IHNV核衣壳蛋白在杆状病毒表达系统中的表达及鉴定
IHNV核衣壳蛋白在杆状病毒表达系统中的表达及鉴定
IHNV 核衣壳蛋白在杆状病毒表达系统中 的表达及鉴定
1， 2 1 2 谢三磊 ， 王雯慧 ， 孙惠玲 （ 1． 甘肃农业大学 动物医学院， 甘肃 兰州 730070； 2． 北京市农林科学院 畜牧兽医研究所， 畜禽疫病防控技术北京市重点实验室， 北京 100097）
Expression and Identification of Nucleocapsid Protein of IHNV in Baculovirus Expression System
2 XIE Sanlei1， ， WANG Wenhui1 ， SUN Huiling2
（ 1． College of Veterinary Medicine， Gansu Agricultural University， Lanzhou 730070， China； 2． Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine， Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences， Beijing 100097， China） Abstract： To study the major structural nucleoprotein （ N ） of infectious hematopoietic necrosis virus （ IHNV ） by baculovirus systems， in this study nucleoprotein （ N） gene（ 1 176 bp） was amplified by ＲTPCＲ from infectious hematopoietic necrosis virus （ IHNV） and inserted into the baculovirus vector pFBLICBse to construct a recombinant plasmid pFBLICBseN． The constructed recombinant transposition plasmid pFBLICBseN was transformed to competent E． coli DH10Bac to get recombinant bacmids rBacmidN． The obtained recombinant bacmid rBacmidN was transfected to insect Sf9 cells， and the recombinant baculovirus that contained N gene was obtained． IFA and Western Blot analysis showed that the recombinant N protein can be recognized by horseradish peroxidase （ HＲP ） labeled histidine monoclonal antibody （ antiHis） which indicated IHNV N gene has been successfully expressed in Sf9 cells infected with recombinant baculovirus． The study laid a foundation of further study on N protein structure ， function and immunological characteristics． Key words： Infectious hematopoietic necrosis virus； N gene； Ｒecombinant baculovirus 传染性造血器官坏死病（ Infectious haematopoietic necrosis， IHN ） 是鲑、 鳟鱼类的一种以造血组织 严重坏死、 显著贫血、 肝、 脾、 肾褪色为主要特征的传 染性疾病。不同种类鲑、 鳟鱼类对病原的易感性不 同。病原为传染性造血器官坏死病病毒 （ Infectious haematopoietic necrosis virus， IHNV ） ， 属弹状病毒科 （ Novirhabdovirus ） ， 的粒弹状病毒属 同属的水生动 物病毒还有病毒性出血性败血症病毒 （ Viral haemorrhagic septicaemia ， VHSV ） 、 牙鲆弹状病毒 （ Hirame rhabdovirus， HＲV） 和鳢弹状病毒 （ Snakehead Ｒhabdovirus， SＲV） 。IHNV 是该属的代表种， IHNV 的代 1392 ） 。病毒粒 表株是 WＲAC 株（ ATCC 编码为 VＲ子形态为弹状， 直径约 80 ～ 90 nm， 长度为 160 ～ 180
禽偏肺病毒C型核衣壳N蛋白的哺乳动物细胞表达系统表达及鉴定
ＬＩ Ｚｉｘｕａｎ１，２，ＷＥＩ Ｌｉ ２，ＷＡＮＧ Ｊｉｎｇ２，ＺＨＵ Ｓｈａｎｓｈａｎ２，ＺＨＡＮＧ Ｃｈｕｎｙａｎ２，ＬＩＵ Ｓｈｕｈａｎｇ１， ＱＵＡＮ Ｒｏｎｇ２，ＹＡＮ Ｘｕ２，ＣＨＥＮ Ｗｕ１，ＬＩＵ Ｊｕｅ２＊
收 稿 日 期 ：２０１４－０５－１２； 网 络 出 版 时 间 ：２０１４－０５－３０ ２０：２２ 基金项目：பைடு நூலகம்家现代农业产业技术体系 （ＣＡＲＳ－４２） 作者简介：李子璇 （１９８８－），女，硕士研究生，主要动物病毒蛋白表达方面的研究，Ｅ－ｍａｉｌ：ｘ２０６３２１０２＠１６３．ｃｏｍ，
１．４ ｐＥＧＦＰ－Ｃ１－Ｎ 重 组 真 核 表 达 载 体 的 构 建 及 鉴 定 将 回 收 的 ＰＣＲ 产 物 及 载 体 分 别 用 ＥｃｏＲＩ和 ＸｈｏｌＩ进 行 双 酶 切，将 酶 切 后 载 体 进 行 去 磷 酸 化 处 理，用 ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ （Ｑｉａｇｅｎ）试 剂盒对酶切产物 进 行 纯 化 回 收。 纯 化 回 收 的 ｐＥＧ－ ＦＰ－Ｃ１载体 与 ＰＣＲ 片 段 以 １∶７ 的 比 例 按 照 Ｔ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ公 司）说 明 书 进 行 连 接，用 重组质粒转化大肠杆 菌 ＤＨ５（宿 主 菌。 挑 取 ５～１０ 个菌 落 进 行 菌 液 ＰＣＲ 鉴 定。 用 Ｅ．Ｚ．Ｎ．Ａ．Ｐｌａｓ－ ｍｉｄ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＯＭＥＧＡ 公司）试剂盒提取阳性克隆 质粒，进行 ＥｃｏＲＩ和 ＸｈｏｌＩ双酶切鉴定。 １．５ 转染 ＢＨＫ－２１细胞 用 ＰｕｒｅＬｉｎｋ ＨｉＰｕｒｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍａｘｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）试剂盒 大 量 抽 提 细 胞 转 染 用 的 去 除 内 毒素的 重 组 质 粒 以 及 ｐＥＧＦＰ－Ｃ１ 载 体 质 粒。 得 到 的重组质 粒 及 对 照 组 ｐＥＧＦＰ－Ｃ１ 载 体 质 粒 的 浓 度 为２ ３２６ｎｇ／μＬ 和 １ ３１７ｎｇ／μＬ。 将 生 长 状 态 良 好
兔出血症病毒衣壳蛋白VP60在杆状病毒表达系统中的表达及细胞内定位
ｐｏ ｉ Ｐ ０ｏ Ｈ Ｖｉ ｆ ｅｌ ｈ ｓｌ ｄｒｃ ｉ ｎ ｏｕ ｒｓｅｃ ｓａ ＩＡ）ａｄＷｅｔｒ ｌ ｎｌ ｒｔ ｎＶ ６ ｆ Ｄ Ｓ９ｃｌ ．Ｔ ｅｒ ｕｔ ｏ ｉ ｉ ｔｍｍ ｕｆ ｏｅｃｎｅａｓｙ（Ｆ ｅ Ｒ ｎ ｓ ｅ ｓ ｆｎ ｅ ｌ ｎ ｓ ｎｂｏ ａａ— ｅ ｔ
摘
要 ： 了探讨兔 出血症病 毒（ Ｈ Ｖ） 壳蛋 白的细胞 内定位 ， 为 Ｒ Ｄ 衣 利用杆 状病毒 表达 系统 构建 了表达 Ｒ Ｄ Ｈ Ｖ
结构蛋 白（ Ｐｏ 的重组杆状病毒 。间接 免疫荧 光 （Ｆ 和 Ｗｅｔ ｎｂｏ检 测以及 电子显 微镜观察 结果表 明 ， ｖ６） ＩＡ） ｓ ｒ ｌｔ ｅ Ｖ６ Ｐ ０不仅能在 昆虫细胞 中正确表达 ， 而且 能 自组装形成病毒样颗粒 （ Ｌ ｓ 。进 一步对表达蛋 白进行 细胞 内 Ｖ Ｐ）
定位观察发现 ， 表达蛋 白定 位于Ｓ９ ｆ细胞 的细胞膜 上。 关键词 ： 兔出血症病毒 ； 结构蛋 白； 昆虫一杆状病毒表达 系统 ； 细胞 内定位
中 图分 类 号 ：８ ２ ６ ￥ ５ ．５ 文献标识码 ： Ａ 文 章编 号 ：０４—１２ （ ００）２— １５—０ １０ ５４ ２ １ ０ ０ ３ ５
Ｅｘｐ ｅ ｓｏ ｎ ｌ ｃ ｌｚ ｔｏ ｎ ｌ ｓｓ ｏ ｒ ｓ ｉ ｎ ａ ｄ ｏ ａ ｉ ａ ｉ ｎ ａ ａ ｙ ｉ ｆ ＶＰ６ ｏ ｅ ｎ ｏ ｂ ｔｈｅ ｒ ｈａ ｃ ｄ ｓ ０ ｐｒ ｔ ｉ ｆＲａ ｂｉ ｍｏ ｒ ｇｉ ｉ— ｅ ｓ ｉｕ ｎ ｉ ｅ ｔｃ ｌ ． ｃ ｌ ｖ ｒ ｘ ｅ ｓｏ ｙ ｔ ｍ ａ ｅ ｖｒ ｓ ｉ ｎｓ ｃ ｅ ｌ ｂａ ｕ ｏ ｉｕｓ ｅ ｐｒ ｓ ｉ ｎ ｓ ｓ ｅ ｓ
ｔ ｔｈｒ ｅ ｍｅ ｉ ｓｌ ｅｐｒｃ ｓ（ Ｌ ｓ ｏ ｄｉ Ｓ９ｃｌ ， ｎ ｒ ｅ ｒｓｌ ｆ ｏｆｃｌ ｉｒｓｏｙｉｄ— ｈ ｅ ｗ ｒ ｓ ｒ —ｋ ａｔ ｌ Ｖ Ｐ ）ｆ ｍｅ ｆ ｅ ｓ ａ ｄｆ ｔ ｒ ｅｕ ｓ ｎｏａ ｍ ｃｏｃｐ ｉ ａ ｔ ｅ ｅ ｏ ｖｕ ｉ ｉｅ ｒ ｎ ｌ ｕ ｈ ｔｏｅ ｎ
应用杆状病毒表达系统有效表达PEDV_纤突蛋白
山西农业科学2022，50（5）：714-719Journal of Shanxi Agricultural Sciences doi:10.3969/j.issn.1002-2481.2022.05.15doi应用杆状病毒表达系统有效表达PEDV纤突蛋白郝建伟1，薛春宜2，曹永长2（1.晋中学院生物科学与技术系，山西晋中030600；2.中山大学生命科学学院/有害生物控制与资源利用国家重点实验室，广东广州510006）摘要：为了解决猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）变异毒株纤突蛋白（S蛋白）分子质量大、难以表达的问题，研究采用Signal4.0软件预测S蛋白信号肽，构建表达替换信号肽S蛋白的重组质粒，鉴定正确后重组质粒转化DH10Bac感受态细胞并进行蓝白斑筛选，挑取白斑进行菌落PCR检测，检测无误后提取Bacmid DNA转染Sf9细胞，制备重组杆状病毒。
采用杆状病毒表达系统表达目的蛋白，采用免疫印迹法（West⁃ern blot）和串联式飞行时间质谱（MALDI-TOF-TOF）技术鉴定表达蛋白，采用SDS-PAGE半定量方法测定蛋白含量；以Balb/c小鼠为材料进行免疫试验，应用中和试验、ELISPOT试验测定小鼠抗体滴度及细胞因子水平。
结果表明，S蛋白氨基端20个氨基酸为蛋白信号肽，重组质粒经双酶切鉴定构建成功，经菌体PCR检测验证表达骨架构建完成，转染Sf9细胞后获得重组病毒rB-PEDV-S；重组病毒表达蛋白经Western-blot和MALDI-TOF-TOF鉴定为目的蛋白，蛋白质量浓度可达0.0086μg/μL；替换原有信号肽可有效提高S蛋白产量，以0.86μg/只剂量免疫小鼠后，可刺激小鼠产生IL-4，但血清抗体水平与PBS组无明显差异。
替换信号肽有助于S蛋白表达，利用表达蛋白免疫小鼠可有效刺激IL-4产生。
