杆状病毒表达载体系统生产重组蛋白

杆状病毒表达系统的优缺点
优点 对外源基因容量大 适合表达细胞毒性蛋白 安全性且表达产量高 后加工过程完全 可以同时表达多个外源基因 体内表达 缺点 瞬时表达 糖基化简单
2：基本原理
1：目的基因插入转移载体。 目的基因插入转移载体。 2：目的基因转移到病毒基因组靶位点，空斑纯 目的基因转移到病毒基因组靶位点， 化获得重组病毒。 化获得重组病毒。
杆状病毒表达系统（ 杆状病毒表达系统（Baculovirus expression vector system，BEVS）是利用携带有外源目的基因的重组杆状 ， ） 病毒作载体， 病毒作载体，在昆虫体内或其培养细胞内进行表达的一 个重组蛋白生产系统 。
杆状病毒表达载体系统的建立和发展,被誉为 世纪80 杆状病毒表达载体系统的建立和发展 被誉为20 世纪 被誉为 年代真核表达研究领域的一个重大进展， 年代真核表达研究领域的一个重大进展，现已成为基因 工程四大表达系统(即杆状病毒、大肠杆菌、酵母、哺乳 工程四大表达系统 即杆状病毒、大肠杆菌、酵母、 即杆状病毒 动物细胞表达系统)之一 动物细胞表达系统 之一 。
3．Sf9细胞计数,取6孔板，每孔加入1.6×106个细 Sf9细胞计数, 细胞计数 孔板，每孔加入1.6×106个细 1.6 其中一孔设为空白对照) 补加预热的Sf900TM Sf900TM胞(其中一孔设为空白对照)，补加预热的Sf900TMSFM培养基至2ml，混匀，室温静置15min 培养基至2ml 15min， III SFM培养基至2ml，混匀，室温静置15min，使细 胞贴壁；（加第一孔细胞时显微镜下观察细胞密度， ；（加第一孔细胞时显微镜下观察细胞密度 胞贴壁；（加第一孔细胞时显微镜下观察细胞密度， 观察是否符合需求量） 观察是否符合需求量） 重组质粒与转染剂混合液加至六孔板， 4．重组质粒与转染剂混合液加至六孔板，记录质粒 名称； 名称； 27℃湿盒孵育 直到病变现象产生。 湿盒孵育， 5．27℃湿盒孵育，直到病变现象产生。 6.离心 收集上清，保存病毒，细胞沉淀加lysis 离心， 6.离心，收集上清，保存病毒，细胞沉淀加lysis Western检测是否有目的蛋白。 buffer 做Western-blot 检测是否有目的蛋白。
Bac-to-Bac杆状病毒 Bac-to-Bac杆状病毒 表达载体系统生产重 表达载体系统生产重 组蛋白
蛋白组 吴召慧 211211-5-10
主要内容：
1.杆状病毒表达载体系统简介 1.杆状病毒表达载体系统简介 杆状病毒表达载体系统
2.基本原理 2.基本原理
3.主要操作流程 3.主要操作流程
1：杆状病毒表达载体系统简介 杆状病毒表达载体系统简介
直接从昆虫培养细胞和血淋巴中纯化目的蛋白比较困 为纯化常采用下列方法： 难，为纯化常采用下列方法：
(1)在外源基因的前端插入6 His，表达的融合蛋白可通过Ni (1)在外源基因的前端插入6×His，表达的融合蛋白可通过Ni 在外源基因的前端插入 柱进行亲和层析纯化。 柱进行亲和层析纯化。 (2)将谷胱甘肽转移酶基因 GST）导入外源基因前端， 将谷胱甘肽转移酶基因（ (2)将谷胱甘肽转移酶基因（GST）导入外源基因前端，利用 GST能和谷胱甘肽琼脂糖特异结合纯化蛋白 能和谷胱甘肽琼脂糖特异结合纯化蛋白。 GST能和谷胱甘肽琼脂糖特异结合纯化蛋白。 (3)利用抗生物素蛋白与目的蛋白融合表达 利用抗生物素蛋白与目的蛋白融合表达， (3)利用抗生物素蛋白与目的蛋白融合表达，该蛋白与生物素 具有非常高的结合能力，可以对表达产物进行纯化。 具有非常高的结合能力，可以对表达产物进行纯化。
转化DH10BACTME.coli 转化
