杆状病毒表达载体系统生产重组蛋白
非洲猪瘟病毒p30蛋白在杆状病毒表达系统中的表达与免疫检测
·研究论文·Chinese Journal of Animal Infectious Diseases中国动物传染病学报非洲猪瘟病毒p30蛋白在杆状病毒表达系统中的表达与免疫检测摘 要：p30蛋白是非洲猪瘟病毒（ASFV ）免疫原性最强的结构蛋白之一，由CP204L 基因编码。
本研究利用Bac-to-Bac 昆虫杆状病毒真核表达系统将ASFV 中CP204L 插入pFastBac1载体下游，将形成的重组质粒pFastBac-p30以转座子的形式插入到DH10Bac 中的杆状病毒穿梭质粒（Bacmid ）中，筛选出重组Bacmid-p30后，将Bacmid-p30转染Sf9细胞，并继续传代3次，获得重组杆状病毒，命名为rBac-p30。
分别通过间接免疫荧光（IFA ）和免疫印迹（Western blot ）鉴定了ASFV 阳性血清可特异性识别Sf9细胞中表达的p30。
以此真核表达p30蛋白包被ELISA 板，可区分ASFV 阴阳性血清。
以上结果表明，本研究初步建立了检测ASFV 血清抗体的间接ELISA 方法，为后续建立非洲猪瘟抗体检测方法和p30亚单位疫苗研究奠定基础。
关键词：非洲猪瘟病毒；p30蛋白；杆状病毒表达系统中图分类号：S852.65文献标志码：A文章编号：1674-6422（2023）04-0170-06Production and Immunological Detection of African Swine Fever Virus p30 byBaculovirus Expression SystemLIAO Xinxin 1,2, ZHONG Qiuping 2, SHI Xinjin 2, WEI Changqing 2, SUN Haiwei 2, LIU Yingnan 2,AO Qingying 2, XIE Zhenhua 2, WU Jing 1, CHEN Hongjun 2(1. Hunan Engineering Research Center of Livestock and Poultry Health Care, Colleges of V eterinary Medicine, Hunan Agricultural University,Changsha 410128, China; 2. Shanghai V eterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China)收稿日期：2021-11-01基金项目：十三五国家重点研发专项资助项目（2018YFC08400400，2017YFD0502300）；自然科学基金联合基金项目重点支持项目-区域创新发展联合基金项目（U19A2039）作者简介：廖欣欣，女，硕士研究生，临床兽医学专业通信作者：邬静，E-mail：****************.cn；陈鸿军，E-mail：***************.cn Abstract: The p30 protein encoded by CP204L gene is one of the most immunogenic structural proteins of African swine fever virus (ASFV). In this study, the Bac-to-Bac insect baculovirus eukaryotic expression system was used to insert CP204L in ASFV into the downstream of pFastBac1 vector, and the resulting recombinant plasmid pFastBac-p30 was inserted into Baculovirus shuttle plasmid (Bacmid) in DH10Bac as a transposon. After screening the recombinant Bacmid-P30 was transfected into Sf9 cells, and the recombinant Baculovirus rBac-p30 was obtained expression of p30 protein. Indirect immunofl uorescence (IFA) and Western blot were used to identify p30 expression in Sf9 cells by ASFV positive serum specifi city. The recombinant p30 protein was used to coat ELISA plates to distinguish positive and negative serum samples of ASFV . The development of an indirect ELISA method laid the foundation for further establishment of an ASFV antibody detection method and p30 subunit vaccine research.Key words: African Swine fever virus; p30 protein; baculovirus expression system2023,31(4):170-175廖欣欣1,2，钟秋萍2，史馨瑾2，魏常青2，孙海伟2，刘英楠2，敖清莹2，谢振华2，邬 静1，陈鸿军2（1.湖南农业大学动物医学院 畜禽保健湖南省工程研究中心，长沙410128；2.中国农业科学院上海兽医研究所，上海200241· 171 ·廖欣欣等：非洲猪瘟病毒p30蛋白在杆状病毒表达系统中的表达与免疫检测第31卷第4期非洲猪瘟（African swine fever, ASF）是由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus, ASFV）引起的猪的一种热性、急性、高度接触性传染病[1]。
重组蛋白的鉴定
重组蛋白的鉴定
重组蛋白是指通过基因重组技术获得的蛋白质，获得后常常需要对其进行鉴定以保证其正确性。
百泰派克生物科技提供基于质谱技术的重组蛋白鉴定服务。
重组蛋白
重组蛋白是指通过基因重组技术获得的蛋白质。
用基因重组技术对基因进行修饰可导致突变蛋白的表达。
重组蛋白是天然蛋白的一种加工形式，通过多种方式产生，以增加蛋白质的产量、修改基因序列和制造有用的蛋白质商业产品。
重组蛋白是研究生物学过程的重要工具，且重组蛋白为生物医学技术提供了重要突破。
重组蛋白不仅可用于生物医学研究，还可用于治疗，如重组蛋白药物。