关键词：猪流行性腹泻病毒（PEDV）；杆状病毒；免疫印迹法；串联式飞行时间质谱；蛋白表达；疫苗中图分类号：S858.28文献标识码：A文章编号：1002‒2481（2022）05‒0714‒06Effective Expression of Spike Protein of PEDV with Expression System of Bac-to-BacHAO Jianwei1，XUE Chunyi2，CAO Yongchang2（1.Department of Biological Science and Technology，Jinzhong University，Jinzhong030600，China；2.School of Life Sciences，State Key Laboratory of Biocontrol，Sun Yat-sen University，Guangzhou510006，China）Abstract：In order to solve the problem of large molecular weight and difficult expression of spike protein(S protein)of the mutant strain of porcine epidemic diarrhea virus(PEDV),in this study,the S protein signal peptide was predicted by Signal software(Version4.0),and the recombinant plasmid expressing the replacement of signal peptide S protein was constructed. Then the recombinant plasmid was transfected into DH10bac competent cells after identification,the white-blue plaque selection tests were conducted,and white spots were selected for further colony PCR detection.After the detection was confirmed,the Bacmid DNA was extracted and transfected into Sf9cells to prepare recombinant baculovirus.The target protein was expressed by baculovirus expression system and the expressed protein was identified by Western blot and MALDI-TOF-TOF methods The protein content was determined by SDS-PAGE semi quantitative method.Balb/c mice were used for immune experiment. The neutralization experiment and ELISPOT experiment were to determine the antibody titer and cytokine level.The results showed that the20amino acids in the amino terminal of S protein were protein signal peptides.The recombinant plasmid was successfully constructed through identification by double enzyme digestion.The bacteria PCR detection confirmed that the construction of the expression skeleton was completed,then,the recombinant virus rB-PEDV-S was obtained after transfected into Sf9cells.The protein expressed by the recombinant virus was identified as the target protein by verification of Western blot and MALDI-TOF-TOF,and the protein concentration was0.0086μg/μL,which showed that replacing the original signal peptide would effectively increase the yield of S protein.Immunization of mice by the S protein with the dosage of0.86μg/mice could stimulate mice to produce IL-4,but there was no significant differences between serum antibody level and that in PBS groups.The results proved that replacement of signal peptide contributed to the expression of S protein,and immunization of mice with the expressed protein could effectively stimulate production of IL-4.Key words：Porcine epidemic diarrhea（PEDV）;baculovirus;Western-blot;MALDI-TOF-TOF;expression of protein;收稿日期：2021-12-15基金项目：“十三五”重点研发计划项目（2016YFD0500101）作者简介：郝建伟（1983-），男，山西大同人，高级兽医师，博士，主要从事动物病毒学研究工作。
传染性造血器官坏死病毒(IHNV)研究进展
传染性造血器官坏死病毒（IHNV）研究进展摘要对IHNV的特点、发病症状及流行特点进行了简单的概述，详细归纳总结了IHNV的检测技术、宿主对IHNV的防御机制以及具体防治措施，同时对IHNV未来的防治发展方向进行了展望，以期更好地控制IHNV引起的鱼类流行病的发生。
Abstract The characteristics，symptoms and epidemic characteristics of IHNV were surveyed，the diagnosis of IHNV，defense mechanism and control measures of host were summarized.Meanwhile，developing direction of control methods of IHNV in the future were expected in order to better control the epidemic of fish caused by IHNV.Key words IHNV；biological characteristics；epidemic characteristics；diagnosis；control传染性造血器官坏死病毒（Infectious Hematopoietic Nec-rosis Virus，IHNV），隶属于弹状病毒科诺拉弹状病毒属，是传染性造血器官坏死病（Infectious Hematopoietic Necrosis，IHN）的病原体。
IHN是鲑鳟鱼类的一种严重的急性、传染性病毒病[1]，根据鱼的种类、年龄、病毒株系以及环境条件的不同，IHN 的爆发可能导致鱼体80%～100%的死亡率[2]，对世界鲑鱼养殖业造成了重大损失。
目前已成为制约鲑鱼养殖发展的重要威胁，由于其发病急、发病率高，已被国际兽医局OIE（Office International Des Epizooties）列为必须申报的疾病，被我国列为二类疫病。
杆状病毒包涵体蛋白的共同抗原性
应用与环境生物学报 2008，14 ( 6 ): 787~792Chin J Appl Environ Biol=ISSN 1006-687X2008-12-25DOI: 10.3724/SP.J.1145.2008.00787杆状病毒是一类专一感染节肢动物(主要为鳞翅目、膜翅目和双翅目昆虫)的病原微生物[1]. 杆状病毒的感染具有宿主特异性，而且它们对人、畜以及其他脊椎动物无害，所以早在1973年就被联合国粮农组织和世界卫生组织推荐作为化学农药的理想替代品. 到目前为止，全球已有数十种杆状病毒被开发为商品杀虫剂. 在我国，已发现200多株昆虫杆状病毒，有20多种杆状病毒被研制成杀虫剂，并先后进入大田应用实验和商业化生产. 其中应用面积较大的有棉铃虫核型多角体病毒、斜纹夜蛾核型多角体病毒、茶毛虫核型多角体病毒和甜菜夜蛾核型多角体病毒等[2]. 昆虫病毒杀虫剂已成为国内外生物农药研究和开发十分活跃的领域之一.杆状病毒的典型结构特征是病毒粒子包埋于蛋白质基质的包涵体中. 根据包涵体的形态和病毒诱导的细胞病理学特征，杆状病毒分为核多角体病毒属(����������������������������������������，�PV)和颗粒体病毒属(������������������������，�V)，它们的包涵体基质蛋白分别为�PV 的多角体蛋白(P���������)P���������)或�V 的颗粒体蛋白(��������).��������). 包涵体蛋白在不同的杆状病毒中具有高度保守性[3]，但多角体蛋白与颗粒体蛋白之间在氨基酸序列的保守程度上要明显低于多角体蛋白之间或颗粒体蛋白之间的保守程度[4, 5]. 刘子夜等根据杆状病毒包涵体蛋白的高度保守性，推测不同来源的包涵体蛋白间可能广泛存在血清学交叉反应[6]. 如果杆状病毒包涵体蛋白间普遍存在共同抗原性，将为利用免疫层析检测技术快速检测不同种类杆状病毒的浓度提供可能性.为了研究不同杆状病毒的包涵体蛋白(特别是高度保守区)之间是否具有共同抗原性，本文选择了棉铃虫核型多角体病毒(Heliocoverpa armigera ��������������������, H��PV)多角体蛋白的两个高度保守区，检测了它们与多种杆状病毒包涵体蛋白之间的血清学交叉反应，为研制检测不同病毒杀杆状病毒包涵体蛋白的共同抗原性*刘彩云 刘金瑾 汤显春 张忠信 彭辉银 孙修炼**(中国科学院武汉病毒研究所病毒学国家重点实验室 武汉 430071)Occlusion Body Proteins of Baculoviruses Sharing Common Epitopes *LIU C�����, LIU J��j��, TA�� X�������, ZHA�� Z���gx��, PE�� H����� & SU� X������**(State Key Laboratory of Virology, Wuhan Institute of Virology, Chinese Academy of Sciences, W���� 430071, C����)Abstract �������������g������������������������������������������������������� �� ��� ���g�������g����� ��� ��� ��������� ����� ���� ��������� ��� ������������������������37�������������,��������� ���� �������� ��� 37 �������������,�������������, �w� ��g��� ��������� ��g���� ����g ��� ��������w���������.T�����������������������g���������w���g�������������������� w��� ������. T�� ���������� ���������� �g����� ��� �w� ��g��� ��������� �������� (54-113�� ��� 206-245��) ��� ���������� ��� Heliocoverpa armigera �������������������� (H��PV) w��� ������. T�� ������g���� ������������� ���w��� ��� �w� �������� ��� ��� ��������� ���� �������� ��� ����� ����������� w��� �������g���� �� ����g W������ �������g. T�� ������� �������� ���� ���� ��� ��� �w� �������� ��� H��PV ���������� w�� ���� �� �� �������z�� w��� ���� ��� ��� ��������������14�������������������������g�����������5g�������������,���������g ��������������������������� ��� 14 ���������������������� ��� g�������� ��� 5 g�������������, ���������g ���� ��� ��������� ���� �������� ��� ����������� ������������� ������ ������ ��������. F����������, ��� ������������ ��� ���������g � ��������� ���� ������������� ��� ��� ��������� ���� �������������� �� ����� ���������� �� ����g C�������� ���� S������ �� ��������� ����� �� ��� ������� ��������� �� ���� �����. F�g 7, R��� 9Keywords �����������; Heliocoverpa armigera ��������������������; ��������� ���� �������; ��g�������������������;��g��� ��������� �������;W������ ����; ������������������� �������CLC S476.13 : Q936收稿日期:2007-11-01 2007-11-01 修回日期: 2007-12-20*国家“863”计划项目(2006AA10A210)2006AA10A210)和中国科学院知识创新工程重要方向项目资助 S�������� �� ��� “863” P��j��� ����� M������� ��� S������ & T�������g� ��� C���� (2006AA10A210) ��� ��� K��w���g� I��������� P��g��� ��� ��� C������ A������ ��� S������� (����� ��. KSCX2-YW-�-040) **通讯作者 C�����������g ������ (E-����: ���x�@w�.