分子标记种类及概述

分子标记概述遗传标记主要有四种类型: 形态标记（morphological marker）、细胞标记（cytological markers）、生化标记（Biochemical marker）和分子标记（molecular marker）。

分子标记是其中非常重要的一种，他是以个体间遗传物质核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA 水平遗传多态性的直接的反映。

早在1923年，Sax等就提出利用微效基因与主基因的紧密连锁，对微效基因进行选择的设想。

但由于形态标记数目有限，而且许多标记对育种家来说是不利性状，因而难以广泛应用。

细胞标记主要依靠染色体核型和带型，数目有限。

同工酶标记在过去的二、三十年中得到了广泛的发展与应用。

作为基因表达的产物，其结构上的多样性在一定的程度上能反映生物DNA组成上的差异和生物遗传多样性。

但由于其为基因表达加工后的产物，仅是DNA 全部多态性的一部分，而且其特异性易受环境条件和发育时期的影响；此外同工酶标记的数量有限，不能满足育种需要。

近年来，分子生物学的发展为植物遗传标记提供了一种基于DNA变异的新技术手段，即分子标记技术。

与其它标记方法相比，分子标记具有无比的优越性。

它直接以DNA形式出现，在植物体的各个组织、各发育时期均可检测到，不受季节、环境的限制，不存在表达与否的问题；数量极多，基因组变异极其丰富，分子标记的数量几乎是无限的；多态性高，利用大量引物、探针可完成覆盖基因组的分析；表现为中性，即不影响目标性状的表达，与不良性状无必然的连锁；许多标记为共显性，对隐性的性状的选择十分便利，能够鉴别出纯合的基因型与杂合的基因型，提供完整的遗传信息。

随着分子生物学技术的发展，现在DNA分子标记技术已有数十种，广泛应用于遗传育种、基因组作图、基因定位、物种亲缘关系鉴别、基因库构建、基因克隆等方面。

分子标记的概念有广义和狭义之分。

广义的分子标记是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质。

蛋白质标记包括种子贮藏蛋白和同工酶（指由一个以上基因位点编码的酶的不同分子形式）及等位酶（指由同一基因位点的不同等位基因编码的酶的不同分子形式）。

狭义分子标记是指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异的特异性DNA片段。

理想的分子标记必须达以下几个要求：(1) 具有高的多态性；(2) 共显性遗传，即利用分子标记可鉴别二倍体中杂合和纯合基因型；(3) 能明确辨别等位基因；(4) 遍布整个基因组；(5) 除特殊位点的标记外，要求分子标记均匀分布于整个基因组；(6) 选择中性(即无基因多效性)；(7) 检测手段简单、快速(如实验程序易自动化)；(8) 开发成本和使用成本尽量低廉；(9) 在实验室和实验室间重复性好(便于数据交换)。

但是，目前发现的任何一种分子标记均不能满足以所有要求。

分子标记种类利用分子标记技术分析生物个体之间DNA序列差别并用于作图的研究始于1980年。

经过十几年的发展，现在的DNA标记技术已有几十种，主要有一下几大类。

一、基于分子杂交的分子标记这类标记利用限制性切酶酶切及凝胶电泳分离不同生物体的DNA分子，然后用特异探针进行杂交，通过放射性自显影或非同位素显色技术揭示DNA的多态性。

（一）限制性片段长度多态性（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP）限制性片段长度多态性是出现最早和应用最广泛的DNA标记技术之一。

1974年Grodzicker等创立了该技术，它是一种以DNA—DNA杂交为基础的第一代遗传标记。

RFLP 标记非常稳定，它是一种共显性标记，在分离群体中可区分纯合体与杂合体，提供标记位点完整的遗传信息。

多种农作物的RFLP分子遗传图谱已经建成。

但其分析所需DNA量较大，步骤较多，周期长，制备探针及检测中要用到放射性同位素，尽管可用非放射性同位素标记方法代替，但成本高、成功率低，且实验检测步骤较多，依然影响其使用、推广。

自RFLP 问世以来，已经在基因定位及分型、遗传连锁图谱的构建、疾病的基因诊断等研究中仍得到了广泛的应用。

RFLP基本原理：利用特定的限制性切酶识别并切割不同生物个体的基因组DNA，得到大小不等的DNA片段，所产生的DNA数目和各个片段的长度反映了DNA分子上不同酶切位点的分布情况。

通过凝胶电泳分析这些片段，就形成不同带，然后与克隆DNA探针进行Southern 杂交和放射显影，即获得反映个体特异性的RFLP图谱。

它所代表的是基因组DNA在限制性切酶消化后产生片段在长度上差异。

由于不同个体的等位基因之间碱基的替换、重排、缺失等变化导致限制切酶识别和酶切发生改变从而造成基因型间限制性片段长度的差异。

图7-2 RFLP图谱（二）小卫星DNA（Minisatellite DNA）小卫星DNA（Minisatellite DNA）又称数目可变串联重复序列（Variable Number of Tandem Repeat，VNTR）是一种重复DNA小序列，为10到几百核苷酸，拷贝数10—10000不等。