产生重组蛋白需要使用表达系统，合适的表达系统的选择取决于重组蛋白的特性和预期应用，并且选择合适的表达系统对于产生足够量的蛋白是必要的。
四种常用的表达系统包括大肠杆菌，巴斯德毕赤酵母，杆状病毒/昆虫细胞和哺乳动物细胞。
大肠杆菌系统是表达重组蛋白质的快速方法，但缺乏真核生物中发现的许多翻译后修饰。
蛋白质谱鉴定示意图。
重组蛋白的鉴定
因为重组蛋白是人工对天然蛋白质的改造，所以在得到重组蛋白后常常需要对其进行鉴定，以保证重组蛋白的正确性。
重组蛋白的鉴定可以采用的方法包括电泳、层
析、测序、Western Blot和与质谱有关的方法等。
其中质谱法可以对重组蛋白的分子量、序列、翻译后修饰等进行测定，从而实现重组蛋白的鉴定。
重组蛋白 工艺流程
重组蛋白工艺流程
重组蛋白工艺流程：
目标基因的扩增。
首先，需要设计引物，这些引物应避开目标蛋白的跨膜区和二级结构，如选择N端或C端的序列。
这些引物的设计结合了目标蛋白的结构信息和基因信息，并通过第三方公司合成。
插入克隆载体。
利用PCR技术，根据目标蛋白的特异表达组织，使用设计的引物进行PCR扩增，然后进行酶切和连接，将目的片段与载体结合。
亚克隆到表达载体中。
将连接好的目的片段转化到感受态细胞中，如大肠杆菌，并进行挑菌验证，通过PCR和琼脂糖凝胶电泳来确认目的片段是否成功插入载体。
蛋白表达。
在特定的条件下，如诱导剂的存在，将重组载体转化到宿主细胞中，如大肠杆菌、酵母、哺乳动物细胞或杆状病毒-昆虫细胞系统，进行蛋白的表达。
蛋白的鉴定和纯化。
通过SDS-PAGE和western blot或荧光等方法进行蛋白的鉴定，由于载体中通常包含标签（如His标签），可以使用特定的纯化方法，如镍柱纯化，来分离和纯化重组蛋白。
质量检测和保存。
纯化后的蛋白会进行冻干处理，并进行常规的蛋白质实验验证其分子量和纯度，纯度通常需要超过95%。
通过测试后，蛋白会被储存。
杆状病毒表达系统简介-9页精选文档
体外基因表达系统包括原核细胞系统和真核细胞系统。
原核细胞系统主要是大肠杆菌细胞，它操作简便、周期短收益大及表达产物稳定，但是表达基因的相对分子质量有限，不宜过大，且不能对表达产物进行一些翻译后加工、修饰。
真核细胞系统包括 CHO等哺乳动物细胞、酵母细胞和昆虫细胞等。
昆虫细胞表达系统(即杆状病毒表达系统)具有独特的生物学特性，日益受到人们的重视。
1、杆状病毒的生物学特性杆状病毒只来源于无脊椎动物，虽然已发现600多种杆状病毒，但进行分子生物学研究的不到20种。
杆状病毒的基因组为单一闭合环状双链DNA分子，大小为80～160 kb，其基因组可在昆虫细胞核复制和转录。
DNA复制后组装在杆状病毒的核衣内，后者具有较大的柔韧性，可容纳较大片段的外源DNA插入，因此是表达大片段DNA的理想载体。
其中，用作外源基因表达载体的杆状病毒，目前仅限于核型多角体病毒(nuclear polyhedrosis virus，NPV)。
该病毒颗粒在细胞内可由多角体蛋白包裹形成长度约1~5 m 的包含体病毒，呈多角体形状。
核型多角体病毒有两种形式：一种为包含体病毒(occluded virus，OV)，另一种则为细胞外芽生病毒(budded virus，BV)。
它们在病毒感染中扮演的角色不同，包含体病毒是昆虫间水平感染的病毒形式，昆虫往往是食入污染OV的食物后引起感染。
包含体病毒外层裹了一层蛋白晶体，即为29 000的多角体蛋白，它对病毒的水平感染起以下作用：①保护病毒颗粒在外界传播过程中免遭环境因素的破坏而失活。
②保证病毒颗粒在适当的位置释放，引起感染。
昆虫中肠上皮局部的强碱性环境(pH=10.5)，可使病毒颗粒释放蛋白酶溶解多角体。
BV病毒是个体内细胞间的感染形式，由细胞芽生出BV，进入血淋巴系统中感染其它部位的细胞或直接在临近细胞内感染。
近几十年，有关杆状病毒基因结构、功能和表达调节的研究进展迅速，其中研究最深入的是苜蓿银蚊夜蛾(autogra— phacalifornica)多核型多角体病毒(multiple nuclear polyhedro-sis virus，MNPV)，简称AcMNPV或AcNPV。
昆虫的基因工程和转基因技术
昆虫表观遗传学调控策略
要点一
表观遗传学概述
表观遗传学是研究基因表达的可遗传变化而不涉及DNA序 列改变的科学。这些变化包括DNA甲基化、组蛋白修饰、 非编码RNA调控等，它们可以影响基因的表达模式和细胞 命运。
THANKS
感谢观看
基因功能研究
通过基因敲除、基因沉默 等技术手段，研究昆虫基 因在生长发育、繁殖、代 谢等方面的功能。
昆虫基因工程发展历程
早期探索阶段
20世纪80年代，科学家们开始尝试将 外源基因导入昆虫细胞中，并观察其 对昆虫的影响。
转基因昆虫的应用
近年来，转基因昆虫在农业、医学等 领域的应用逐渐展开，为这些领域的 发展带来了新的机遇。
生态环境领域
前景展望
通过基因工程技术，研究昆虫与环境的相 互作用关系，为生态环境的保护和治理提 供科学依据。
随着基因编辑技术的不断发展和完善，未来 昆虫基因工程将在更多领域发挥重要作用， 为人类社会的可持续发展做出贡献。
02
昆虫转基因技术方法
BIG DATA EMPOWERS TO CREATE A NEW
药物生产或疫苗开发载体
重组蛋白表达
利用转基因昆虫表达系统生产重组蛋白，用于药物或疫苗的开发 。
昆虫细胞培养
培养转基因昆虫细胞，用于生产具有药用价值的生物活性物质。
昆虫杆状病毒表达系统
利用昆虫杆状病毒作为载体，在昆虫细胞中表达外源基因，生产药 物或疫苗。
替代实验动物模型
人类疾病模型
利用杆状病毒表达载体系统表达重组乙型肝炎病毒核心蛋白
Ｉ ｓｉ ｔ ｆ Ｈｅ ａ ｉ ｓａ ｅ ，Ｔｏ ｇ ｉＨｏ ｐ ｔ ｌ ｎｔｔ ｅｏ ｐ ｔｃＤｉｅ ｓｓ ｕ ｎ Ｊ ｓ ｉａ ，Ｔｏ ｇ ｉ ｅ ｉａ ｌｅ ｅ， ｎ Ｊ ｄ ｃ ｌＣｏｌｇ Ｍ Ｈ ｕ ｚ ｏ ｇ Ｕｎｖ ｒｉ ｆ ｃｅ ｃ ｎ ｃ ｎ ｌｇｙ，Ｗ ｕ ａ ３ ０ ０ ａ ｈ ｎ ｉ ｅｓｔ ｏ Ｓ ｉｎ ｅａ ｄ Ｔｅｈ ｏｏ ｙ ｈ ｎ４ ０ ３
维普资讯
、－ ：
．
第 ３ 卷 第 ６ 第 ７ ７页 ６ 期 ８
华 中科 技大 学 学 报 （ 医学 版 ）
Ａｃ ａ Ｍ ｅ ｉ ｃ ｅ ｈ ｏ Ｈｕ ｚ ｏ ｇ ｔ ｄ Ｕｎ ｖ Ｓ ｉＴ ｃ ｎ ｌ ａｈ ｎ
Ｖ０ ． ６ Ｎｏ ６ Ｐ ７ ７ Ｉ３ ． ． ８
林 菊 生
华 中 科 技 大 学 同 济 医 学 院 附属 同济 医 院 肝病 研 究 所 ， 汉 武 。 国 科 学 院 武 汉 分 院 病 毒 研 究 所 ，武 汉 中 ４ ０ ７ ３０ １
摘 要 目 的 利 用 杆状 病 毒 表 达 载 体 系 统 制 备 重 组 乙型 肝 炎 病 毒 核 心 蛋 白 。 方 法 构 建 含 有 ＨＢ Ｃ基 因 的 杆 状 Ｖ 病 毒 转 移 载 体 ｐ ａｔａ ｕ ｌ Ｖ ｒ， 化 大 肠 埃 希 菌 Ｄ ０ ａ 进 行 转 座 ， 取 重 组 Ｂ ｃ ｄＤ Ｆ ｓＢ ｃＤ ａ— ＨＢ ｃ ｅ 转 ｏ Ｈ１ Ｂ ｃ 提 ａｍｉ ＮＡ 转 染 昆虫 细 胞 Ｓ９ ｆ，