���.��)摘 要 在比对已公布的37种杆状病毒包涵体蛋白氨基酸序列的基础上，选定棉铃虫核型多角体病毒(H��PV)H��PV)多角体蛋白的两个高度保守多肽(54-113��54-113��和206-245��)制备多克隆抗体，用W������ ����法检测这两个高度保守多肽与多种杆状病毒包涵体蛋白之间的血清学关系. 结果表明，H��PV 多角体蛋白的两个多肽的抗体与14种核型多角体病毒的多角体蛋白和5种颗粒体病毒的颗粒体蛋白均有明显的杂交信号，表明杆状病毒的包涵体蛋白之间具有共同的抗原决定簇. 根据杆状病毒包涵体蛋白之间的这种血清学关系，进一步讨论了利用免疫金试纸技术检测病毒杀虫剂中包涵体含量的可行性. 图7 参9关键词��� 杆状病毒；棉铃虫核型多角体病毒；包涵体蛋白；保守多肽；W������ ����；共同抗原性CLC S476.13 : Q93678814 卷应 用 与 环 境 生 物 学 报 Chin J Appl Environ Biol虫剂中包涵体浓度的免疫金试纸提供依据.1 材料与方法1.1 病 毒棉铃虫核多角体病毒(H. armigera �PV，H��PV)，栗黄卷叶蛾核多角体病毒(Trabala vishwou �PV，T��PV)，甘兰夜蛾核多角体病毒(Mamestra brassicae �PV，M��PV)，斜纹刺蛾核多角体病毒(Oxypla ochracea �PV，O��PV)，黄褐天幕毛虫核多角体病毒(Malacosoma meustria testacea �PV，M���PV)，茶尺蠖核多角体病毒(Ectropis obliqua hypulina�PV，E���PV)，柳天蚕蛾核多角体病毒(Actias selene �PV，A��PV)，蓖麻蚕核多角体病毒(Philosamia cynthia ricina�PV，P���PV)，木撩尺蠖核多角体病毒(Culcula panterinaris�PV，C��PV)，美国白蛾核多角体病毒(Hyphan cunea �PV，H��PV)，舞毒蛾核多角体病毒(Lymantria dispar�PV，L��PV)，苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒(Autographa californica�PV，A��PV)，甜菜夜蛾核多角体病毒(Spodoptera exigua�PV，S��PV)，灰茶尺蠖核多角体病毒(Ectropis grisescens�PV，Eg�PV)，苹果蠹蛾颗粒体病毒(Cydia pomonella �V，C��V)，黄地老虎颗粒体病毒(Agrotis segetum �V，A��V)，小菜粉蝶颗粒体病毒(Pieris rapae �V，P��V) (新疆株)，褐边绿刺蛾颗粒体病毒(Parasa consocia �V，P��V)，小菜粉蝶颗粒体病毒(Pieris rapae �V，P��V) (北京株). 以上病毒均由中国科学院武汉病毒研究所病毒保藏中心提供.1.2 杆状病毒包涵体蛋白氨基酸分析用M�gA��g�对28种已公布的核型多角体病毒多角体蛋白和9种颗粒体病毒颗粒体蛋白的氨基酸序列进行序列比对，发现两个区域的保守性非常高，推测可能是杆状病毒的共同抗原区. 为了研究杆状病毒包涵体蛋白间的共同抗原性，我们选定了H��PV多角体蛋白的这两个高度保守区��1(54-113��)和��2 (206-245��) (图1单下划线部分和双下划线部分)进行了原核表达.1.3 病毒包涵体蛋白的提取�纯化的包涵体悬液70℃保温2 �，用终浓度0.1 ���/L��2CO3，0.17 ���/L ��C�，0.001 ���/L EDTA (�H 11.0)的碱解液冰浴作用5~10 ���，稀醋酸调至�H 7.8~8.5，12 000 × g离心30 ���，取上清，保存于–20 ℃[7].1.4 H��PV多角体蛋白基因保守区��1、��2的克隆与原核表达根据H��PV多角体蛋白基因序列设计引物，扩增高保守区基因片段��1和��2，并分别克隆至�MD18-T载体(T�K���)T�K���)，获得重组质粒�MD18-T-��1和�MD18-T-��2，再分别用Eco R/ Sal和Sal/XhoⅠ双酶切重组质粒，将目的片段亚克隆至原核表达载体�ET-28�，获得重组质粒�ET-28�-��1和�ET-28�-��2. 重组质粒均经酶切、测序鉴定正确后，分别转入E. coli �L21，在含100 μg/mL卡那霉素的L�培养液中37℃培养过夜，按1 : 100放大培养至D = 0.6~0.7时，加IPT�至终浓度1 ����/L，30℃诱导6 �，SDS-PA�E检测表达产物，分别命名为PH1和PH2.1.5 细胞破碎与蛋白纯化收集诱导表达的菌液，5 000 × g离心10 ���，弃上清，适量P�S重悬后超声破碎，12 000 × g离心10 ���，沉淀用洗涤液(2���/L2 ���/L尿素，50 ����/L T���，1 ����/L EDTA)洗涤2~3次，12 000 × g离心10 ���，包涵体沉淀参照����g��公司H��•���� K��产品说明采用H��纯化树脂纯化目的蛋白.1.6 抗H��PV多角体蛋白高保守区多克隆抗体的制备纯化的目的蛋白PH1常规方法免疫小鼠，制备鼠抗PH1抗血清；目的蛋白PH2常规方法免疫家兔，制备兔抗PH2抗血清. 实验兔、鼠的饲养，抗原注射和采血均委托中国科学院武汉病毒所实验动物中心进行.1.7 W������法检测包涵体蛋白之间的血清学关系提取的各病毒包涵体蛋白约1 μg经SDS-PA�E电泳后，电转移到PVDF膜上，5%封闭液(T�S��5%T�S �� 5%脱脂奶粉) 44℃封闭过夜. T�S-TT�S-T缓冲液(50 ����/L T���-C�，200 ����/L ��C�，0.1% Tw���-20，�H 7.5)室温洗膜5 ���. 抗PH1、PH2的抗血清用0.5%封闭液稀释1 000倍，将膜分浸入抗血清稀释液中，37℃温浴1 �. T�S-T缓冲液洗膜3次，每次10 ���. 二抗分别为碱性磷酸酶标记的羊抗鼠Ig�和羊抗兔Ig�，用0.5%封闭液稀释3 000倍. 将膜浸入二抗稀释液中，37℃温浴1 �. T�S-T缓冲液洗膜4次，每次10 ���. 显色操作参照说明书进行.为了检测PH11和PH22在空间上是否互相影响对方与其抗血清相结合，我们进行了另一组实验. (1)1) 先用兔抗PH22抗血清封闭包涵体蛋白相应抗原位点后，再用鼠抗PH11抗血清杂交，二抗用碱性磷酸酶标记的羊抗鼠Ig�；(2)2) 先用鼠抗PH11抗血清封闭包涵体蛋白相应抗原位点后，再用兔抗PH22抗血清杂交，二抗用碱性磷酸酶标记的羊抗兔Ig�.2 结 果2.1 包涵体蛋白氨基酸分析与高度保守区的确定用计算机软件(M�gA��g�)比对了H��PV与A��PV等37种杆状病毒多角体蛋白和颗粒体蛋白氨基酸序列的同源性. 结果发现，除Neodiprion sertifer �PV (47.8%)、N. lecontei �PV (47%)外，H��PV多角体蛋白与其他25种�PV多角体蛋白的同源性均在80%以上，而与�V颗粒体蛋白的同源性在52%~55.5%之间. 同时，还发现杆状病毒包涵体蛋白中存在两个高度保守区��1和��2 (图1)，其区域同源性明显高于其它部分，多角体蛋白��1区的同源性在90%以上，颗粒体蛋白��1区的同源性在70%左右；而多角体蛋白��2区的同源性在85%左右，颗粒体蛋白��2区的同源性也高达75%. 推测这两个高度保守区很可能是杆状病毒包涵体蛋白的共同抗原区. 本实验以棉铃虫核型多角体病毒多角体蛋白高保守区��1 (54-113��)和��2 (206-245��)为对象，研究杆状病毒包涵体蛋白的共同抗原性.1.2 目的基因的克隆与原核表达载体的构建PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，扩增片段大小与设计的��1、��2片段长度相符(图2). 切胶回收后的��1、��2片段克隆至�MD18-T载体获得的重组质粒经酶切鉴定均能获得与��1、��2大小相符的插入片段(图3)，而后将插入片段亚克隆至原核表达载体�ET-28�，经酶切、序列测定证明原核表达质粒�ET-28�-��1，�ET-28�-��2构建正确.789 6 期刘彩云等：杆状病毒包涵体蛋白的共同抗原性图1 杆状病毒包涵体蛋白氨基酸序列的比对��������� ���� �������� ��� ��������������������������F�g. 1 A��g��� ����� ���� ��������� ��� ������������������������用C������ W比对氨基酸序列并用����D��显示. 黑色阴影()表示100%%氨基酸残基保守性，中等灰度阴影()表示80%或更高的氨基酸残基保守性，轻度灰色阴影()表示60%~80%的氨基酸残基保守性. 高度保守区��1和��2分别用单下划线和双下划线标明T�� ����� ���� ��������� w��� ���g��� �� C������ W ��� ��������� ����g ����D�� �����w���. ����k ������g () ��������� 100% ��������� ����� ���� ��������, ������ g��� ������g () ��������� 80% �� g������ ������������ ��� ��g�� g��� ������g () ��������� 60%~80 % ������������. T�� ��g��� ��������� ��g�����1 �� ���������� ��� ��2 �� ������ ����������79014 卷应 用 与 环 境 生 物 学 报 Chin J Appl Environ Biol1.3 目的蛋白的原核表达与纯化将克隆正确的重组质粒�ET-28�-��1和�ET-28�-��2分别转化E. coli �L21，进行IPT�诱导表达. PH1PH1融合蛋白预测相对分子量M�=13 000，原核表达后SDS-PA�E分析显示在M�13 000左右处有一条明显的诱导条带. 收集诱导表达的菌液，细胞破碎后的上清和沉淀SDS-PA�E分析显示目的蛋白PH1图2 H��PV ��1和��2 PCR产物的鉴定Fig. 2�������i�����i�����������������������������1��2������gm����������i�����i�� ��� ���� ��������� ��� H��PV�����2����g�����H��PV ��1 ��� ��2 ����g�����1, ��1; 2, ��2; M, D�A ���k��图3 重组质粒�MD18-T-��1和�MD18-T-��2酶切鉴定Fig. 