1.冰上融化DH10BACTM E.coli感受态细胞 感受态细胞（ 5min）； 1.冰上融化DH10BACTM E.coli感受态细胞（约5min）； 冰上融化 2.取 pFastbac-重组质粒至DH10BACTM E.coli感受态 2.取1ng pFastbac-重组质粒至DH10BACTM E.coli感受态 细胞轻弹两下混匀，冰上静置30min 30min； 细胞轻弹两下混匀，冰上静置30min； 3.42℃热击45秒 立即转移至冰上冰浴2min 热击45 2min； 3.42℃热击45秒；立即转移至冰上冰浴2min； 4.加800μl室温预热的LB培养基 37℃,220rpm，4h； 室温预热的LB培养基， 4.加800μl室温预热的LB培养基，37℃,220rpm，4h 5.涂布至LB琼脂平板 涂布至LB琼脂平板（ Kan,Tet,Gen） 5.涂布至LB琼脂平板（含Kan,Tet,Gen）, 6.挑取白色菌落接种至5mLLB液体培养基 抗生素如上）， 挑取白色菌落接种至5mLLB液体培养基（ 6.挑取白色菌落接种至5mLLB液体培养基（抗生素如上）， 37℃培养过夜 培养过夜。 37℃培养过夜。 7.保种 保种， 7.保种，提重组质粒
杆状病毒表达载体系统主要包括苜蓿银纹夜蛾核型多角 体病毒 （Autographa californica multiple nuclear polyhedrosis virus， AcMNPV ）表达系统和家蚕核型多 ， 角体病毒（ 角体病毒（Bombyx mori nuclear polyhedrosisi virus, BmNPV ）表达系统。 表达系统。 杆状病毒科分为包含体病毒亚科（EubaculovirBaidu Nhomakorabeanae）和 杆状病毒科分为包含体病毒亚科（ ） 非包含体病毒亚科（ ），包含体病毒 非包含体病毒亚科（Nudibaculovirinae），包含体病毒 ）， 亚科分为核型多角体病毒属（ 亚科分为核型多角体病毒属（NPV）和颗粒体病毒属 ） （GV） ）
Bac–to Bac Bac to–Bac系统重组病毒的构建和基因的表达 to Bac系统重组病毒的构建和基因的表达
3 ：主要操作流程
DH10Bactem.coli感 DH10Bactem.coli感 态细 转化DH10Bactem.coli 转化DH10Bactem.coli 备
提取重组病毒 Sf9细 Sf9细 转 ，复制重组病毒
3：重组病毒感染宿主培养细胞或幼虫。 重组病毒感染宿主培养细胞或幼虫。
4：纯化目的蛋白
杆状病毒表达载体的构建
通常由三部分组成： 转移载体 通常由三部分组成： E. coli质粒的复制原点和抗生素抗性基因（如Ampr），保 质粒的复制原点和抗生素抗性基因（ ），保 质粒的复制原点和抗生素抗性基因 证转移载体能在大肠杆菌中扩增。 证转移载体能在大肠杆菌中扩增。 含有一个杆状病毒高效表达基因的启动子，在该启动子下 含有一个杆状病毒高效表达基因的启动子， 插入要表达的外源基因。 插入要表达的外源基因。 启动子上游和外源基因下游则分别含有一段杆状病毒DNA 启动子上游和外源基因下游则分别含有一段杆状病毒 序列，用于与野生病毒DNA同源重组。 同源重组。 序列，用于与野生病毒 同源重组
生产重组蛋白
DH10Bactem.coli感受态细胞的制备 感受态细胞的制备
1.取3mlLB液体培养基至15ml无菌离心管，加入3μl 1.取3mlLB液体培养基至15ml无菌离心管，加入3μl 液体培养基至15ml无菌离心管 50mg/ml卡那霉素 kan） 卡那霉素（ l5mg/ml四环素(tet)混匀 四环素(tet)混匀； 50mg/ml卡那霉素（kan）和6μl l5mg/ml四环素(tet)混匀； 2.接种DH10BACTME.coli菌种至上述LB培养基中 接种DH10BACTME.coli菌种至上述LB培养基中， 2.接种DH10BACTME.coli菌种至上述LB培养基中， 37℃,200rpm培养14-16h； 培养14 37℃,200rpm培养14-16h； 3.按1:100取1ml过夜培养的DH10BACTME.coli菌液至 过夜培养的DH10BACTME.coli菌液至100ml 3.按1:100取1ml过夜培养的DH10BACTME.coli菌液至100ml 新鲜LB液体培养基【 LB液体培养基 kan（50mg/ml） 新鲜LB液体培养基【加100μl kan（50mg/ml）和200μl tet （5mg/ml四环素）】，37℃,220rpm，约2h，至OD=0.45mg/ml四环素） 37℃,220rpm， 2h， OD=0.4四环素 0.6； 0.6； 4.上述细菌液转移至50ml无菌离心管 冰浴20min 上述细菌液转移至50ml无菌离心管, 20min， 5min摇 4.上述细菌液转移至50ml无菌离心管,冰浴20min，每5min摇 动一次，同时冰浴上0.1M CaCl2+15%甘油 甘油； 动一次，同时冰浴上0.1M MgSO4,0.1 M CaCl2+15%甘油；