获 得 含 有 ＨＢ Ｃ基 因 的 重 组 杆 状 病 毒 。用 重 组 杆 状 病 毒 感 染 Ｓ９细 胞 进 行 乙 型 肝 炎 病 毒 核 心 蛋 白 表 达 ， 后 通 过 Ｖ ｆ 然 Ｓ ＳＰ Ｅ 电 泳 和 Ｗｅｔｒ ｌｔ 析 表 达 情 况 。 结 果 成 功 构 建 了 含 ＨＢ Ｄ － ＡＧ ｓｅｎｂｏ 分 Ｖ Ｃ基 因 的 重 组 杆 状 病 毒 ， 且 在 昆 虫 细 胞 而 Ｓ９中表 达 了 乙 型 肝 炎 病 毒 核 心 蛋 白 。结 论 ｆ
杆状病毒表达系统00000001
昆虫杆状病毒系统高效表达重组蛋白●杆状病毒表达系统介绍●杆状病毒蛋白表达系统的优势●杆状病毒表达载体系统（BEVS）●杆状病毒表达宿主细胞●表达优化条件●翻译后修饰对蛋白表达的影响●高通量表达●总结杆状病毒介绍1.杆状病毒是一类具有囊膜包裹的双链环状DNA病毒。
2.杆状病毒在其生命周期中有两种不同的形态：一种为出芽型病毒（budded virus, BV），另一种为包含体病毒（Occlusion‐derived virus, OV）。
3. BV由糖蛋白GP64包裹的单一囊膜蛋白和膜蛋白构成。
4. OV由蛋白结晶基体包裹的多囊膜病毒粒子。
5. 研究最多的杆状病毒株为苜蓿银蚊夜蛾(autogra—phacalifornica)多核型多角体病毒(multiple nuclearpolyhedro‐sis virus，MNPV)，简称AcMNPV或AcNPV。
6. AcMNPV只侵染鳞翅类幼虫。
杆状病毒生命周期●早期（0‐6h PI）•核衣壳迁移到细胞核•病毒DNA释放•开始早期基因表达●晚期（6‐24h PI）•更多DNA复制•新产生的核衣壳离开细胞核，随后在离开细胞质•的过程中得到囊膜蛋白•产生新的出芽病毒●极晚期Courtesy: Dr. Linda Lua, The University of Queensland, Australia •出芽病毒减少•核衣壳在细胞核内得到囊膜蛋白形成MNPVs•MNPVs以多晶体形式出芽，主要是多角体蛋白，形成包含体病毒。
多角体启动子是杆状病毒表达载体系统的主要元件。
优点缺点大肠杆菌成本低、表达量高。
缺乏蛋白质翻译后加工机制；目的蛋白不可溶，蛋白生物活性低。
酵母表达量高，可以翻译后加工，易实现高密度发酵。
蛋白质量不理想。
哺乳动物细胞重组蛋白生物活性高。
成本高；表达水平低，技术和环境要求高。
昆虫细胞重组蛋白生物学活性高；表达水平高；能同时表达多个基因。
重组蛋白糖基化程度低。
应用杆状病毒表达系统在Sf9昆虫细胞中重组表达Legumain蛋白
ＪＰｒｓｃｔＯｐｈｔｈａｈｎｏｌ，Ａｕｇｕｓｔ．２０１４，Ｖｏｌ ３２，Ｎｏ．８
・论著：基础研究・
应用杆状病毒表达系统在Ｓｆ９昆虫细胞中重组表达 Ｌｅｇｕｍａｉｎ蛋白
李兴育状病毒表达系统表达获得Ｌｅｇｕｍａｉｎ蛋白，为进一步研究其在葡萄膜黑
ｗｉｔｈ ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｂｍｇｙｕ
Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
ｏｆ
Ｌｅｇｕｍａｉｎ
ｐｒｏｔｅｉｎ
ｓｙｓｔｅｍ
ｉｎ
ｉｎｓｅｃｔ
ｃｅｌｌ
Ｓｆ９ Ｃｅｎｔｅｒ，
Ｌｉ Ｘｉｎｇｙｕ，Ｚｈａｎｇ
Ｈｕａ，Ｌｉ Ｊｕａｎ，Ｔｉａｎ
Ｎｏ
４
Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｓｈａａｎｘｉ Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ Ｍｅｄｉｃａｌ
ＡＩＥｌｉａｔｅｄ Ｇｕａｎｇｒｅｎ Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ
Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ＸＩ’ａｎ
Ｊｉａｏｔｏｎｇ Ｕｎｉｖｅｒ白ｔｙ，Ｘｉ’ａｎ ７１０００４，Ｃｈｉｎａ
Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ａｕｔｈｏｒ ＬＩ Ｘｉｎｇｙｕ，Ｅｍａｉｌ：ｌｅｅｘｉｎｇｙｕ０ １＠１６３ ｃｏｍ
【Ａｂｓｔｒａｃｔ】Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ
ｔｅｍ，ｍａｋｅ ｔｅｉｎ ｗ－ａｓ
ｔｅｒ ｔｈｅ Ｅ
Ｔｏ
ｏｂｔａｉｎ ｕｖｅａｌ
ｈｕｍａｎ
Ｌｅｇｕｍａｉｎ
ｐｒｏｔｅｉｎ
ｗｉｔｈ
ｉｎｓｅｃｔ—ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ｇｅｎｅ
ｓｙｓ— ｐｒｏ—
ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ
ｆｏｒ
ｔｈｅ
ｍｅｌａｎｏｍａ ｓｔｕｄｙ
Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｔｈｅ
ｅｎｃｏｄｉｎｇ
杆状病毒表达系统简介
杆状病毒表达系统简介体外基因表达系统包括原核细胞系统和真核细胞系统。
原核细胞系统主要是⼤肠杆菌细胞，它操作简便、周期短收益⼤及表达产物稳定，但是表达基因的相对分⼦质量有限，不宜过⼤，且不能对表达产物进⾏⼀些翻译后加⼯、修饰。
真核细胞系统包括CHO等哺乳动物细胞、酵母细胞和昆⾍细胞等。
昆⾍细胞表达系统(即杆状病毒表达系统)具有独特的⽣物学特性，⽇益受到⼈们的重视。
1、杆状病毒的⽣物学特性杆状病毒只来源于⽆脊椎动物，虽然已发现600多种杆状病毒，但进⾏分⼦⽣物学研究的不到20种。
杆状病毒的基因组为单⼀闭合环状双链DNA分⼦，⼤⼩为80～160 kb，其基因组可在昆⾍细胞核复制和转录。
DNA复制后组装在杆状病毒的核⾐内，后者具有较⼤的柔韧性，可容纳较⼤⽚段的外源DNA插⼊，因此是表达⼤⽚段DNA的理想载体。
其中，⽤作外源基因表达载体的杆状病毒，⽬前仅限于核型多⾓体病毒(nuclear polyhedrosis virus，NPV)。
该病毒颗粒在细胞内可由多⾓体蛋⽩包裹形成长度约1~5 m的包含体病毒，呈多⾓体形状。
核型多⾓体病毒有两种形式：⼀种为包含体病毒(occluded virus，OV)，另⼀种则为细胞外芽⽣病毒(budded virus，BV)。
它们在病毒感染中扮演的⾓⾊不同，包含体病毒是昆⾍间⽔平感染的病毒形式，昆⾍往往是⾷⼊污染OV的⾷物后引起感染。
包含体病毒外层裹了⼀层蛋⽩晶体，即为29 000的多⾓体蛋⽩，它对病毒的⽔平感染起以下作⽤：①保护病毒颗粒在外界传播过程中免遭环境因素的破坏⽽失活。
②保证病毒颗粒在适当的位置释放，引起感染。