3 ����i�����i�� ��� ����mbi���� �l���mi��� �MD18-T-��1��� �MD18-T-��2 �� RE�1, �MD18-T-��1; 2, �MD18-T-��2; M, D�A ���k��图4 H��PV PH1蛋白原核表达与纯化的SDS-PA�E分析F�g. 4 SDS-PA�E �������� ��� H��PV PH1 ������� �x������� �� E. coliM, 蛋白分子量标准; 1, 未诱导表达; 2~4, IPT�诱导表达后2 �, 4 �, 6 �;5,; 5, 破碎后上清液��6��破碎后的包涵体��7��纯化蛋白��1�� 6�� 破碎后的包涵体���� 7�� 纯化蛋白��1��1M, P������ ��������� w��g�� ���k�� ; 1, U�������� �x��������; 2~4, I�������x����������IPT�������2�,4�,6�;5,S��������������������������I������ �x�������� �� IPT� ������ 2 �, 4 �, 6 �; 5, S���������� ������ ����������; 6, I�������� ������ ����������; 7, ���i���� �����i� ��1图5 H��PV PH2H��PV PH2蛋白原核表达与纯化的SDS-PA�E分析F�g. 5 SDS-PA�E �������� ��� H��PV PH2 ������� �x������� �� E. coliM, 蛋白分子量标准; 1, 未诱导表达; 2~4, IPT�诱导表达后2 �, 4 �, 6 �; 5~7,7, 纯化蛋白PH2M, �����i� m�l���l�� w�ig�� m��k��; 1, U�i������ �x�������i��; 2��~4, ������� �x�������i�� by ��TG ������ 2�� �, 4 �, 6 �; 5~7,���i���������i���2��7, ���i���� �����i� ��2��7916 期刘彩云等：杆状病毒包涵体蛋白的共同抗原性主要以包涵体形式表达，而可溶性的上清中并无明显的蛋白带，采用H��纯化树脂(����g��)纯化目的蛋白(图4). PH2融合蛋白预测相对分子量M �＝10 000，原核表达后SDS-PA�E 分析显示诱导条带的大小与预测相符，采用H��纯化树脂纯化目的蛋白PH2(2 (图5).1.4 多克隆抗体的制备与检测从超声破碎的沉淀中纯化的目的蛋白常规方法分别免疫家鼠、家兔，获得鼠抗PH11抗血清和兔抗PH22抗血清. 多克隆抗体与原核表达产物的杂交结果显示，抗体效价约为1:1000 (图6).1.5 W������ ����检测PH1、PH2与其它包涵体蛋白之间的血清学关系提取的各杆状病毒包涵体蛋白经SDS-PA�E 电泳后，电转移到PVDF 膜上，分别以PH1和PH22抗血清为一抗，进行W������ ����分析，检测H��PV 多角体蛋白与其他包涵体蛋白的交叉反应. 而后分别先用兔抗PH22抗血清封闭包涵体蛋白相应抗原位点后再用鼠抗PH11抗血清杂交，或者先用鼠抗PH11抗血清封闭后再用兔抗PH22抗血清杂交.结果显示，H��PV 多角体蛋白的高保守区PH11的抗血清与其他14种�PV 的多角体蛋白和5种�V 的颗粒体蛋白均有较为明显的免疫反应，且与�PV 多角体蛋白的反应略强于与�V 颗粒体蛋白的反应(图7-A).A). 另一个高保守区PH22也有相同的结果(图7-C).C). 同时，无论先用PH11抗血清还是先用PH22抗血清封闭包涵体蛋白相应抗原位点后再用另一抗血清杂交，与直接用一种抗血清杂交的结果并无明显差异(图7-��，图7-D)D)，这一结果表明，H��PV 的这两个高度保守区在空间上并不影响对方与各自抗血清的结合，这为下一步将利用PH11和PH22抗血清制备检测包涵体蛋白的免疫金试纸提供了可能性.3 讨 论本文在比对了H��PV 与A��PV 等37种杆状病毒多角体蛋白和颗粒体蛋白的氨基酸序列的基础上，制备了H��PV 多角体蛋白在杆状病毒中高度保守的两个片段的多克隆抗体，免疫学反应显示H��PV 多角体蛋白与多种�PV 的多角体蛋白和�V 的颗粒体蛋白之间具有明显的交叉反应，因此杆状病毒包涵体之间可能具有相同的抗原决定簇，普遍存在共同抗原性. 同时，杂交信号的强弱表明，H��PV 多角体蛋白与核型多角体病毒多角体蛋白间的血清学关系比与颗粒体病毒颗粒体蛋白间的血清学关系更为密切，此结果与孙国勋等[8]的研究结果相一致. 另外，我们的结果还表明，无论先用PH11抗血清还是先用PH22抗血清封闭包涵体蛋白相应抗原位点后，再用另一抗血清杂交，结果并无明显差异，说明这两个共同图6 H��PV PH1, PH2蛋白的W������-����检测F�g. 6 W������ ���� �������� ��� H��PV PH1, PH2 ��������M: 预染蛋白分子量标准 P��������� ������� ��������� w��g�� ��������. 1: PH1 �������; 2: PH2 �������图7 H��PV 多角体蛋白与其它杆状病毒包涵体蛋白的w������-����分析F�g. 7 W������ ���� �������� ��� ��� ������g���� ������������ ���w��� H��PV ���������� ��� ����� ��������� ���� ��������A. 鼠抗PH1抗血清为一抗; �. 先用兔抗PH2抗血清封闭位点后再用鼠抗PH1抗血清杂交; C. 兔抗PH2抗血清为一抗; D. 先用鼠抗PH1抗血清封闭位点后再用兔抗PH2抗血清杂交A. H������z�� w��� ��� ����-PH1 ���������; �. H������z�� w��� ��� ����-PH1 ��������� ������ ����k��g ������������g ����� w��� ������ ����-PH2 ���������; C. H������z�� w��� ������ ����-PH2 ���������; D. H������z�� w��� ������ ����-PH2 ��������� ������ ����k��g ������������g ����� w��� ��� ����-PH1 ���������1. T��PV;2. M��PV;3. O��PV;4. M���PV;5. E���PV;6. A��PV;7. P���PV;8. C��PV;9. H��PV; 10. H��PV; 11. L��PV; 12. A��PV; 13. S��PV; 14. Eg�PV. 15. C��V; 16. A��V; 17. P��V (X��j���g ������); 18. P��V; 19. P��V (���j��g ������)P��V (���j��g ������)79214 卷应 用 与 环 境 生 物 学 报 Chin J Appl Environ Biol抗原区在空间上并不相互影响对方的抗原性. 这些结果为利用这两个抗体制备免疫层析检测试纸提供了可能性.通常病毒杀虫剂质量检测的方法包括生物活性测定和多角体计数. 因为生物活性测定的周期较长，且取样的数量有限，所以对病毒杀虫剂产品中的多角体进行计数是更为常用的方法. 但是，由于未提纯的多角体病毒具有更好光保护性能以及更低的成本等原因，目前病毒杀虫剂产品多以病死虫尸直接匀浆后再加其它辅剂配制而成，这就使得用血球计数板对产品中多角体直接计数变得十分困难[9]. 基于本研究发现的杆状病毒包涵体之间普遍存在的共同抗原性，我们的下一步工作将以鼠抗PH11抗血清和兔抗PH22抗血清为材料，采用双抗体夹心免疫层析技术，研制检测包涵体蛋白浓度的免疫层析检测试纸，以期快速(半)定量的检测不同种类杆状病毒的浓度. 采用此试纸条对病毒杀虫剂中的多角体进行检测，具有操作方便、快速、实用的特点，具有推广应用价值.References1 ����k �C, ������� LA, D���k� PM, ���� IE. C����������z��������C����������z����� ��� ����������� ������������. I�: M����� LK ��.T�� �������������. ��w Y��k ��� L�����: P����� P����, 199719972 S�� XL (孙修炼), P��g HY (彭辉银). R����� �������� �� �����g����������� ��� ���� ������� �� ����g ������� �� C����. Virol Sin (中国病毒学),, 2007, 22: 158~1623 Z������ PM, K�����g �D, M������k JE. P����g������ ���������������������g �������������: E����������� ����� ��� ���� �����������. 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重组HEV衣壳蛋白截短体的表达及鉴定
Vol.33高等学校化学学报No.112012年11月 CHEMICAL JOURNAL OF CHINESE UNIVERSITIES 2481~2485重组HEV 衣壳蛋白截短体的表达及鉴定李 霄1,2,屈勇刚2,3,贾 鹏2,4,刘立明2,5,季慧范1,2,赫东芸1,2,金宁一2,迟宝荣1(1.吉林大学第一临床医院,长春130021;2.军事医学科学院全军基因工程实验室,长春130122;3.石河子大学动物科技学院,石河子832000;4.深圳出入境检验检疫局,深圳518000;5.吉林农业科技学院动物医学学院,吉林132101)摘要 戊型肝炎(HE)是由戊型肝炎病毒(HEV)感染引起的肠道病毒性传染病.HEV 是一种无囊膜的单股正链RNA 病毒,其编码区由3个开放阅读框(ORF)组成,属戊型肝炎病毒科.HEV 衣壳蛋白由ORF2编码.本研究根据编码HEV ORF2aa382~aa674的核苷酸序列克隆了p293基因,并将其克隆入原核表达载体pET28a,利用大肠杆菌BL21(DE3)对HEV 衣壳蛋白截短体(p293)进行了表达.SDS⁃PAGE 和Western blot 检测结果表明,在优化的表达条件下(1mmol /L IPTG,250r /min,37℃,5h),重组蛋白p293能够在大肠杆菌内有效表达,目的蛋白约占总蛋白的66.15%.TEM 检测结果显示,原核表达的p293能够在体外形成约30~40nm 的病毒样颗粒.免疫印迹和免疫荧光检测结果表明,p293与HEV 标准阳性血清具有良好的反应原性和反应特异性.实验结果表明,p293可应用于HEV 宿主吸附和病毒装配研究,为HEV 的预防与诊断研究奠定了基础.关键词 戊型肝炎病毒;衣壳蛋白;病毒样颗粒;原核表达中图分类号 O629;Q51;R373.2+1 文献标识码 A doi :10.7503/cjcu20120368收稿日期:2012⁃04⁃17.基金项目:国家自然科学基金项目(批准号:81072210,81101140)㊁ 重大新药创制”科技重大专项(批准号:2010ZX09401⁃305⁃14)和中国博士后科学基金(批准号:20100481057)资助.联系人简介:迟宝荣,女,教授,博士生导师,主要从事肝病分子生物学及消化道肿瘤研究.E⁃mail:chibr@ 戊型肝炎病毒(Hepatitis E Virus,HEV)是一种无囊膜的单股正链RNA 病毒,基因组全长约7.3kb [1].HEV 虽然只有1个血清型[2],但可分为5个基因型:Ⅰ型和Ⅱ型仅发现感染人,Ⅲ型和Ⅳ型为人畜共患,Ⅴ型仅发现感染禽类[3].HEV 首先发现于印度,随后出现在中东㊁远东㊁北非㊁西非㊁北美(墨西哥)㊁东南亚㊁中亚和中国等发展中及欠发达国家和地区[4~7].我国各省㊁市和自治区均存在HEV 感染病例,1986~1988年新疆发生HEV 大流行,持续近2年,病例近12万,死亡近千人[8].戊型肝炎(HE)作为人兽共患传染病,在家畜㊁经济动物和野生动物种群中流行的情况也比较普遍[9].总之,HEV 感染已成为世界各国不可忽视的公共卫生问题.HEV 编码区由3个互相重叠的开放阅读框(Open reading frame,ORF)组成(ORF1,ORF2和ORF3)[10].其中,ORF2是HEV 的主要结构蛋白,全长约2kb,编码由660个氨基酸组成的多肽(pORF2)[9].研究表明,pORF2不仅含有PA /PPP 切割位点等信号序列,且具有富含精氨酸(Arg)的序列(aa22~aa322).这些Arg 含量接近10%,等电点高达10.35的序列,在病毒衣壳蛋白组装基因组转录本的过程中,能够中和基因组RNA 负电荷,从而使pORF2具有典型的病毒衣壳蛋白特征[11].HEV 难以体外培养的问题一直困扰着研究者[12].利用基因工程手段人工表达病毒结构蛋白,并组装病毒样颗粒(Virus⁃like particle,VLP),可为HEV 研究提供替代方案,目前已有研究报道[13,14].以上研究均表明,HEV pORF2的部分序列确可形成强构象型表位,为HEV 的VLP 组装奠定理论基础.本文采用生物信息学方法筛选基因Ⅵ型HEV pORF2主要结构片段(aa382~aa674),并以质粒2842高等学校化学学报 Vol.33 pET28a为表达载体,以大肠杆菌(E.coli)BL21为表达宿主,对其表达后进行VLP组装.