重组病毒的提取(试剂盒） 重组病毒的提取 试剂盒） 试剂盒
ml离心管收集 离心管收集1 ml菌液 菌液。 rpm离心1min， 离心1min 1 用1.5 ml离心管收集1-5 ml菌液。12,000 rpm离心1min， 弃上清。 弃上清。 加入250 μl溶液 溶液Ⅰ/RNase A混合液 混合液， 2 加入250 μl溶液Ⅰ/RNase A混合液，漩涡剧烈振荡直至 菌体完全重新悬浮。室温静置1 2min。 菌体完全重新悬浮。室温静置1- 2min。 加入250 μl溶液 溶液Ⅱ 轻柔地反复颠倒混匀5 3 加入250 μl溶液Ⅱ，轻柔地反复颠倒混匀5-6次。室温放 min，使菌体充分裂解，直至形成澄清的裂解溶液。 置1-2 min，使菌体充分裂解，直至形成澄清的裂解溶液。 加入300 μl溶液 溶液Ⅲ 立即轻柔地反复颠倒混匀5 4 加入300 μl溶液Ⅲ，立即轻柔地反复颠倒混匀5-6次。此 时会出现白色絮状沉淀。 时会出现白色絮状沉淀
Sf9细胞转染 细胞转染
1．37℃预热Sf900TM- III SFM培养基； 37℃预热Sf900TMSFM培养基； 预热Sf900TM 培养基 2.准备重组质粒和细胞转染试剂的混合物 准备重组质粒和细胞转染试剂的混合物： 2.准备重组质粒和细胞转染试剂的混合物： 溶解5μl纯化的杆状病毒重组质粒于100μl Sf900TM5μl纯化的杆状病毒重组质粒于 a．溶解5μl纯化的杆状病毒重组质粒于100μl Sf900TMSFM培养基 培养基； III SFM培养基； 转染试剂充分摇匀后取8μl加入100μl Sf900TM8μl加入 b．转染试剂充分摇匀后取8μl加入100μl Sf900TM- III SFM培养基 混匀； 培养基， SFM培养基，混匀； 将上述稀释好的质粒及稀释好的转染剂混匀， c．将上述稀释好的质粒及稀释好的转染剂混匀，室温孵育 20min； 20min；
5.细菌液4℃，4500rpm，离心5min，弃上清； 5.细菌液4℃，4500rpm，离心5min，弃上清； 细菌液4℃ 5min 6.加 MgSO4重悬菌体 冰浴20min 重悬菌体， 20min； 6.加10ml 0.1M MgSO4重悬菌体，冰浴20min； 4℃，4500rpm，离心5min 弃上清； 5min， 7．4℃，4500rpm，离心5min，弃上清； CaCl2+15%甘油 重悬； 甘油， 8. 加10ml 0.1M CaCl2+15%甘油，重悬； 9.200μl每管分装至 每管分装至1.5ml tube管 80℃预冷），-80℃保 预冷）， 9.200μl每管分装至1.5ml tube管（-80℃预冷），-80℃保 存。
室温离心15min 收集上清。 15min， 5 12,000 rpm 室温离心15min，收集上清。 加入800ul异丙醇，混匀至有沉淀出现。 800ul异丙醇 6 加入800ul异丙醇，混匀至有沉淀出现。 室温，离心15 min，弃上清。 7 12,000 rpm 室温，离心15 min，弃上清。 加入800ul w2洗涤 洗涤, 室温离心1min 1min， 8 加入800ul buffer w2洗涤, 12,000 rpm 室温离心1min， 弃滤液。重复洗涤一次。 弃滤液。重复洗涤一次。 室温或风干DNA 加入50 80ulEluent溶液 DNA， 50溶液， 9 室温或风干DNA，加入50-80ulEluent溶液，冰上溶解 4℃保存 保存。 10min ，4℃保存。