昆⾍中肠上⽪局部的强碱性环境(pH=10.5)，可使病毒颗粒释放蛋⽩酶溶解多⾓体。
BV病毒是个体内细胞间的感染形式，由细胞芽⽣出BV，进⼊⾎淋巴系统中感染其它部位的细胞或直接在临近细胞内感染。
近⼏⼗年，有关杆状病毒基因结构、功能和表达调节的研究进展迅速，其中研究最深⼊的是苜蓿银蚊夜蛾(autogra—phacalifornica)多核型多⾓体病毒(multiple nuclear polyhedro-sis virus，MNPV)，简称AcMNPV或AcNPV。
sf-900II SFM中文说明书
Sf-900II SFM中文说明书优化的无血清培养基生长的昆虫和其他无脊椎动物细胞系表达重组蛋白Cat.No.:10902500mL1000mL10L组成缺少培养基Cat.No.:21012500mL不含L-甲硫氨酸和L-胱氨酸可根据要求定制包装储存条件：2 8°C，在黑暗中签收后的最低保质期：2个月注：目录编号21012请同时参阅组成缺少媒介补充。
特点：草地夜蛾(Sf9,Sf21)、舞毒蛾(Ld)和粉纹夜蛾(Tn-368)高级生长细胞与市售的无血清和无血清培养基通过昆虫细胞培养系统生产重组蛋白质进行了优化(现有系统的2-10倍的增长)无蛋白质可扩展的各种生物反应器能够支持长期细胞生长的（大于20代）细胞适应其他市售的无血清培养基，可以直接在SF-900II SFM传代，通常不需要进一步的适应支持高产量的野生型AcNPV(occluded and non-occluded virus)说明Sf-900II SFM是支持多种昆虫细胞系细胞生长的增加，以及显着增加使用杆状病毒表达系统中生产重组蛋白的无蛋白培养基。
欲了解更多关于昆虫细胞表达、增长重组蛋白的信息，见参考文献3-8草地夜蛾细胞（sf9）在sf-900II SFM中生长至9~12*106个细胞/ml时，rβ-半乳糖苷酶的表达达到最大细胞密度高达50U/ml，显着改善了竞争对手的配方和原来的SF-900的配方（见参考文献1和图1）舞毒蛾和粉纹夜蛾细胞系也观察到最大细胞密度增加20％到100％。
BEVS最初由德克萨斯州A&M大学的Smiths等人研发的。
传统上，Summers 等人十三月添加10%胎牛血清的Grace’s TNM-FH昆虫细胞培养基用于BEVS技术。
到目前为止，超过200个重组（基因）蛋白使用苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒转染sf9细胞系成功表达。
Sf-900II SFM是为培养sf9和其他鳞翅目昆虫细胞系，生产昆虫病毒和rDNA蛋白而设计的，经改良不含血清的培养基。
基因缺失杆状病毒载体的构建及应用
·研究论文·Chinese Journal of Animal Infectious Diseases中国动物传染病学报摘 要：为解决杆状病毒表达系统存在的表达量低和毒种种子批代次窄问题，加快杆状病毒表达系统产业化进程。
本研究首次通过Red 和Cas9两种重组技术，先后对影响蛋白表达的V-cath 、ChiA 、P10和重组杆状病毒基因组稳定性的FP25K 和DA26基因进行缺失。
同时基于对CSFV-E2蛋白的结构和糖基化预测分析，突变影响同源二聚体二硫键形成的糖基化位点。
最后通过悬浮转染的方式提高拯救病毒的滴度。
结果表明对E2基因突变后，表达的E2蛋白95%以同源二聚体形式存在。
通过供体质粒优化和病毒载体基因缺失，E2蛋白的表达水平提高约4倍，可稳定表达蛋白的重组杆状病毒毒株代次从P7代延长至P20代。
悬浮转染获得的重组杆状病毒滴度提高约70倍，同时获得足量低代次的毒种，有效缩短从毒种构建到蛋白表达时间，有效解决杆状病毒表达系统表达量低和毒种种子批代次窄的问题，为猪瘟亚单位疫苗研发奠定基础。
关键词：杆状病毒；猪瘟病毒；基因缺失；E2蛋白中图分类号： S852.65文献标志码：A文章编号：1674-6422（2024）01-0048-08Construction and Application of Gene Deletion Baculovirus Vector收稿日期：2021-11-03基金项目：郑洛新自创区创新引领型产业集群专项（201200211200）作者简介：王同燕，女，硕士，兽医师，主要从事兽用基因工程疫苗研究与开发；仝晓丹，女，硕士，主要从事兽用基因工程疫苗研究与开发通信作者：谭菲菲，E-mail：**************；田克恭，E-mail:**************基因缺失杆状病毒载体的构建及应用王同燕1,2，仝晓丹1,2，苏晓蕊1,2，宋欢欢1,2，李伟国1,2，刘武杰1,2，谭菲菲1,2，田克恭1,2,3（1.国家兽用药品工程技术研究中心，洛阳471003；2.普莱柯生物工程股份有限公司，洛阳471000；3.洛阳普泰生物技术有限公司，洛阳471003）2024,32(1):48-55Abstract: In order to solve the low protein production and virus passages in baculovirus expression system to accelerate the industrialization process, the v-cath , ChiA , P10 that aff ected protein production and FP25K , DA26 genes that related to stability of the genome were deleted by Red and Cas9 recombinant techniques in this study. At the same time, the glycosylation site that aff ected the formation of disulfi de bonds were changed based on the structure and glycosylation prediction analysis of CSFV-E2. Finally, suspension transfection was performed to increase the titer of rescued viruses. The results showed that 95% of the mutant E2 protein was in the form of homodimer. The expression level of E2 protein was increased about 4 times by optimizing donor plasmid and deletion of viral vector gene and the passages of the recombinant baculovirus strain with stable expression of