多态性由于重复单位之间的不平衡交换，从而产生不同等位基因，可通过杂交检测出。

其缺点是多态性分布集中，数量有限，而且在基因组上分布不均匀，合成探针困难，实验操作繁琐、检测时间长、成本高，因此应用并不广泛。

VNTR基本原理与RFLP大致相同，只是对限制性切酶和DNA探针有特殊要求：(1)限制性切酶的酶切位点必须不在重复序列中，以保证小卫星或微卫星序列的完整性。

(2)切酶在基因组的其他部位有较多酶切位点，则可使卫星序列所在片段含有较少无关序列，通过电泳可充分显示不同长度重复序列片段的多态性。

(3)分子杂交所用DNA探针核昔酸序列必须是小卫星序列或微卫星序列，通过分子杂交和放射自显影后，就可一次性检测到众多小卫星或微卫星位点，得到个体特异性的DNA指纹图谱。

二、基于PCR技术的分子标记（一）、随机引物的PCR标记(1) 随机扩增多态性DNA（Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD）随机扩增片段长度多态性DNA，是由Williams和Welsh（1990）同时发展起来的一项新的遗传标记技术。

RAPD以PCR为基础而又不同于经典的PCR，一般采用10个核苷酸的DNA序列为引物，扩增时退火温度降至35℃左右。

与其它标记相比，RAPD具有以下优点：a）技术简单，检测速度快；b）成本较低；c）不依赖于种属的特异性和基因组的结构，合成的一套引物可用于不同生物基因组的分析；d）操作简单，可实现自动化，短期可利用大量引物完成覆盖基因组的分析；e）不需制备探针、杂交等程序，成本较低；f）DNA用量少（10ngDNA 即可完成一次分析），允许快速、简单地分离基因组DNA。

同时RAPD也存在一些缺点：a）RAPD标记是一个显性标记，不能鉴别杂合子和纯合子；b）存在共迁移问题，凝胶电泳只能分开不同长度DNA片段，而不能分开那些分子量相同但碱基序列组成不同的DNA片段；c）RAPD技术中影响因素很多，所以实验的稳定性和重复性差。

基本原理：它是利用随机引物（一般为8—10bp）通过PCR反应非定点扩增DNA片段，然后用凝胶电泳分析扩增产物DNA片段的多态性。

扩增片段多态性便反映了基因组相应区域的DNA多态性。

RAPD所使用的引物各不相同，但对任一特定引物，它在基因组DNA序列上有其特定的结合位点，一旦基因组在这些区域发生DAN片段插人、缺失或碱基突变，就可能导致这些特定结合位点的分布发生变化，从而导致扩增产物数量和大小发生改变，表现出多态性。

就单一引物而言，其只能检测基因组特定区域DNA多态性，但利用一系列引物则可使检测区域扩大到整个基因组，因此，RAPD可用于对整个基因组DNA进行多态性检测，也可用于构建基因组指纹图谱。

RAPD已在遗传图谱构建、种质资源分析、基因标记等方面得到了广泛的应用。

图7-4 RAPD图谱（2）任意引物PCR (Arbitrarily Primed Polymerase Chain Reaction， AP—PCR)在AP—PCR分析中，所使用的引物较长(10－50 bp) ， PCR反应分为两个阶段，首先寡核昔酸引物在低严谨条件下与模板DNA退火，此时发生了一些合成，以便稳定模板与引物之间相互作用。

然后进行高严谨退火条件的循环，两个位点间那些序列在低严谨度退火条件下发生的引物延伸可继续在高严谨条件下扩增。

采用变性聚丙烯酞胺凝胶电泳分析PCR产物，最终反应结果与RAPD类似。

只要设计的引物在低严谨退火条件下能减少引物产生人为产物，应用成对组合的引物可以产生新的AP—PC R谱带，但引物配对组合使用时，得到的图谱与单引物单独使用时产生的图谱之和很不相同，这样，50个引物能产生1250种不同指纹图谱。

AP—PCR方法不需预知序列资料，而且检测的基因组样本是任意的，还能够用于检测近等基因系(或同类系)中的多态性。

AP—PCR的缺点是每个新的多态性都必须经纯化才能进一步使用。

另外，此方法在杂合体中仅可辨别长度多态性。

（3）DNA扩增指纹印迹(DNA Amplification Fingerprinting，DAF)DAF是一种改进的RAPD分析技术，与RAPD技术不同的是，DAF分析中所使用的引物浓度更高，长度更短(一般为5一8 bp)，因此它所提供的谱带信息比RAPD大得多，如当使用5个核昔酸的引物时，引物和模板的组合大约可扩增出10一100个DNA片段。

PCR扩增产物是在凝胶上进行分离，通过银染即可产生非常复杂带型。

（二）、特异引物的PCR标记特异引物的PCR标记所用引物是针对已知序列的 DNA 区段而设计的，具有特定核苷酸序列（通常为 18—24 bp），可在常规PCR复性温度下进行扩增，对基因组 DNA 的特定区域进行多态性分析。

（1）序列标志位点(Sequence Tagged Sites，STS)STS是对以特定对引物序进行PCR特异扩增的一类分子标记的统称。

通过设计特定的引物，使其与基因组DNA序列中特定结合位点结合，从而可用来扩增基因组中特定区域，分析其多态性。

利用特异PCR技术的最大优点是它产生信息非常可靠，而不像RFLP和RAPD那样存在某种模糊性。

（2）简单重复序列(Simple Sequence Repeat，SSR)简单重复序(SSR)也称微卫星DNA，也可称为SSRP(Simple Sequence Repeat Polymorphisms)，STMS (Sequence-tagged microsatellites)。

其串联重复的核心序列为1一6 bp，其中最常见是双核昔酸重复，即(CA) n和(TG) n每个微卫星DNA的核心序列结构相同，重复单位数目10一60个，其高度多态性主要来源于串联数目的不同。