系统既能包装第二代，也能包装第三代的慢病毒转移载体。

第三代慢病毒转移载体上的5’ LTR中的U3元件是被一个外源启动子替代（如CMV启动子或者RSV启动子），使其不依赖Tat蛋白进行HIV RNA基因组的转录，故第三代慢病毒包装系统的包装质粒不含Tat蛋白。

第二代慢病毒转移载体上的5’ LTR是野生型的LTR，含有U3、R和U5元件，依赖T at蛋白转录HIV RNA基因组，故第二代慢病毒包装系统的包装质粒含有Tat蛋白。

第二代 VS 第三代慢病毒载体系统？慢病毒载体系统经历了至少三代演变发展，随着代次更新，生物安全性逐步提高。

第一代系统（1st generation）虽然使用了三质粒系统，但是仍保留了大部分HIV基因组，安全性欠佳，现已基本淘汰。

相比第一代系统，第二代系统（2nd generation）剔除了与病毒复制相关的Vif、Vpr、Nef等辅助基因，仅保留了与病毒转录、组装相关的Gag、Pol、Tat和Rev基因。

第二代和第三代慢病毒包装系统

第二代和第三代慢病毒包装系统将HIV-1 基因组中的顺式作用元件(如包装信号、长末端重复序列) 和编码反式作用蛋白的序列进行分离。

载体系统包括包装成分和载体成分:包装成分由HIV—1 基因组去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列而构建，能反式提供产生病毒颗粒所需的蛋白；载体成分与包装成分互补，含有包装、逆转录和整合所需的HIV—1顺式作用序列.同时具有异源启动子控制下的多克隆位点及在此位点插入的目的基因。

第一代包装系统中，除vpu之外的辅助基因都被保留下来，Env包膜蛋白由VSV—G蛋白代替,应用VSV-G 包膜的假构型慢病毒载体扩大了载体的靶细胞嗜性范围，而且增加了载体的稳定性。

3质粒系统,包括包装质粒、包膜蛋白质粒和转移质粒。

其中包装质粒在CMV 启动子的控制下，表达HIV 21 复制所需的全部反式激活蛋白,但不产生病毒包膜蛋白及辅助蛋白vpu；包膜蛋白质粒编码水泡性口炎病毒G蛋白（VSV 2G），应用VSV 2G 包膜的假构型慢病毒载体扩大了载体的靶细胞嗜性范围，而且增加了载体的稳定性,允许通过高速离心对载体进行浓缩,提高了滴度；转移质粒中除含有包装、逆转录及整合所需的顺式序列，还保留350 bp 的gag 和RRE，并在其中插入目的基因或标志基因( 绿色荧光蛋白GFP) .在第二代系统中辅助基因vif、vpr、nef被进一步剔除，这些辅助基因的去除并不影响病毒的滴度和感染能力，同时增加了载体的安全性。

第二代系统中5’LTR 634bp,3' LTR 634bp,5'LTR前不需要强启动子。

4质粒系统.第三代系统中，tat调节基因也被剔除，对5’LTR进行了改造，换上了异源启动子，从而不需依赖tat基因（Tat 基因编码蛋白可与LTR结合，增加病毒所有基因转录率）；构建自身失活的慢病毒载体（SIN)，即删除了U3区的3’LTR, 使载体失去HIV—1增强子及启动子序列，即使存在所有的病毒蛋白也不能转录出RNA；一些增强包装病毒滴度的元件被加入，如cPPT、WPRE。

Lenti-Pac HIV 慢病毒包装试剂盒使用手册说明书

Lenti-Pac™HIV慢病毒包装试剂盒使用手册目录1产品概述2试剂盒组成3包装慢病毒颗粒所需的实验材料4慢病毒颗粒转导靶细胞所需的实验材料5实验前的准备6慢病毒颗粒的包装制备原理7制备慢病毒8慢病毒滴度检验9慢病毒感染目的细胞10使用许可与质量保证GeneCopoeia,Inc.广州易锦生物技术有限公司广州高新技术产业开发区广州科学城掬泉路3号广州国际企业孵化器F区8楼邮编：510663电话：4006-020-200邮箱：******************英文网址：中文网址：©2022GeneCopoeia,Inc.HIV（人类免疫缺陷病毒）骨架的慢病毒载体是目前最常用的慢病毒表达载体，它能在体外或体内实验有效介导外源基因转导多种分化或非分化哺乳动物细胞，使外源基因稳定整合靶细胞的基因组，并进行稳定的高水平表达。