protein was extended from P7 to P20. The titer of recombinant baculovirus obtained by suspension transfection increased by about 70 times, and suffi cient low viral passages were obtained, which eff ectively shortened the time from strain construction to protein expression and solved the problems of low protein production of baculovirus expression system and virus passages of strain seeds. Therefore, the successful construction of the gene deletion baculoviruses laid a foundation for the research and production of a subunit swine fever vaccine.Key words: Baculovirus; Classical swine fever virus; gene deletion; E2 proteinWANG Tongyan 1,2, TONG Xiaodan 1,2, SU Xiaorui 1,2, SONG Huanhuan 1,2, LI Weiguo 1,2, LIU Wujie 1,2,TAN Feifei 1,2, TIAN Kegong 1,2,3(1. National Research Center of Veterinary Medicine, Luoyang 471003, China; 2. PULIKE Biological Engineering, INC., Luoyang 471000,China; 3. Luoyang Putai Biotechnology Co., Ltd, Luoyang 471000, China)· 49 ·王同燕等：基因缺失杆状病毒载体的构建及应用第32卷第1期猪瘟（Classical swine fever, CSF）是由猪瘟病毒（Classical swine fever Virus, CSFV）引起的一种急性、热性、高度接触性传染病，给中国和其他国家养猪业造成了严重危害，被世界动物卫生组织列为必须报告的动物疫病之一[1]。
Bac-to-Bae杆状病毒表达系统在BHK细胞表达鼠IL-2蛋白的研究
Ｇｕｌ ｄ ｃ ｌ ｎ ｖ ｒ ｉ ， ａ ｇ ｉ ４ ０ ４ Ｃ ｉａ ｉ ｎ Ｍｅ ｉａ ｉｅｓｔ Ｇｕ ｎ ｘ １ ０ ， ｈ ｎ ｉ Ｕ ｙ ５
天 津 医药 ２ １ ２月 第 ３ 卷 第 ２ ０ １年 ９ 期
１５ ４
Ｂ ｃｔ Ｂ ｃ ａ—ｏ ａ 杆状病毒表 达系统在 Ｂ Ｋ细胞表达 鼠 Ｉ一 — Ｈ Ｌ２ 蛋 白的研究
黄大林
摘要
戴支凯
王
鑫 李彬彬
钟
江
目的 ： 用 Ｂ ｃ ｔ— ａ 杆状病毒 表达系统在 Ｂ 利 ａ—ｏ Ｂ ｃ ＨＫ细胞表达重组 鼠白细胞介素 （Ｌ 一 蛋 白。 方法 ： Ｆａ Ｉ ）２ 用 ｌ ｇ
Ｗｅ ｔ ｒ ｌｔｔ ｅ ｅ ｔｔ ｅ Ｉ － ｒ ｔ ｉ ．Ｒｅ ｕ ｔ ： ａ ｕｏ ｉ ｓ ｅ ｐ ｅ ｓｏ ｙ ｔ ｍ，ｍｏ ｓ ｅ ｏ ｉ ａ ｔＩ － ｒ ｔ ｉ ａ ｓｅ ｂ ｏ ｏ ｄ ｔ ｃ ｈ Ｌ ２ ｐ ｏ ｅｎ ｎ ｓ ｌ Ｂｙ ｂ ｃ ｌ ｖｒ ｘ ｒ ｓ ｉｎ ｓ ｓｅ ｓ ｕ ｕ ｅ ｒ ｃ ｍｂ ｎ ｎ Ｌ ２ ｐ ｏ ｅｎ ｗ ｓ
标记 鼠Ｉ一 并加入真核细胞启动子 Ｃ Ｌ２ ＭＶ， 构建重组质粒 ｐ Ｂ Ｃ —Ｌ ２ Ｆ — ＭＶ Ｉ一 并予酶切 和 Ｐ Ｒ鉴定 ； 鼠 Ｉ一 克隆入杆状 Ｃ 将 Ｌ２ 病毒表达 载体 ｐ ａｔａＤ ａ 中， ｐ Ｂ Ｃ Ｖ—Ｌ ２ Ｆ ｓ ｃ ｕｌ 将 Ｆ — Ｍ Ｉ一 转化 到含杆状病毒穿 梭载体 Ｂ ｃ ｉ Ｄ ０ ａ 感受态菌 中 ， Ｂ ａｍｄ的 Ｈ１Ｂ ｃ 筛选 阳性克隆 ， 获得重组杆状病毒 载体 Ｂ ｃ ｄ ｐ Ｂ Ｃ —Ｌ ２ 抽提质粒 ； ａｍｉ— Ｆ — ＭＶ Ｉ一 ， 用脂质体转染法将 Ｂ ｃ ｄ ｐ Ｂ Ｃ —Ｌ ２ ａｍｉ— Ｆ — ＭＶ Ｉ一 转 染 Ｓ９ ｆ 昆虫细胞包装 病毒 ， 收获 重组杆状病毒 ， 将构建病毒转 导 Ｂ ＨＫ细胞培养 ， Ｗｅｔ ｎｂｏ检测 Ｉ一 蛋 白。结果 ： 用 ｓ ｒ ｌｔ ｅ Ｌ２ 通过杆状病毒表达 系统 ， Ｂ Ｋ细胞 成功表达重组 的鼠Ｉ一 蛋 白。结论 ： 在 Ｈ Ｌ２ 重组杆状病毒在真核细胞 中成功表达重组
重组蛋白的表达系统详细版
优化培养条件：优化 培养温度、pH、营养 物质等条件，提高重 组蛋白的表达水平。
开发更高效的亲和层析技术，提高目标蛋白的纯度和回收率。 引入连续层析技术，缩短纯化时间和降低成本。 利用蛋白质结晶技术，提高重组蛋白的结晶效率和纯度。 开发新型的蛋白去垢剂和清洗剂，减少对重组蛋白的损害和污染。
添加标题
添加标题
添加标题
添加标题
常用方法：离心、过滤、沉淀、亲 和层析等
注意事项：避免蛋白降解和活性丧 失
重组蛋白用于蛋白质晶体学研究，解析蛋白质结构 重组蛋白表达系统能够高效表达和纯化蛋白质，提高晶体学研究效率 通过重组蛋白表达系统，可以生产具有生物活性的蛋白质，用于药物筛选和开发 重组蛋白表达系统在蛋白质晶体学研究中具有广泛的应用前景，为生命科学研究提供有力支持
载体构建：选择合适的载体分子，将重组DNA分子插入到载体分子中，形成重组载体。
转化：将重组载体导入受体细胞中，使目的基因在受体细胞中复制和表达。
克隆筛选：通过筛选和鉴定，从众多的转化子中选育出含有目的基因的阳性克隆。
宿主细胞类型：原核细胞、真核细胞、昆虫细胞等 选择依据：表达产物的纯度、表达量、安全性等 转化方法：电击法、化学法、显微注射法等 转化后筛选：抗性筛选、互补筛选等
重组蛋白表达系统用于生产抗 体药物
高效、可重复的抗体药物研发 过程
重组蛋白表达系统在抗体药物 研发中的优势
抗体药物的种类和应用领域
用于研究病毒结构、功能和 传播机制
重组蛋白表达系统在疫苗生 产中的应用
用于开发新型疫苗和治疗策 略
提高疫苗产量和纯度，降低 生产成本
用于研究蛋白质 之间的相互作用， 帮助科学家更好 地理解生命活动 的本质和疾病的
发生机制。
Bac-to-Bac杆状病毒表达系统
Bac-to-Bac杆状病毒表达系统试剂盒内容物：Introduction：Overview：Bac-to-Bac杆状病毒表达系统提供快速有效的方法产生重组杆状病毒。
此方法基于让已经转入杆状病的质粒（杆粒）的位点特意转座子的表达框的质粒在Ecoli中扩增。