利用Western blot和透射电子显微镜(TEM)对表达产物和VLP进行了鉴定.制备了免疫血清,利用ELISA对表达产物进行了免疫原性测定,为建立HEV诊断方法和HEV致病机理研究奠定了基础.1 实验部分1.1 材料与仪器质粒pET28a㊁基因Ⅵ型HEV全基因组质粒pKS⁃HEV[9]㊁E.coli BL21(DE3)和人肝癌细胞HepG⁃2由本实验室保存;质粒pMD18⁃T㊁内切酶㊁Taq酶㊁连接酶㊁DNA marker和蛋白Marker购自大连宝生物公司;小鼠抗His⁃Tag单克隆抗体㊁AP标记的马抗鼠IgG和FITC标记羊抗鼠IgG购自Omiga公司; DMEM培养液和血清购自Hyclone公司;其它试剂均为国产分析纯.JEM⁃1200EXII型透射电子显微镜(Jeol公司);Himac CR21低温高速离心机(Hitachi公司);2720型PCR仪(ABI公司);BX51型荧光显微镜(Olympus公司).1.2 实验方法1.2.1 分子设计及引物合成 根据本实验室HEV全基因序列(Genbank:EF077630),参照文献[15, 16]的优化原则,结合InsightⅡ生物信息学软件对ORF2进行分析并设计引物.P1:5′⁃GCGAATTCAT⁃AGCACTTACCTTGTTCAACCTTGCTGAC⁃3′;P2:5′⁃GCGTCGACGAAGAATAAATCAATACTCCCGGG⁃3′.1.2.2 重组表达质粒构建 以pKS⁃HEV为模板,用引物P1和P2扩增编码HEV aa382~aa674基因片段并连接至pMD18⁃T载体上,得到重组质粒pMD293,测序;用Eco RⅠ和SalⅠ双酶切pMD293,回收目的片段并与经同样酶切的pET28a载体连接,获得重组质粒pET293;重组质粒用Eco RⅠ和SalⅠ进行酶切鉴定,具体操作参照文献[17]方法进行.1.2.3 重组菌的IPTG诱导表达 pET293转化E.coli BL21,并于250r/min和37℃条件下培养至OD值为0.6~0.8.加入终深度为1mmol/L的IPTG,于250r/min和37℃条件下培养5h.于4℃以5000r/min转速离心20min收集菌体并进行超声破碎.产物于4℃,10000g条件下离心10min用于蛋白的初步纯化和复性[18],将表达产物命名为p293.1.2.4 Western blot 表达产物经SDS⁃PAGE分析后,电转移至硝酸纤维素膜,分别用小鼠抗His tag 单抗和碱性磷酸酶标记的马抗小鼠IgG单抗进行Western blot检测[19].1.2.5 蛋白的初步纯化和复性 用8~0mol/L脲素对表达产物进行梯度洗脱后加入终深度为1mmol/L的氧化型谷胱甘肽和2mmol/L的还原性谷胱甘肽,于4℃放置8~10h,用PBS缓冲液对产物进行透析并冻存于-20℃备用[15,16].1.2.6 重组蛋白的TEM观察 复性后的蛋白p293经2%磷钨酸(pH=7.0)负染,固定于喷炭的铜网上进行TEM观察[15].1.2.7 免疫荧光检测 制备单层HepG⁃2细胞,加入无血清DMEM细胞培养液(1mL/孔);分别加入50μg的蛋白p293或等量蛋白p293与抗HEV阳性血清混合液;分别用小鼠抗His tag单抗和FITC标记的羊抗鼠IgG单抗,以间接免疫荧光法对蛋白p293进行细胞结合活性检测[20].2 结果与讨论2.1 基因克隆与载体的构建和鉴定经PCR扩增到约903bp的目的基因,与预期结果相符;将目的基因克隆到pMD18⁃T载体,构建测序载体pMD293,经酶切鉴定后测序表明,所克隆目的基因序列未发生突变.将测序正确的目的基因片段克隆到pET28a载体,酶切鉴定结果表明获得了重组大肠杆菌表达质粒pET293(见图1).2.2 重组蛋白p293的SDS⁃PAGE和Western blot检测如图2所示,重组蛋白经SDS⁃PAGE分析,在33800处有明显的条带,与理论值相符,表明目的蛋白p293表达成功.凝胶扫描(图3)结果表明,重组蛋白p293占菌体总蛋白的66.15%.蛋白p293经Western blot检测得到大小约为33800的条带,与预期相符.Fig.1 Application of molecular simulation to explore the structure of CEA dsFv M:DL 2000DNA marker;lane 1:PCR product of the truncated capsid protein of HEV(aa382 aa674);lane 2:pMD293digested with EcoR Ⅰand Sal Ⅰ;lane 3:pMD293;lane 4:pET293digested with EcoR Ⅰand Sal Ⅰ;lane 5:pET293.Fig.2 SDS⁃PAGE assay of p293before (A )and after purification (B )and western blot assay ofthe p293after purification (C )M:low molecular weight protein marker;lane 1:p293induction in BL21(DE3)induced by 1mmol /L IPTG;lane 2:p293expressed in the inclusion body fraction;lane 3:SDS⁃PAGE assay of purified p293;lane 4:Western blot assay of purified p293.Fig.3 Gel scanning of p293after purificationFig.4 TEM image of recombinant proteinp293(20000×)2.3 重组蛋白p293的形态由负染的纯化后重组蛋白p293的TEM 照片(图4)可见直径约为30~40nm 的病毒衣壳样球形颗粒,表明重组蛋白p293可自组装形成病毒样颗粒.2.4 重组蛋白p293的细胞结合活性如图5所示,蛋白p293能与HepG⁃2细胞结合,并在细胞表面呈现特异性亮绿色荧光;经抗HEV 阳性血清处理的蛋白p293不能识别HepG⁃2细胞,未检测荧光颗粒,与未经处理的HepG⁃2细胞阴性对照一致.以上结果表明,p293可以特异性识别HepG⁃2细胞,并吸附于HepG⁃2细胞表面.3842 No.11 李 霄等:重组HEV 衣壳蛋白截短体的表达及鉴定4842高等学校化学学报 Vol.33 Fig.5 Identification of cellular binding activity of p293(100×)(A)p293mixed with anti⁃p293serum;(B)p293;(C)negative control.3 结 论基于HEV全基因组克隆,利用RT⁃PCR克隆了编码HEV ORF2aa382~aa674的核苷酸序列,构建了表达目的蛋白(p293)的原核表达载体pET293.利用原核表达系统在大肠杆菌中对蛋白p293进行了表达,并利用与蛋白p293融合表达的组氨酸标签对其进行了初步纯化.蛋白p293的SDS⁃PAGE分析结果表明,目的蛋白约33800,占菌体总蛋白的66.15%.Western blot检测结果显示,蛋白p293对HEV标准阳性血清具有良好的反应原性和反应特异性.TEM测结果显示,蛋白p293在体外可以形成约30~40nm左右的病毒样颗粒,其颗粒大小和形态与HEV相似.在体外将蛋白p293以类似病毒感染的方式与HepG⁃2细胞作用,并进行免疫荧光检测,结果表明HepG2细胞表面出现了特异性亮绿色荧光颗粒,且此现象可被HEV标准阳性血清所抑制,证实蛋白p293可与HepG⁃2细胞发生特异性结合.本文结果表明,蛋白p293具有替代HEV进行感染机理等研究的可能,为建立HEV感染模型和HEV诊断方法奠定了基础.参 考 文 献[1] Osterman A.,Vizoso Pinto M.G.,Haase R.,Nitschko H.,Jäger S.,Sander M.,Motz M.,Mohn U.,Baiker A..Virol.J.[J],2012,9:28[2] Wedemeyer H.,Pischke S.,Manns M.P..Gastroenterology[J],2012,142(6):1388 1397[3] Teshale E.H.,Hu D.J..World J.Hepatol.[J],2011,3(12):285 291[4] PU Yun(浦昀),QI Yan⁃Fei(齐燕飞),XU Guo⁃Liang(徐国良),XU Hui(徐卉),ZHANG Shi⁃Yao(张士尧),MENG Ri⁃Zeng(孟日增),SONG Xiu⁃Ling(宋秀玲),YANG Huai⁃Ning(杨怀宁),LI Juan(李娟).Chem.J.Chinese Universities(高等学校化学学报) [J],2011,32(1):84 87[5] Nelson K.E.,Kmush B.,Labrique A.B..Expert.Rev.Anti.Infect.Ther.[J],2011,9(12):1133 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J..J.Viral.Hepat.[J],2006,13(12):840 844Expression and Characterization of a Recombinant Truncated Capsid Protein of Hepatitis E VirusLI Xiao 1,2,QU Yong⁃Gang 2,3,JIA Peng 2,4,LIU Li⁃Ming 2,5,JI Hui⁃Fan 1,2,HE Dong⁃Yun 1,2,JIN Ning⁃Yi 2,CHI Bao⁃Rong 1*(1.The First Hospital of Bethune Faculty of Medical Sciences ,Jilin University ,Changchun 130021,China ;boratory of Genetic Engineering of PLA ,Academy of Military Medical Sciences ,Changchun 130122,China ;3.College of Animal Science and Technology ,Shihezi University ,Shihezi 832000,China ;4.Shenzhen Entry⁃exit Inspection and Quarantine Bureau ,Shenzhen 518000,China ;5.College of Veterinary Medicine ,Jilin Academy of Agricultural Science and Technology ,Jilin 132101,China )Abstract Hepatitis E is an enterically transmitted viral disease caused by infection with hepatitis E virus (HEV).HEV is a nonenveloped virus classified in the family of Caliciviridae.The virus appears to be a poly⁃adenylated,positive⁃stranded RNA virus with three major open reading frames(ORFs).The capsid protein of HEV is encoded by the open reading frame 2(ORF2).We attempted to produce a truncated capsid protein,designed p293,in E.coli .The p293gene encoding amino acids aa382 aa674of HEV ORF2was designed based on the full length of HEV ORF2,cloned into the vector pET28a,and expressed in E.coli strain BL21(DE3).SDS⁃PAGE and Western blot analysis demonstrated that the recombinant protein p293could well ex⁃pressed in E.coli .Under optimized conditions (1mmol /L IPTG,250r /min,37℃,5h),the yield of soluble p293was approximately 66.15%of the total protein.It was observed,by transmission electron micros⁃copy,that p293expressed in E.coli formed 30 40nm viral⁃like particles.The experimental results also showed that p293reacted with HEV positive serum and had a good reactionogenicity.These results showed that the p293may has utility in the analysis of cell specific factors in the protein processing and assembly of HEV,and serve as useful antigen for both diagnostic and vaccine purposes.Keywords Hepatitis E virus(HEV);Capsid Protein;Viral⁃like particle(VLP);Prokaryotic expression(Ed.:H ,Z ,K )5842 No.11 李 霄等:重组HEV 衣壳蛋白截短体的表达及鉴定。