GeneCopoeia Lenti-Pac™HIV慢病毒包装系统是安全性较高的第三代慢病毒包装系统，表达载体自身失活，不产生额外的慢病毒复制。

该系统包括：混合包装质粒、EndoFectin™-Lenti转染试剂、可进一步提高滴度的TiterBoost™滴度增强剂、以及eGFP阳性对照质粒。

Lenti-Pac™HIV慢病毒包装系统可将HIV载体的慢病毒表达克隆包装成为具有转导效果的慢病毒颗粒，包装所得的慢病毒颗粒可立即使用，介导目的基因在哺乳动物细胞进行高效表达。

GeneCopoeia提供40000多种人源及小鼠源的慢病毒载体ORF表达克隆，以及针对人源、小鼠源、大鼠源及其他哺乳类动物染色体组靶基因的慢病毒载体shRNA克隆。

除此以外，GeneCopoeia同时提供20000多种人源慢病毒载体miRNA前体表达克隆、miRNA抑制剂表达克隆以及启动子报告克隆，18000种小鼠的慢病毒载体启动子报告克隆。

以上所有克隆均应用HIV骨架，可随时应用于慢病毒包装。

根据疾病控制中心制定的标准，GeneCopoeia第三代HIV慢病毒包装系统满足生物安全第二级别（BSL-2）的要求。

慢病毒包装实验

慢病毒包装试验慢病毒包装试验慢病毒（Lentivirus）载体是以 HIV1 （人类免疫缺陷 1 型病毒）为基础进展起来的基因治疗载体。

慢病毒具有感染谱广泛、可以有效感染分裂期和静止期细胞、长期稳定表达外源基因等优点，因此成为导入外源基因的有力工具。

现在慢病毒系统已经被广泛应用到各种细胞系的基因过表达、RNA 干扰、microRNA 讨论以及活体动物试验中。

一、试验流程图 1、慢病毒包装试验流程图二、试验仪器与试验材料psPAX2 质粒，pMD2.G 质粒，pHBLVTM系列质粒；293T 细胞；wan全培育基；DH5α 菌株；Stbl3 菌株。

三、试验步骤1. 质粒扩增。

将构建好的慢病毒载体和包装质粒使用大抽试剂盒进行质粒的去内毒素抽提，浓度建议不低于 1 μg/μl，A260/280 在 1.71.8 间方可用于病毒包装。

推举使用 Qiagen 大抽试剂盒进行质粒的大量去内毒素抽提（质粒质量会极大影响后续转染效率和病毒的滴度）。

2. 脂质体转染。

转染前一天，在10 cm皿中接种生长状态良好的293T细胞，以第二天汇合度能达到 30% ～ 50% 为宜。

24 h 后转染，转染前需要把 DMEM 和慢病毒包装专用转染试剂 LentiFitTM恢复至室温，使用前需摇匀。

每个皿的质粒成分如下：表 1、慢病毒包装转染体系用于包装的三个质粒摩尔比通常为 1:1:1，可以依据情况稍加调整。

请参考 LentiFitTM转染试剂说明书进行转染操作，转染后46 h 换新鲜培育基。

3. 病毒收集和离心。

转染后 48 h 和 72 h 分别两次收集病毒上清（48 h 收集后置换新鲜培液），将收集的上清用0.45 μm滤器过滤，然后放于超速离心管中，4 ℃，72000 g 离心 120 min。

4. 病毒重悬和保存。

弃上清，500 μl 重悬液重悬病毒沉淀，一周内使用则置于4 ℃ 保存，如需长时间存放需置于80 ℃ 或液氮罐保存。

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第二代和第三代慢病毒包装系统定稿版

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