Bac-to-Bac杆状病毒表达系统主要包括：*pFastBac捐献质粒的选择，它要能够产生包含目的位点的表达结构，这个目的基因的产生被杆状病毒特意位点启动子控制。
*一个Ecoli宿主，DH10Bac，包含杆状病毒质粒（杆粒）和辅助质粒，在转染pFastBac 表达结构后可以产生重组杆粒。
*一个控制表达的质粒，包括Gus和/或CA T基因，以便在感染细胞后产生重组杆状病毒，表达β-葡萄糖酸酐酶和/或氯霉素乙酰转移酶。
Bac-to-Bac表达系统的优点：使用这个系统产生重组杆状病毒较传统的同源重组有以下优点：*与使用同源重组产生重组杆状病毒所需的4-6周相比，鉴别纯化重组病毒少于两周*减少了从斑点筛选重组病毒DNA所包含亲缘和非重组病毒的几率*可以快速同时进行大量重组，适合表达功能性研究的蛋白选择pFastBac菌体（Vector）：大量的pFastBac菌体都适于进行Bac-to-Bac表达系统。
选择对于你的需要最合适的菌体。
指南用途：指南提供了一个对于Bac-to-Bac表达系统的概述，并对以下提供指导：1、克隆目的基因到pFastBac TM供体质粒的选择2、转化pFastBac TM 结构到最高效的DH10Bac TM产生重组质粒3、转染重组质粒DNA到昆虫细胞产生重组杆状病毒4、扩增滴定（Amplify and titer）杆状病毒株，使用病毒株感染昆虫细胞表达目的重组蛋白重要的：Bac-to-Bac杆状病毒表达系统是用来帮助你产生重组杆状病毒，在昆虫细胞中进行高水平表达目的基因的系统。
虽然他可以帮助你很容易的产生杆状病毒表达你的重组蛋白，但是使用这系统更倾向于有杆状病毒生物学和昆虫表达背景的使用者。
昆虫杆状病毒表达系统研究进展及其在疫苗中的应用
体 Ｂ ａ ｃ Ｐ Ａ Ｋ ６的重组 效 率 较高 ， 高 达
８ ０ ％ 以 上 具有 重要 的应 用 价 值 。
杆状 病 毒 载体 系统 另 一 关 键 性 的
关键 词 杆状病毒表达 系统
疫苗
蛋 白表达
改进 是杆状 病毒 穿梭 载体 ｂ ａ ｃ ｍｉ ｄ的 构 建 。 使得 杆状 病 毒 基 因可 以 修 饰 并
中 图分 类 号 ： ￥ ８ ５ ２ ． ４
ห้องสมุดไป่ตู้
文 献标 志 码 ： Ｂ
文章 编号 ： １ ０ ０ ８ － ０ ４ １ ４ （ ２ ０ １ ４ ） １ ０ — ０ ０ ４ ２ － ０ ２
摘 要 昆虫杆状病毒载体表迭 系统作为四 大表达 系统之 一，已广泛应用于
重组 蛋 白的 合 成 。 综 述 了该 病 毒 的基 本 特 性 、 杆 状 病 毒 表 达 载 体 系统 、 该 系统 表 达 的 病 毒 疫 苗等 应 用前 景 。
一
是 通 过 亲 本 病 毒 的 线 性 化 大 大 提 高
（ 四川 省 动 物 疫 病预 防控 制 中心 ， 四川 成 都 ６ １ ０ ０ ４ １ ）
重 组 病 毒 筛 选 效率 。如 Ｐ ｏ ｓ ｓ ｅ ｅ等 设 计
的重 组 一 救 活 可 线性 化 Ａ ｃ Ｎ Ｐ Ｖ 病 毒 载
现该 Ｖ Ｌ Ｐ还 可 以 作 为 多 重 抗 原 表 位 的载体 ， 产 生 佐 剂 的 效用 ㈣。
杆状 病 毒 粒 子 由杆 状 核 衣 壳 和 包 被其 的二 层 脂 蛋 白囊 膜 组 成 ，而 核 衣
壳 则 是 由 衣 壳 蛋 白和 由 病 毒 Ｄ Ｎ Ａ 分
子 与碱 性 蛋 白构 成 的髓 核 组 成 。杆 状
重组杆状病毒表达猪圆环病毒2型Cap蛋白的优化及蛋白免疫原性研究
重组杆状病毒表达猪圆环病毒2型Cap蛋白的优化及蛋白免疫原性研究李天增;潘晓梅;张伟;师小潇;徐龙飞;贺笋【摘要】为获得高蛋白含量和良好免疫原性的抗原,利用杆状病毒表达体系进行猪圆环病毒2型(PCV2)重组Cap蛋白表达,采取正交试验设计确定三因素(High five 细胞浓度、病毒感染量、蛋白表达时间)的最佳组合,对重组病毒株vBac-SP-PCV2的表达条件进行优化,利用His Bind蛋白质纯化试剂盒对表达产物进行纯化,纯化蛋白作为标准蛋白用于Western blotting中蛋白质定量分析和蛋白免疫原性检测.结果显示:2.0×106/mL High five细胞浓度、1.5 MOI病毒感染量、蛋白表达时间168 h为重组PCV2-rCap蛋白表达的最佳条件,表达产物纯化良好,并能被PCV2多克隆抗体识别,免疫豚鼠可诱导产生高水平PCV2抗体.研究表明纯化PCV2-rCap 蛋白可作为标准蛋白用于后续表达蛋白的定量分析和PCV2亚单位疫苗研发候选抗原.【期刊名称】《中国兽药杂志》【年(卷),期】2019(053)008【总页数】6页(P30-35)【关键词】PCV2-rCap蛋白;表达;纯化;免疫原性【作者】李天增;潘晓梅;张伟;师小潇;徐龙飞;贺笋【作者单位】天康生物股份有限公司,乌鲁木齐 830032;天康生物股份有限公司,乌鲁木齐 830032;天康生物股份有限公司,乌鲁木齐 830032;天康生物股份有限公司,乌鲁木齐 830032;天康生物股份有限公司,乌鲁木齐 830032;天康生物股份有限公司,乌鲁木齐 830032【正文语种】中文【中图分类】S852.65猪圆环病毒病 (Porcine circovirus disease，PCVD) 是由猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2，PCV2)引起的猪传染性疾病，自1997年Clark等首次分离PCV2以来，该病已给全世界养猪业造成了巨大的经济损失。
裂谷热病毒Gn1蛋白在杆状病毒系统中的表达与纯化
·研究论文·Chinese Journal of Animal Infectious Diseases中国动物传染病学报摘 要：采用杆状病毒表达系统表达并纯化裂谷热病毒（RVFV ）Gn 蛋白，并对其反应原性进行鉴定。
根据GenBank 公布的Gn 蛋白的序列，选取其主要抗原区Gn1设计引物进行PCR 扩增，将扩增产物克隆至pFastBac HTB 载体，构建重组转移载体，并将其转化DH10Bac 感受态细胞进行蓝白斑筛选。
将鉴定正确的重组杆粒转染Sf9细胞获得重组杆状病毒，经SDS-PAGE 和Western blot 鉴定蛋白正确表达后，将重组杆状病毒感染High5细胞，大量表达重组蛋白，并用镍柱亲和层析法进行纯化，最终获得纯度较高的Gn1重组蛋白。
本研究为 RVF 新型疫苗研发及诊断试剂的研发提供了重要材料。