对虾病毒IHHNV衣壳蛋白的克隆表达及新型双抗夹心ELISA的高效检测
ｄｒｏｍｅ，ＲＤＳ），也 是 南 美 白 对 虾 常 见 的 一 种 慢 性 致 病病毒．ＩＨＨＮＶ主要感染对虾的表皮、鳃、前后肠上 皮细胞、神经索和神经节等外胚层组织；造血组织、 淋巴器官、性腺、结缔组织和横纹肌等中胚层器官， 感染对虾后可在宿主细胞核内形成一定的包涵体． 患此病的病虾身体变形，引起慢性感染为主，严重时 可造成虾的大量死亡，影响经济效益［８１１］．
３期
于 衬，等：对虾病毒 ＩＨＨＮＶ衣壳蛋白的克隆表达及新型双抗夹心 ＥＬＩＳＡ的高效检测
· ４１９·
药领域，尤其是检测试剂盒的开发为疾病的临床诊 断提供更多便利性和准确性．
由于缺乏对 ＩＨＨＮＶ较敏感的对虾细胞系，关 于 ＩＨＨＮＶ的侵入宿主机制以及在宿主体内的复制 机制研究较少，需要进行深入的研究，本研究用纯化 的多肽制备了 ２种高效的特异性多克隆抗体，在原 核表达系统中成功表达了具有较好免疫原性的抗原 多肽，并成功建立了高效的检测对虾 ＩＨＨＮＶ的新 型双抗体夹心 ＥＬＩＳＡ方法，对于 ＩＨＨＮＶ病毒的早 期诊断提供有力的方法，有助于建立完善的对虾病 毒监控系统，对及时预 防 和 控 制 对 虾 病 毒 ＩＨＨＮＶ 的爆发和流行具有重要意义．
传染性皮下及造血组织坏死病毒最初于 １９８１ 年在美国夏威夷地区养殖细角滨对虾中被发现［２］， 是世界各地养殖和野生对虾的重要病原之一，该病 毒在亚洲地区也具有流行趋势，ＩＨＨＮＶ病毒从 ２００１ 年就开始在中国养殖的凡纳滨对虾中普遍流行，并 对不同种对虾造成了一定的经济损 失［３５］．ＩＨＨＮＶ 是单链 ＤＮＡ细小病毒，属于细小病毒科，短浓核症 病毒属（Ｂｒｅｖｉｄｅｎｓｏｖｉｒｕｓ），是目前已知的对虾病毒中 颗粒最小的一种，直径只有 ２２ｎｍ，无包膜，２０面体 对称的球状 颗 粒 ［６７］．ＩＨＨＮＶ主 要 对 细 角 滨 对 虾 和 凡纳滨对虾比较敏感，尤其会严重危害幼虾，在自然 条件下对于 大 部 分 养 殖 对 虾，ＩＨＨＮＶ均 可 以 感 染， 严重时引起对虾的发病和死亡；感染凡纳滨对虾后 可以造成慢性矮小残缺综合症 （ｒｕｎｔｄｅｆｏｒｍｉｔｙｓｙｎ
诺如病毒表达衣壳蛋白单克隆抗体的制备、鉴定和初步应用
诺如病毒表达衣壳蛋白单克隆抗体的制备、鉴定和初步应用Ⅱ组广州株NVgz01（DQ369797）Norovirus N蛋白免疫BALB/c 小鼠, 通过PEG使小鼠脾细胞和Sp2/0细胞融合, 利用HAT选择性培育基培育融合细胞, 用间接ELISA和Western blot测定mAb的效价、免疫球蛋白亚型和mAb的特异性, 并将各mAb之间进行配对。
结果: 通过细胞融合和克隆化, 共挑选出4株分泌抗NorovirusⅡ组广州株Norovirus N蛋白产生特异性反映, 而且能与天然粪便标本中的G Ⅱ组Norovirus产生特异性反映。
配对结果显示N2C3和N7C2之间配对, 对表达蛋白和天然病毒都具有较强的检测灵敏度。
结论: 取得了诺如病毒GⅡ组特异性mAb, 为制备免疫诊断试剂盒及致病机制的研究奠定了基础。
【关键词】 Norovirus NVgz01 核衣壳蛋白单克隆抗体诺如病毒作为流行性肠胃炎的要紧病因之一, 不管在进展中国家仍是发达国家, 从儿童到成年人都能够受到诺如病毒感染, 并可造成暴发流行, 成为阻碍人类健康的不可轻忽的问题, 最近几年来慢慢引发了研究者的重视。
美国CDC通过评估以为, 每一年在美国发生的食源性疾病有2 300万宗是由诺瓦克及诺瓦克样病毒引发的［1］; 在欧洲, 数据显示1995～2000年间, 有超过85％的食源性病毒肠胃炎暴发案例由诺瓦克及诺瓦克样病毒引发［2］。
由于人类诺如病毒分为GⅠ和GⅡ两组［3, 4］, 依照北京［5］、太原［6］和武汉［7］三地的血清学调查结果, 初步以为GⅡ组病毒为我国要紧流行组。
由于诺如病毒无法在体外感染细胞及动物模型来进行培育分离鉴定, 目前对诺如病毒的诊断方式主若是免疫电镜法（IEM）、放射免疫法（RIA）、ELISA法、 RealTimeⅡ组广州株Norovirus N蛋白作为免疫原, 免疫BALB/c小鼠并制备mAb, 为研制诺如病毒检测试剂盒奠定基础。
猪圆环病毒2型（PCV2）衣壳蛋白表达综述
猪圆环病毒2型（PCV2）衣壳蛋白表达综述第一篇：猪圆环病毒2型(PCV2)衣壳蛋白表达综述PCV2是圆环病毒科(Circoviridae)圆环病毒属成员，为单股环状负链无囊膜的DNA病毒, 为已知的最小动物病毒之一，约17~ 20nm, 二十面体对称。
根据病毒的抗原性和基因组成不同，可分为2种基因型或称血清型, 即PCV1型和PCV2型。
PCV1无致病性。
PCV2具有致病性，基因组全长1767bp或1768bp，包括11个读码框，其中ORF2编码病毒的主要结构蛋白)核衣壳蛋白(Cap)，其N端包含一个由41个氨基酸残基组成的的核定位信号(Nuclear location signal，NLS)，与PCV2在细胞核内定位有关。
Mahe和Liu等分别在sf 9真核细胞及大肠杆菌中进行了PCV2Cap蛋白的表达, 但Cap蛋白的表达量较低。
为了提高Cap蛋白的表达量, 本实验成功构建去除NLS的重组质粒, 并对其进行表达、纯化、鉴定。
1材料和方法1.1pcv-581重组质粒的构建1.1.1PCR扩增去除NLS基因的pcv-5811.1.1.1引物的设计与合成: 根据本实验室保存毒株的测序结果, 用Oligo6.0设计删除核定位信号特异引物(由大连宝生物工程公司合成), 并引入限制性内切酶BamHI、HindIII(加下划线表示)。
上游引物: ACAGGATCCATGGCATCTTCAACAC;下游引物: GAAAGCTTT TCATTAAGGGTTAAGT;产物长度581bp。
1.1.1.2PCV2核酸的提取: 取接种PCV2病毒的PK-15细胞悬液500uL, 常规方法提取, 最后加20uL灭菌去离子水溶解,-20度保存。
1.1.1.3PCR扩增: PCR的反应体系总体积25uL: 上、下游引物(10uLmol/L)各1.0uL，10×RCR Buffer2.5uL、dNTP3.0uL(2.5mM each)，提取的DNA2.0LL,Taq酶0.25LL(5U/ LL, TaKaRa), 去离子水补到25LL。
NNV衣壳蛋白在大肠杆菌中的表达纯化及其应用
NNV衣壳蛋白在大肠杆菌中的表达纯化及其应用作者：朱建蕊翟伟锋来源：《南方农业·下旬》2018年第02期摘要为获得稳定表达及较好免疫效力的重组NNV衣壳蛋白，对已公布的石斑鱼神经坏死病毒衣壳蛋白基因序列进行优化，并构建表达载体pET32a-NNV，于大肠杆菌BL21（DE3）中诱导、表达，将包涵体纯化后碾磨成粉添加到黄粉虫饲料中，用虫体粉末喂食石斑鱼，攻毒保护试验检测免疫效力。
结果获得高表达的NNV衣壳蛋白包涵体，目的蛋白占总蛋白的比率达70%，纯化后纯度达95%；且喂食本技术制备的黄粉虫粉末后石斑鱼对NNV抵抗力显著提高，存活率由5%上升至83%。
本研究提供一种重组NNV衣壳蛋白在大肠杆菌中高效表达和纯化方法，为石斑鱼神经坏死病毒疫苗的商品化推广奠定了基础。
关键词石斑鱼；神经坏死病毒；衣壳蛋白；疫苗中图分类号：S943 文献标志码：B DOI：10.19415/ki.1673-890x.2018.06.063石斑鱼是一种重要的经济鱼类。
神经坏死病毒（NNV）可攻击石斑鱼的神经系统，造成致命性的病毒脑病和视网膜病变[1]，是鱼苗培育过程中重大病害之一。
一旦爆发，会造成仔、稚鱼的大量死亡，成为制约石斑鱼养殖业发展的瓶颈。
目前，应对方法主要是阻断传播途径、筛选未携带病毒的亲鱼以切断垂直传播、利用碘试剂等消毒方法以减少水平传播，但前者受检测灵敏度限制，后者无法确保消毒彻底，因此疫苗是防治石斑鱼神经坏死病的重要方法之一。
至今已基于大肠杆菌、昆虫细胞和酵母系统成功表达NNV主衣壳蛋白，电镜下可见病毒样颗粒形成，动物实验显示其具有良好的免疫原性[2]。
然而传统注射重组病毒样颗粒的免疫方法，虽然对较长鱼苗具有较好的免疫保护作用，但对特异性免疫还未成熟的石斑鱼稚苗来说，则很难达到防治的目的，因而通过开发口服类疫苗被动免疫稚鱼，将是针对稚鱼免疫系统特点的较为有效的一种预防措施[3]。
因此本研究以制备稳定表达以及较好免疫效力的NNV衣壳蛋白为出发点，利用基因工程技术获得高表达的NNV衣壳蛋白包涵体，并建立了一种操作简单、可行性强的喂食免疫方法，为石斑鱼神经坏死病毒疫苗的商品化推广提供了可能性，具有广阔的市场前景。
A型流感病毒核衣壳蛋白研究进展
动物医学进展!200526<10>:39-42Pr o g ress i n Vet eri nar y M edi ci neA型流感病毒核衣壳蛋白研究进展马一君9王红炜9梅雪<河南中医学院基础医学院河南郑州450008>中图分类号"S852.659.5文献标识码"A文章编号"1007-5038(2005)10-0039-04摘要"A型流感病毒核衣壳蛋白参与病毒生活周期的多个阶段9影响病毒的转录\复制\装配及转运功能0另外9核衣壳蛋白是细胞毒性T淋巴细胞(CTL)识别的主要抗原9 CTL通过识别M~C类分子递呈的核衣壳蛋白抗原肽而清除感染的流感病毒0与核衣壳蛋白有关的CTL免疫逃避的研究证实了CTL反应对于控制病毒感染的重要性0由于核衣壳蛋白诱导产生的细胞免疫反应能针对同型不同亚型的流感病毒株产生交叉反应9将核衣壳蛋白作为疫苗成分有可能提供更加广泛\有效的保护作用0因此9对流感病毒核衣壳蛋白的深入研究9将有利于理解流感的发病机理9并为设计有效的流感疫苗奠定理论基础0关键词"A型流感病毒;核衣壳蛋白流感病毒属正黏病毒科分为A~B~C3型其中B型和C型只感染人类而A型流感病毒<I nfl u-enzavir us A>能感染人类以及马~猪等哺乳动物和各种禽类引起急性呼吸道传染病其流行对人类健康和世界经济能造成巨大损失A型流感病毒含有8条分离的负义RNA基因组片断其节段123分别编码聚合酶<p ol y m er-ase P>PB2PB1PA节段4编码血凝素蛋白<he-m a gg l uti ni n~A>节段5编码核衣壳蛋白<nucl eo-ca p si d V p r ot ei n NP>节段6编码神经氨酸酶<neura m i ni dase NA>节段7编码基质蛋白<m atri x p r ot ei n M>M1和M2节段8编码非结构蛋白<nonstr uct ure p r ot ei n NS>NS1和NS21流感病毒的RNA与核衣壳蛋白~多聚酶装配成RNA复合体与依赖RNA的多聚酶一起成为病毒基因组复制与转录的模板由于流感病毒NP与基因组的关系其结构及功能方面的研究一直吸引着科学家的广泛关注NP因其基因结构的保守性也使研究人员对其诱导的免疫学反应及疫苗的研究产生极大的兴趣文章将针对近年来A型流感病毒核衣壳蛋白的研究做一简要综述1有关NP结构A型流感病毒的核衣壳蛋白由RNA的第5节段基因编码其读码框含有1494个核苷酸编码498个氨基酸组成的多肽分子质量约56ku富含精氨酸~甘氨酸和丝氨酸残基从不同宿主分离的病毒株系统发生分析表明NP基因相当保守氨基酸差别最多不超过11在感染的细胞系中流感病毒的NP形成寡聚体其中有的病毒株完全由单体转为寡聚体而有的则部分形成寡聚体寡聚体形成的效率与A型流感病毒株的宿主起源有关2 Pr okudi na E N等3发现流感病毒株A Duck Ukrai ne63<~3N8>新合成的NP单体存在链内二硫键随后二硫键减少或断裂早期二硫键的形成是NP构象成熟的必要阶段而无二硫键的状态可能对NP寡聚体某些功能区的形成很重要寡聚体的形成可能是流感病毒NP在细胞内构象成熟的最后阶段Pr okudi na E N等4认为链内二硫键在NP寡聚体内的减少可能有助于寡聚体的稳定性和紧密性疏水键和静电作用与流感病毒NP寡聚体紧密构象的稳定性有关2NP在病毒复制过程中的作用A型流感病毒的核衣壳蛋白通过与病毒的RNA~病毒的蛋白成分及被病毒感染的细胞上一些大分子间作用影响病毒的转录~复制~装配及转运功能2.1NP与病毒RNA的关系NP的一个重要功能是包裹着病毒的基因组与。
