水产微生物实验—酵母菌、霉菌的形态观察

实验七酵母菌、霉菌的形态观察

一、基础知识

酵母是不运动的单细胞真核微生物，其大小通常比常见细菌大几倍甚至十几倍．大多数酵母以出芽方式进行无性繁殖，有的分裂繁殖；有性繁殖是通过接合产生子囊孢子．本实验通过美蓝染液水浸片和水一碘液水浸片来观察酵母的形态和出芽生殖方式。

美蓝是一种无毒性的染料，它的氧化型呈蓝色，还原型无色。用美蓝对酵母的活细胞进行染色时，由于细胞的新陈代谢作用，细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝由蓝色的氧化型变为无色的还原型。因此，具有还原能力的酵母活细胞是无色的、而死细胞或代谢作用微弱的衰老细胞则呈蓝色或淡蓝色，借此即可对酵母菌的死细胞和活细胞进行鉴别。

霉菌可产生复什分枝的菌丝体，分基内菌丝和气生菌丝，气生菌丝生长到一定阶段分化产生繁殖菌丝，由繁殖菌丝产生孢子。霉菌菌丝体(尤其是繁殖菌丝)及孢子的形态特征是识别不同种类霉菌的重要依据。霉菌菌丝和孢子的宽度通常比细菌和放线菌粗得多(约为3-10 m)，常是细菌菌体宽度的几倍至几十倍，因此，用低倍显微镜即可观察。观察霉菌的形态有多种方法，常用的有下列二种：

直接制片观察法：是将培养物置于乳酸石炭酸棉蓝染色液中，制成霉菌制片镜检。用此染液制成的霉菌制片的特点是：细胞不变形；具有防腐作用，不易干燥，能保持较长时间；能防止孢子飞散；染液的蓝色能增强反差。必要时，还可用树胶封固，制成永久标本长期保存。

载玻片培养观察法：用无菌操作将培养基琼脂薄层置于载玻片上，接种后盖上盖玻片培养，霉菌即在载玻片和盖玻片之间的有限空间内沿盖玻片横向生长，培养一定时间后，将载玻片上的盖玻片直接在显微镜下观察即可。

二、实验目的

1．学习并掌握观察酵母菌和霉菌形态的基本方法及酵母菌、霉菌的形态特征。

2．观察酵母菌的形态及出芽生殖方式，学习区分酵母菌死活细胞的实验方法。

3．掌握酵母菌的一般形态特征及其与细菌的区别。

三、实验材料

酿酒酵母（Saccharomyles cerevisiae）培养的2d的麦芽汁（或豆芽汁）斜面培养物，曲霉（Aspergillus.sp）青霉、根霉（Rhizopus.sp）和毛霉（Mucor.sp）培养2-5d的马铃薯琼脂平板培养物。

四、实验器材试剂

1．器材：平皿、玻璃纸、盖玻片、玻璃涂棒以及载玻片、接种环、接种铲、镊子、显微镜、无菌吸管、U形玻棒、解剖刀。

2．试剂：0.05%和0.1%吕氏碱性美蓝染色液，革兰氏染色用碘液，5%孔雀绿水溶液，

0.5%的番茄江水溶液，95%乙醇，乳酸碳酸棉蓝染色液，土豆琼脂或察氏琼脂，50%乙醇，20%的甘油。

五、实验操作

（一）酵母菌的形态观察及死活细胞的判断。

1．酵母菌菌落形态观察多数酵母菌菌落为乳白色或矿烛色，少数为红色，个别为黑色。菌落光滑、湿润和粘稠，不太透明、容易挑起、菌落质地均匀以及正反面和边缘、中央部位的颜色均很均一，不产生假菌丝的菌落很隆起，边缘十分整齐，产生大量假菌丝的酵母，其菌落平坦，表面和边缘粗糙。多数菌落有酒香味。

2．美蓝浸片的观察

（1）在载玻片中央加一滴0.1%吕氏碱性美蓝染色液，然后按无菌操作用接种环挑取少量培养了48小时的啤酒酵母菌苔放在染液中，混合均匀。

染液不宜过多或过少，否则，在盖上盖玻片时，菌液会溢出或出现大量气泡而影响观察。

（2）用镊子取一块盖玻片，先将一边与菌液接触，然后慢慢将盖玻片放下使其盖在菌液上。

盖玻片不宜平着放下，以免产生气泡影响观察。

（3）将制片放置约3min后镜检，先用低倍镜然后用高倍镜观察酵母的形态和出芽情况，并根据颜色来区别死活细胞。

活细胞不着色，死细胞为蓝色，这是因为活细胞的新陈代谢不停地进行着，还原力强，无毒的美蓝染料进入细胞后即被还原脱色；而死细胞及代谢缓慢的老细胞无此还原力，故细胞被染成蓝色。但美蓝浓度、作用时间等均有影响，应加以注意。

（4）染色约0.5h后再次进行观察，注意死细胞数量是否增加。

（5）用0.05%吕氏碱性美蓝染液重复上述操作。

2．水—碘液浸片的观察

在载玻片中央加一小滴革兰氏染色用碘液，然后在其上加3小滴水，取少许酵母菌苔放在水—磺液中混匀，盖上盖玻片后镜检。

（二）常见霉菌的形态观察

1．菌落形态观察霉菌菌落较大，质地疏松，呈现或紧或松的蛛网状，绒毛状或棉絮状，菌落干燥、不透明，菌落与培养基的连接紧密，不易挑取，菌落正反面的颜色和边缘与中心的颜色常不一致。菌落多数有霉味，颜色随霉菌种类不同而有不同。

2．菌体形态观察

霉菌菌丝比较粗大，细胞易收缩变形，而且孢子很容易飞散，所以制标本时常用乳酸石炭酸棉蓝染色液。此染色液制成的标本有如下特点：细胞不变形，有杀菌防腐作用，且不易于烦，能保持较长时间；溶解本身呈蓝色，有一定的染色效果。

此外，为了得到清晰、完整、保持自然状态的霉菌状态还可利用载玻片、玻璃纸透析培养法进行观察。玻璃片是利用玻璃纸的半透膜特性及透光性，将霉菌生长在复盖于琼脂培养基表面的玻璃纸上，然后将长菌的小片玻璃贴地载玻片上用显微镜观察，其具体操作方法与

前述培养放线菌的方法相同。下面详细介绍直接制片法和载玻片培养观察法。

直接制片观察法：

在载玻片上加一滴乳酸石炭酸棉蓝染色液，用解剖针从霉菌菌落边缘处挑取少量已产孢子的霉菌菌丝，先置于50％乙醇中浸一下以洗去脱落的孢子，再放在载玻片上的染液中，用解剖针小心地将菌丝分散开。盖上盖玻片，置低倍镜下观察，必要时换高倍镜观察。

挑菌和制片时要细心，尽可能保持霉菌自然生长状态；加盖玻片时勿压入气泡，以免影响观察。

六、思考题

1．在显微镜下，酵母菌有哪些突出的特征区别于一般细菌。

2．吕氏碱性美蓝染色液浓度和作用时间的不同，对酵母菌死细胞数量有何影响？试分析其原因。

3．你认为是在显微镜下，细菌、酵母菌和霉菌的主要别区别是什么？