关键词：裂谷热病毒；Gn1蛋白；重组杆状病毒；蛋白纯化中图分类号：S852.65文献标志码：A文章编号：1674-6422（2022）02-0126-08Expression and Purifi cation of Gn1 Protein of Rift Valley Fever Virus inBaculovirus SystemSUN Xiao 1,2, ZHANG Yanfang 1,2, YE Jing 1,2, CAO Shengbo 1,2, CHEN Zheng 1,2(1. College of Veterinary Medicine, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China; 2. State Key Laboratory of AgriculturalMicrobiology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China)收稿日期：2019-09-26基金项目：“十三五”国家重点研发计划（2017YFD0501803，2016YFD0501102）作者简介：孙潇，男，硕士研究生，预防兽医学专业通信作者：陈政，E-mail：*******************裂谷热病毒Gn1蛋白在杆状病毒系统中的表达与纯化孙 潇1,2，张艳芳1,2，叶 静1,2，曹胜波1,2，陈 政1,2（1.华中农业大学动物医学院，武汉430070；2.华中农业大学 农业微生物学国家重点实验室，武汉430070）2022,30(2): 126-133Abstract: To produce Gn protein of Rift Valley fever virus (RVFV) using Baculovirus expression system and study its reactivity, the main antigen region Gn1 was selected to design primers for PCR amplifi cation according to the Gn sequence published by GenBank. The amplifi ed products were cloned into pFastBac HTB vectors to construct recombinant transfer vectors and then transformed into DH10Bac receptive cells for blue-white screening. The recombinant rods were transfected into Sf9 cells to obtain recombinant baculoviruses. The recombinant baculoviruses were confi rmed in SDS-PAGE and Western blot and used to infect High5 cells. The recombinant Gn1 protein was produced in large quantity and purifi ed by nickel column affi nity chromatography. This study provided important materials for the development of RVF vaccines and diagnostic reagents.Key words: Rift valley fever virus; Gn1 protein; recombinant baculovirus; protein purification· 127 ·孙 潇等：裂谷热病毒Gn1蛋白在杆状病毒系统中的表达与纯化第30卷第2期裂谷热（rift valley fever, RVF）是由裂谷热病毒（Rift valley fever virus, RVFV）感染引起的一种危害严重的人兽共患传染病，可导致反刍动物的大量死亡及人类的致命性出血热。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
Bac–to Bac Bac to–Bac系统重组病毒的构建和基因的表达 to Bac系统重组病毒的构建和基因的表达
3 ：主要操作流程
DH10Bactem.coli感 DH10Bactem.coli感 态细 转化DH10Bactem.coli 转化DH10Bactem.coli 备
提取重组病毒 Sf9细 Sf9细 转 ，复制重组病毒
Sf9细胞转染 细胞转染
1．37℃预热Sf900TM- III SFM培养基； 37℃预热Sf900TMSFM培养基； 预热Sf900TM 培养基 2.准备重组质粒和细胞转染试剂的混合物 准备重组质粒和细胞转染试剂的混合物： 2.准备重组质粒和细胞转染试剂的混合物： 溶解5μl纯化的杆状病毒重组质粒于100μl Sf900TM5μl纯化的杆状病毒重组质粒于 a．溶解5μl纯化的杆状病毒重组质粒于100μl Sf900TMSFM培养基 培养基； III SFM培养基； 转染试剂充分摇匀后取8μl加入100μl Sf900TM8μl加入 b．转染试剂充分摇匀后取8μl加入100μl Sf900TM- III SFM培养基 混匀； 培养基， SFM培养基，混匀； 将上述稀释好的质粒及稀释好的转染剂混匀， c．将上述稀释好的质粒及稀释好的转染剂混匀，室温孵育 20min； 20min；
杆状病毒表达系统的优缺点
优点 对外源基因容量大 适合表达细胞毒性蛋白 安全性且表达产量高 后加工过程完全 可以同时表达多个外源基因 体内表达 缺点 瞬时表达 糖基化简单
2：基本原理
1：目的基因插入转移载体。 目的基因插入转移载体。 2：目的基因转移到病毒基因组靶位点，空斑纯 目的基因转移到病毒基因组靶位点， 化获得重组病毒。 化获得重组病毒。
5.细菌液4℃，4500rpm，离心5min，弃上清； 5.细菌液4℃，4500rpm，离心5min，弃上清； 细菌液4℃ 5min 6.加 MgSO4重悬菌体 冰浴20min 重悬菌体， 20min； 6.加10ml 0.1M MgSO4重悬菌体，冰浴20min； 4℃，4500rpm，离心5min 弃上清； 5min， 7．4℃，4500rpm，离心5min，弃上清； CaCl2+15%甘油 重悬； 甘油， 8. 加10ml 0.1M CaCl2+15%甘油，重悬； 9.200μl每管分装至 每管分装至1.5ml tube管 80℃预冷），-80℃保 预冷）， 9.200μl每管分装至1.5ml tube管（-80℃预冷），-80℃保 存。
直接从昆虫培养细胞和血淋巴中纯化目的蛋白比较困 为纯化常采用下列方法： 难，为纯化常采用下列方法：
(1)在外源基因的前端插入6 His，表达的融合蛋白可通过Ni (1)在外源基因的前端插入6×His，表达的融合蛋白可通过Ni 在外源基因的前端插入 柱进行亲和层析纯化。 柱进行亲和层析纯化。 (2)将谷胱甘肽转移酶基因 GST）导入外源基因前端， 将谷胱甘肽转移酶基因（ (2)将谷胱甘肽转移酶基因（GST）导入外源基因前端，利用 GST能和谷胱甘肽琼脂糖特异结合纯化蛋白 能和谷胱甘肽琼脂糖特异结合纯化蛋白。 GST能和谷胱甘肽琼脂糖特异结合纯化蛋白。 (3)利用抗生物素蛋白与目的蛋白融合表达 利用抗生物素蛋白与目的蛋白融合表达， (3)利用抗生物素蛋白与目的蛋白融合表达，该蛋白与生物素 具有非常高的结合能力，可以对表达产物进行纯化。 具有非常高的结合能力，可以对表达产物进行纯化。