用杆状病毒系统表达丙型肝炎病毒结构蛋白[开题报告]
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毕业论文开题报告生物工程用杆状病毒系统表达丙型肝炎病毒结构蛋白1 选题的背景和意义全球每年有近一百万人受到HCV感染，我国属HCV高感染区，人群的丙型肝炎患病率约为2.1%，HCV可持续感染患者长达30年之久，其中有些患者最终可发展成为肝硬化及肝细胞癌，严重危害人民的生命健康，目前对HCV既无有效的治疗药物，也无预防性的疫苗。
杆状病毒是一类双链DNA病毒，其DNA是9.0xl04-2.3x105bp的环状分子AcNPV和BmNPV 的DNA分子为1.35X105bP左右，病毒粒子呈杆状，其感染宿主细用杆状病毒系统表达丙型肝炎病毒结构蛋白胞后能够产生两种类型的病毒，一种是包涵型病毒(OV)，又称多角体获得病毒(PDV),另一种是芽生型病毒(BV)，或称胞外病毒(ECV)。
在感染的细胞核中，一部分核衣壳外形成囊膜，多角体或颗粒体蛋白沉积于囊膜上，形成包涵体病毒。
另一部分核衣壳通过出芽的方式从细胞质膜获得囊膜，形成芽生型病毒。
包涵体衍生的病毒主要进行昆虫之间的感染传播，而芽生型病毒则负责昆虫体内感染的扩散。
包涵型病毒和芽生型病毒在基因组层次上完全一致，但由于囊膜获得方式的不同，其分子组成略有差别，主要是囊膜糖蛋白不同，芽生型病毒的糖蛋白为gP64，而包涵型病毒是gP41，由于糖蛋白在病毒识别受体和侵染细胞中起重要作用，因此包涵型病毒和芽生型病毒对不同组织细胞有不同感染力:包涵型病毒对肠中细胞感染力强，适于对昆虫进行喂食感染，而芽生型病毒对体腔中细胞感染力强，感染虫体时须经体腔注射。
用杆状病毒系统表达丙型肝炎病毒结构蛋白将为进一步研制适用于人的HCV预防性疫苗打下工作基础。
2 相关研究的最新成果及动态2.1 该项研究的发展历程杆状病毒发展成一种哺乳动物基因转移载体昆虫杆状病毒表达载体系统的研究始于上世纪80年代，是继大肠杆菌、酵母和哺乳动物细胞表达系统后建立起来的又一高效表达系统。
目前用作表达载体的杆状病毒均为核型多角体病毒，以苜蓿银纹夜蛾多核衣壳核型多角体病毒和家蚕核型多角体病毒为代表。
传染性造血组织坏死病毒核衣壳蛋白的原核表达及抗原性分析
传染性造血组织坏死病毒核衣壳蛋白的原核表达及抗原性分析赵永欣;赵丽丽;刘巍巍;王建楠;李一经;乔薪瑗;葛俊伟;刘敏【摘要】应用RT-PCR方法扩增了长度为1176 bp的IHNV-ZYX株编码核衣壳(N)蛋白基因,将N基因克隆至原核表达载体pET30b,并在大肠杆菌Rosetta(DE3)中得到了表达.通过SDS-PAGE分析表明,重组菌诱导后得到了预期大小约48 KD 的N蛋白,与理论值相符；提取N蛋白的包涵体,并制备抗血清.间接ELISA和Western-blotting实验结果说明,表达的N蛋白与天然的IHNV N蛋白一样具有相同的抗原性.本试验结果为进一步研究分离株IHNV-ZYX N基因的免疫功能,建立灵敏高效的检测传染性造血组织坏死病的方法和研制基因工程疫苗奠定了重要的物质基础.%The gene encoding the viral nucleocapsid (N) was amplified by RT- PCR from IHNV-ZYX strain and cloned into pET30b vector. The expression of recombinant plasmid pET30b-N in E. Coli Rosetta(Dei) was induced and detected by SDS-PAGE analysis. The molecular weight of expressed recombinant N protein was approximately 48 KD as predicted. The inclusion body containing fusion protein was extracted and immunized in rabbits to obtain the antisera against N protein. Antigenicity of N protein was analyzed by indirect ELISA and Western- blotting. The results showed that the expressed N protein has immunogenical and antigenical characters as native IHNV N protein. This study has laid an important material foundation for further studying the N gene function of IHNV-ZYX in immune protection, establishing sensitive and efficient methods in detecting infectious hematopoietic necrosis, and manufacturing genetic engineering vaccine.【期刊名称】《淡水渔业》【年(卷),期】2011(041)005【总页数】5页(P40-44)【关键词】传染性造血组织坏死病毒;N基因;原核表达;抗血清【作者】赵永欣;赵丽丽;刘巍巍;王建楠;李一经;乔薪瑗;葛俊伟;刘敏【作者单位】东北农业大学动物科学与技术学院,哈尔滨150030;东北农业大学动物医学学院,哈尔滨150030;东北农业大学动物科学与技术学院,哈尔滨150030;东北农业大学动物科学与技术学院,哈尔滨150030;东北农业大学动物医学学院,哈尔滨150030;东北农业大学动物医学学院,哈尔滨150030;东北农业大学动物医学学院,哈尔滨150030;东北农业大学动物科学与技术学院,哈尔滨150030【正文语种】中文【中图分类】S942.2;Q74传染性造血组织坏死病病毒(Infectious hematopoietic necrosis virus，IHNV)是传染性造血组织坏死病(Infectious hematopoietic necrosis，IHN)的致病病原，主要感染鲑鳟鱼类，常造成鱼苗或幼鱼70%～90%的死亡率，在某些病例中甚至接近100%，对世界鲑鳟鱼的水产养殖业造成了巨大的经济损失[1]。
新型冠状病毒(sars-cov-2)核衣壳蛋白(n蛋白)的表达研究
武汉职业技术学院学报二二年第十九卷第二期︵总第一百零六期︶收稿日期：2020-04-13基金项目：湖北省自然科学基金“新型杀线虫微生物———粪产碱菌毒杀根结线虫活性蛋白质的挖掘及基因克隆”(项目编号:2018CFB529);湖北省高等学校优秀中青年科技创新团队计划项目“有机废弃物生物处理与资源化利用技术”(项目编号:T201535);武汉职业技术学院博士科研基金项目“食品中青霉素类抗生素残留快速检测试剂盒的研制”(项目编号:2016BS005)。
作者简介：鞠守勇(1981-),男,山东泰安人,博士,武汉职业技术学院生物工程学院副教授,研究方向:基因工程。
新型冠状病毒(SARS-CoV-2)核衣壳蛋白(N 蛋白)的表达研究鞠守勇(武汉职业技术学院生物工程学院，湖北武汉430074)摘要：截止2020年4月12日，全球感染新型冠状病毒人数已经达到170多万人，累计死亡人数达到10万多人。
新型冠状病毒（SARS-CoV-2）核衣壳蛋白(N 蛋白)是SARS-CoV-2IgM/IgG 抗体快速检测试剂卡的核心原材料。
文章优化了大肠杆菌中大量表达SARS-CoV-2N 蛋白的方法，为SARS-CoV-2N 蛋白的大规模生产奠定了基础，将为SARS-CoV-2抗体快速检测试剂的生产降低成本。
关键词：新型冠状病毒；N 蛋白；抗体快速检测技术中图分类号：R446文献标识码：A 文章编号：1671-931X （2020）02-0104-04新型冠状病毒(SARS-CoV-2)为一种新发现的冠状病毒,截至2020年4月12日,全球已经211个国家爆发新型冠状病毒疫情,感染人数已经达到170多万人,累计死亡人数达到10万多人[1]。
2020年2月11日,国际病毒分类委员会(ICTV)将新型冠状病毒正式命名为严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2),世界卫生组织(WHO)将这一病毒导致的疾病正式命名为COVID-19[2]。
14651417_传染性法氏囊病病毒超强毒株衣壳蛋白的可溶性表达、纯化与活性分析
P2/.B/,TRK3,::928V.39<960192808>+619@914+80/4:9:2<F0K:9>V321,982< Q,34Q93./,81W8<,6192.:N.3:0/M9:,0:,Q93.:
Q5DM$?-7%SKOB$%RO54QS$!ZL#B%S_RL>-%P54Q a#-7!Y$?-7%Q5DS$% P_ ;$?-!=$?-%Q5D aB!6#-7%SK_ 9L?-7!+B-%P54Q M$?#!A>$%0" GKM$?#!6>%"
#! 材 料 与 方 法
#G#! 毒 株 菌 株 载 体 KNEc QV为KNEc 超强毒株!由中国农 业科学
院哈尔滨兽医研究所禽免疫抑制病团队分离鉴定并 保存 ( ,%8- 大肠杆 菌 EO81 感 受 态 细 胞 购 自 天 根 生
化科技"北 京 #有 限 公 司&表 达 型 工 程 菌 ;C?-@>==? "EF*#购自北京全式金生化科技 有限 公司( 真核 表 达质粒<9QV5O3;"将KNEc QV株的基因组 5 节 段克隆入质粒 <95QQ@中#由中国农业科学院哈尔 滨兽医研究所禽免疫抑制病团队构建 ( ,2- 原核 表 达
杆状病毒表面展示丙型肝炎病毒结构蛋白及其对丙型肝炎病毒的检测
杆状病毒表面展示丙型肝炎病毒结构蛋白及其对丙型肝炎病毒的检测李祥;金爱慧;邹立林;高基民;吕建新【摘要】目的:利用杆状病毒表面展示系统对丙型肝炎病毒(HCV)进行早期检测.方法:利用杆状病毒表面展示(baculovirus surface display) 技术,构建展示HCV结构蛋白的重组杆状病毒vAc-Flag-HCV C-GP64、vAc-Flag-HCV E-GP64和vAc-Flag-CE-GP64.结果:(1)Western blotting 分析结果表明重组杆状病毒表达了C(HCV核心蛋白)、E(HCV包膜蛋白)和CE蛋白.(2)激光共聚焦显微镜检测结果表明,重组杆状病毒感染昆虫细胞Sf9后在昆虫细胞膜上表达了C、E和CE蛋白.(3)免疫金电子显微镜观察表明重组蛋白展示在杆状病毒囊膜上.(4)重组病毒进行浓缩纯化后,利用时间分辨荧光免疫分析(TRFIA)技术对HCV样本进行检测,vAc-Flag-CE-GP64的检测阳性率可达80.2%.结论:vAc-Flag-CE-GP64可用于对HCV进行早期检测.%AIM; To detect the hepatitis C virus ( HCV) at early stages by the technique of baculovirus surface display. METHODS: We constructed the recombinant baculoviruses vAc - Flag - HCV C - GP64, vAc - Flag - HCV E -GP64 and vAc - Flag - CE - GP64, which displayed HCV - related structural proteins by the technique of baculovirus sur-face display. RESULTS: Western blotting results showed that the core (C) , envelope (E) and core - envelope (CE) proteins of HCV were expressed in Sf9 cells after the infection of recombinant baculoviruses. We also observed by confocal microscopy that the C, E and CE proteins of HCV presented and were anchored on the plasma membrane of Sf9 cells after infection. In addition, the results of immunogold electron microscopy demonstrated that the 3recombinant baculoviruses displayed the C, E and CE proteins of HCV on the viral surface, respectively. To further define the role of these recombi-nant baculoviruses in detecting HCV at early stages, we applied time - resolved fluoroimmunoassay ( TRFIA) to detect HCV samples after purification and concentration of the recombinant baculoviruses. The results showed that the positive rate of vAc - Flag - CE - GP64 was up to 80. 2% . CONCLUSION: vAc - Flag - CE - GP64 is useful for detecting the hepati-tis C virus at early stages.【期刊名称】《中国病理生理杂志》【年(卷),期】2012(028)010【总页数】7页(P1910-1916)【关键词】肝炎病毒,丙型;杆状病毒表面展示;时间分辨荧光免疫分析【作者】李祥;金爱慧;邹立林;高基民;吕建新【作者单位】温州医学院浙江省医学遗传学重点实验室,浙江省模式生物技术与应用重点实验室,浙江,温州,325035;温州医学院浙江省医学遗传学重点实验室,浙江省模式生物技术与应用重点实验室,浙江,温州,325035;温州医学院浙江省医学遗传学重点实验室,浙江省模式生物技术与应用重点实验室,浙江,温州,325035;温州医学院浙江省医学遗传学重点实验室,浙江省模式生物技术与应用重点实验室,浙江,温州,325035;温州医学院浙江省医学遗传学重点实验室,浙江省模式生物技术与应用重点实验室,浙江,温州,325035【正文语种】中文【中图分类】R446.5丙型肝炎是一种主要经血液传播的疾病，丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)慢性感染可导致肝脏慢性炎症性坏死和纤维化，部分患者可发展为肝硬化甚至肝细胞癌(hepatic celluler cancar，HCC)。
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3期
谢三磊等: NV 核衣壳蛋白在杆状病毒表达系统中的表达及鉴定
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IHNV 从最初只流行于北美洲和欧洲 的急剧增加， 1968 年随鱼卵从阿拉斯加传入日本北海 一些国家，
［2 ］ ［3 ］ 道 。最近 IHNV 已 经 在 我 国 局 部 地 区 流 行 。 IHNV 病毒的基因组结构主要是由 3' 端非翻译前导
［8 － 9 ］ ［7 ］
菌株、 载体及细胞 pGMT 载体、 大肠杆菌 （ E． coli ） Top10 、 质粒抽 提试 剂 盒 购 自 北 京 天 根 生 物 技 术 有 限 公 司 ；
DH10Bac 感受 态、 CHSE （ 大 鳞 大 马 哈 鱼 胚 胎 细 胞 pFBLICBse 杆状病毒载体及 Sf9 昆虫细胞均 系） 、 由畜禽疫病防控技术北京市重点实验室提供 。 1． 2 主要试剂 199 / EBSS 培养基购自 Hyclone 公司； 胎牛血清 one step ＲNA PCＲ 购自 Gibco 公 司； PCＲ 试 剂 盒、 KIT（ AMV） 和 T4 DNA 连接酶购自 TaKaＲa 公司； 脂 SF900 II 培养 质体转染试剂 Celfectin Ⅱ Ｒeagent、 基购于 Invitrogen 公司； ＲNA 提取试剂盒购自 Sigma His 单克隆抗体为 BD 公司产 公司； HＲP 标记 anti品； ECL 显色液购自 Thermo 公司。 1． 3 引物设计 根 据 GenBank 中 登 录 的 IHNV 基 因 序 列 （ L40883 ） ， N 用软件 Primer 5． 0 设计特异性 IHNV-
器官坏死病的高效、 新型的诊断试剂奠定物质基础。
1
1． 1
材料和方法
（ Leader） 区﹑基因区﹑基因间连接区及 5' 端非转录 LeaderNM1拖尾（ Trailer ） 区组成， 排列方式为 3'M2GNVLTrailer5'［4］。核衣壳蛋白 （ N ） 呈单链螺 旋状结构， 直径约为 16 nm， 周长约为 7． 5 nm， 大小 为 42 ～ 50 kDa。它是弹状病毒 5 个结构蛋白中较为 保守 的 一 个 蛋 白， 也 是 核 糖 核 蛋 白 复 合 体 （ Ｒibonudeoprotein complex ， ＲNP ） 的 一 个 重 要 组 成 部 ［5 ］ ［6 ］ 分 。Thomas 等 在电镜下观察到蛋白中间区域 是和基因组 ＲNA 结合在一起的。 Said 等 研究表 明， 核衣壳蛋白和基因组 ＲNA 紧密结合形成一个螺 旋对称的结构作为 ＲNA 合成的模板， 其主要功能 是： 参与核衣壳的组装； 与基因组 ＲNA 一起作为转 录的模板保护 ＲNA 免受核酸酶的降解； 对转录和复 制有调节作用
［1 ］ nm， 有囊膜 。随着水生动物及其产品进出口贸易
收稿日期： 2014 － 03 － 19 基金项目： 北京市农林科学院科技创新基金（ CXJJ201316 ） 作者简介： 谢三磊（ 1987 － ） ， 男， 河南鄢陵人， 在读硕士， 主要从事病原微生物分子生物学与免疫学研究。 通讯作者： 孙惠玲（ 1971 － ） ， 女， 甘肃武威人， 副研究员， 博士， 主要从事动物传染病防控研究。
Expression and Identification of Nucleocapsid Protein of IHNV in Baculovirus Expression System
2 XIE Sanlei1， ， WANG Wenhui1 ， SUN Huiling2
（ 1． College of Veterinary Medicine， Gansu Agricultural University， Lanzhou 730070， China； 2． Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine， Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences， Beijing 100097， China） Abstract： To study the major structural nucleoprotein （ N ） of infectious hematopoietic necrosis virus （ IHNV ） by baculovirus systems， in this study nucleoprotein （ N） gene（ 1 176 bp） was amplified by ＲTPCＲ from infectious hematopoietic necrosis virus （ IHNV） and inserted into the baculovirus vector pFBLICBse to construct a recombinant plasmid pFBLICBseN． The constructed recombinant transposition plasmid pFBLICBseN was transformed to competent E． coli DH10Bac to get recombinant bacmids rBacmidN． The obtained recombinant bacmid rBacmidN was transfected to insect Sf9 cells， and the recombinant baculovirus that contained N gene was obtained． IFA and Western Blot analysis showed that the recombinant N protein can be recognized by horseradish peroxidase （ HＲP ） labeled histidine monoclonal antibody （ antiHis） which indicated IHNV N gene has been successfully expressed in Sf9 cells infected with recombinant baculovirus． The study laid a foundation of further study on N protein structure ， function and immunological characteristics． Key words： Infectious hematopoietic necrosis virus； N gene； Ｒecombinant baculovirus 传染性造血器官坏死病（ Infectious haematopoietic necrosis， IHN ） 是鲑、 鳟鱼类的一种以造血组织 严重坏死、 显著贫血、 肝、 脾、 肾褪色为主要特征的传 染性疾病。不同种类鲑、 鳟鱼类对病原的易感性不 同。病原为传染性造血器官坏死病病毒 （ Infectious haematopoietic necrosis virus， IHNV ） ， 属弹状病毒科 （ Novirhabdovirus ） ， 的粒弹状病毒属 同属的水生动 物病毒还有病毒性出血性败血症病毒 （ Viral haemorrhagic septicaemia ， VHSV ） 、 牙鲆弹状病毒 （ Hirame rhabdovirus， HＲV） 和鳢弹状病毒 （ Snakehead Ｒhabdovirus， SＲV） 。IHNV 是该属的代表种， IHNV 的代 1392 ） 。病毒粒 表株是 WＲAC 株（ ATCC 编码为 VＲ子形态为弹状， 直径约 80 ～ 90 nm， 长度为 160 ～ 180
2 9 ( 3 ) : 3 6 -4 0 华 北 农 学 报 ·2 0 1 4 ，
IHNV 核衣壳蛋Leabharlann 在杆状病毒表达系统中 的表达及鉴定
1， 2 1 2 谢三磊 ， 王雯慧 ， 孙惠玲 （ 1． 甘肃农业大学 动物医学院， 甘肃 兰州 730070； 2． 北京市农林科学院 畜牧兽医研究所， 畜禽疫病防控技术北京市重点实验室， 北京 100097）
引物序列 引物序列（ 5' － 3' ） Primer sequence F 5'GATGACAAGCGCACTCAGAGA3' Ｒ 5'GTGGAATGAGTCGGAGTCTCC3' 5'TATTCATACCGTCCCACCA3' 5'GGGAGGTTTTTTAAAGCAAGTAAA3' F 5'TACTTCCAATCCATG GCCACCATGG GATGACAAGCGCACTCAGAGA3' Ｒ 5'TATCCACCTTTACTGGTGGAATGAGTCGGAGTCTCC3' F 5'CCCAGTCACGACGTTGTAAAACG3' Ｒ 5'AGCGGATAACAATTTCACACAGG3'
。 因此， 核衣壳蛋白是传染性造
血器官坏死病病毒的重要结构蛋白， 对其进行深入 的研究十分必要。 本试验以北京市某渔场病鱼组织内分离得到的 传染性造血器官坏死病病毒 BJLL 株为试验材料， LICBse 载体在 Sf9 昆虫细胞中表达重组 利用 pFBLICBse 载体在启动子下游带 核衣壳蛋白。此 pFBHis 鼠单克隆抗体进行 有 6 × His 标签， 便于用 anti验证。试验的开展为进一步研究传染性造血器官坏 死病病毒核衣壳蛋白的免疫功能， 研制传染性造血
PCＲ 方法从传染性造血器官坏死病病毒（ IHNV） 中扩增 ＲNA 获得 1 176 bp 的核衣壳蛋白（ N ） 基 摘要： 采用 ＲTLICBse 杆状病毒载体中， LICBseN， 因， 将其插入于 pFB构建了重组质粒 pFB转化至感受态细胞 DH10Bac 中， 获得 N。再将其转染至 Sf9 昆虫细胞， 重组杆粒 rBacmid获得重组杆状病毒。IFA 和 Western Blot 分析表明， 重组 N 蛋白可 His ） 识别， IHNV N 基因在昆虫细胞 Sf9 中获得了正确表 以被辣根过氧化物酶（ HＲP） 标记的组氨酸单抗（ anti表明， 达。为深入研究 N 蛋白的功能和免疫学特性奠定了基础 。 关键词： 传染性造血器官坏死病病毒； 核衣壳蛋白基因； 重组杆状病毒 中图分类号： S432． 4 文献标识码： A 文章编号： 1000 － 7091 （ 2014 ） 03 － 0036 － 05