3：重组病毒感染宿主培养细胞或幼虫。 重组病毒感染宿主培养细胞或幼虫。
4：纯化目的蛋白
杆状病毒表达载体的构建
通常由三部分组成： 转移载体 通常由三部分组成： E. coli质粒的复制原点和抗生素抗性基因（如Ampr），保 质粒的复制原点和抗生素抗性基因（ ），保 质粒的复制原点和抗生素抗性基因 证转移载体能在大肠杆菌中扩增。 证转移载体能在大肠杆菌中扩增。 含有一个杆状病毒高效表达基因的启动子，在该启动子下 含有一个杆状病毒高效表达基因的启动子， 插入要表达的外源基因。 插入要表达的外源基因。 启动子上游和外源基因下游则分别含有一段杆状病毒DNA 启动子上游和外源基因下游则分别含有一段杆状病毒 序列，用于与野生病毒DNA同源重组。 同源重组。 序列，用于与野生病毒 同源重组
重组病毒的提取(试剂盒） 重组病毒的提取 试剂盒） 试剂盒
ml离心管收集 离心管收集1 ml菌液 菌液。 rpm离心1min， 离心1min 1 用1.5 ml离心管收集1-5 ml菌液。12,000 rpm离心1min， 弃上清。 弃上清。 加入250 μl溶液 溶液Ⅰ/RNase A混合液 混合液， 2 加入250 μl溶液Ⅰ/RNase A混合液，漩涡剧烈振荡直至 菌体完全重新悬浮。室温静置1 2min。 菌体完全重新悬浮。室温静置1- 2min。 加入250 μl溶液 溶液Ⅱ 轻柔地反复颠倒混匀5 3 加入250 μl溶液Ⅱ，轻柔地反复颠倒混匀5-6次。室温放 min，使菌体充分裂解，直至形成澄清的裂解溶液。 置1-2 min，使菌体充分裂解，直至形成澄清的裂解溶液。 加入300 μl溶液 溶液Ⅲ 立即轻柔地反复颠倒混匀5 4 加入300 μl溶液Ⅲ，立即轻柔地反复颠倒混匀5-6次。此 时会出现白色絮状沉淀。 时会出现白色絮状沉淀
生产重组蛋白
DH10Bactem.coli感受态细胞的制备 感受态细胞的制备
1.取3mlLB液体培养基至15ml无菌离心管，加入3μl 1.取3mlLB液体培养基至15ml无菌离心管，加入3μl 液体培养基至15ml无菌离心管 50mg/ml卡那霉素 kan） 卡那霉素（ l5mg/ml四环素(tet)混匀 四环素(tet)混匀； 50mg/ml卡那霉素（kan）和6μl l5mg/ml四环素(tet)混匀； 2.接种DH10BACTME.coli菌种至上述LB培养基中 接种DH10BACTME.coli菌种至上述LB培养基中， 2.接种DH10BACTME.coli菌种至上述LB培养基中， 37℃,200rpm培养14-16h； 培养14 37℃,200rpm培养14-16h； 3.按1:100取1ml过夜培养的DH10BACTME.coli菌液至 过夜培养的DH10BACTME.coli菌液至100ml 3.按1:100取1ml过夜培养的DH10BACTME.coli菌液至100ml 新鲜LB液体培养基【 LB液体培养基 kan（50mg/ml） 新鲜LB液体培养基【加100μl kan（50mg/ml）和200μl tet （5mg/ml四环素）】，37℃,220rpm，约2h，至OD=0.45mg/ml四环素） 37℃,220rpm， 2h， OD=0.4四环素 0.6； 0.6； 4.上述细菌液转移至50ml无菌离心管 冰浴20min 上述细菌液转移至50ml无菌离心管, 20min， 5min摇 4.上述细菌液转移至50ml无菌离心管,冰浴20min，每5min摇 动一次，同时冰浴上0.1M CaCl2+15%甘油 甘油； 动一次，同时冰浴上0.1M MgSO4,0.1 M CaCl2+15%甘油；
3．Sf9细胞计数,取6孔板，每孔加入1.6×106个细 Sf9细胞计数, 细胞计数 孔板，每孔加入1.6×106个细 1.6 其中一孔设为空白对照) 补加预热的Sf900TM Sf900TM胞(其中一孔设为空白对照)，补加预热的Sf900TMSFM培养基至2ml，混匀，室温静置15min 培养基至2ml 15min， III SFM培养基至2ml，混匀，室温静置15min，使细 胞贴壁；（加第一孔细胞时显微镜下观察细胞密度， ；（加第一孔细胞时显微镜下观察细胞密度 胞贴壁；（加第一孔细胞时显微镜下观察细胞密度， 观察是否符合需求量） 观察是否符合需求量） 重组质粒与转染剂混合液加至六孔板， 4．重组质粒与转染剂混合液加至六孔板，记录质粒 名称； 名称； 27℃湿盒孵育 直到病变现象产生。 湿盒孵育， 5．27℃湿盒孵育，直到病变现象产生。 6.离心 收集上清，保存病毒，细胞沉淀加lysis 离心， 6.离心，收集上清，保存病毒，细胞沉淀加lysis Western检测是否有目的蛋白。 buffer 做Western-blot 检测是否有目的蛋白。
Bac-to-Bac杆状病毒 Bac-to-Bac杆状病毒 表达载体系统生产重 表达载体系统生产重 组蛋白
蛋白组 吴召慧 211211-5-10
主要内容：
1.杆状病毒表达载体系统简介 1.杆状病毒表达载体系统简介 杆状病毒表达载体系统
2.基本原理 2.基本原理
3.主要操作流程 3.主要操作流程
1：杆状病毒表达载体系统简介 杆状病毒表达载体系统简介
杆状病毒表达载体系统主要包括苜蓿银纹夜蛾核型多角 体病毒 （Autographa californica multiple nuclear polyhedrosis virus， AcMNPV ）表达系统和家蚕核型多 ， 角体病毒（ 角体病毒（Bombyx mori nuclear polyhedrosisi virus, BmNPV ）表达系统。 表达系统。 杆状病毒科分为包含体病毒亚科（Eubaculovirinae）和 杆状病毒科分为包含体病毒亚科（ ） 非包含体病毒亚科（ ），包含体病毒 非包含体病毒亚科（Nudibaculovirinae），包含体病毒 ）， 亚科分为核型多角体病毒属（ 亚科分为核型多角体病毒属（NPV）和颗粒体病毒属 ） （GV） ）
杆状病毒表达系统（ 杆状病毒表达系统（Baculovirus expression vector system，BEVS）是利用携带有外源目的基因的重组杆状 ， ） 病毒作载体， 病毒作载体，在昆虫体内或其培养细胞内进行表达的一 个重组蛋白生产系统 。
杆状病毒表达载体系统的建立和发展,被誉为 世纪80 杆状病毒表达载体系统的建立和发展 被誉为20 世纪 被誉为 年代真核表达研究领域的一个重大进展， 年代真核表达研究领域的一个重大进展，现已成为基因 工程四大表达系统(即杆状病毒、大肠杆菌、酵母、哺乳 工程四大表达系统 即杆状病毒、大肠杆菌、酵母、 即杆状病毒 动物细胞表达系统)之一 动物细胞表达系统 之一 。