IHNV核衣壳蛋白在杆状病毒表达系统中的表达及鉴定

引物序列 引物序列（ 5' － 3' ） Primer sequence F 5'GATGACAAGCGCACTCAGAGA3' Ｒ 5'GTGGAATGAGTCGGAGTCTCC3' 5'TATTCATACCGTCCCACCA3' 5'GGGAGGTTTTTTAAAGCAAGTAAA3' F 5'TACTTCCAATCCATG GCCACCATGG GATGACAAGCGCACTCAGAGA3' Ｒ 5'TATCCACCTTTACTGGTGGAATGAGTCGGAGTCTCC3' F 5'CCCAGTCACGACGTTGTAAAACG3' Ｒ 5'AGCGGATAACAATTTCACACAGG3'
2 9 ( 3 ) : 3 6 -4 0 华 北 农 学 报 ·2 0 1 4 ，
IHNV 核衣壳蛋白在杆状病毒表达系统中 的表达及鉴定
1， 2 1 2 谢三磊 ， 王雯慧 ， 孙惠玲 （ 1． 甘肃农业大学 动物医学院， 甘肃 兰州 730070； 2． 北京市农林科学院 畜牧兽医研究所， 畜禽疫病防控技术北京市重点实验室， 北京 100097）
表1 Tab． 1 引物名称 Primer name IHNVN pFBsequp / low 产物长度 / bp Product length 1 176 ～ 1 200 目的 Purpose 扩增目的基因 N 鉴定重组杆粒 rBacmidN LICBseN 构建 pFB重组质粒 鉴定重组 BAC
［8 － 9 ］ ［7 ］
菌株、 载体及细胞 pGMT 载体、 大肠杆菌 （ E． coli ） Top10 、 质粒抽 提试 剂 盒 购 自 北 京 天 根 生 物 技 术 有 限 公 司 ；
DH10Bac 感受 态、 CHSE （ 大 鳞 大 马 哈 鱼 胚 胎 细 胞 pFBLICBse 杆状病毒载体及 Sf9 昆虫细胞均 系） 、 由畜禽疫病防控技术北京市重点实验室提供 。 1． 2 主要试剂 199 / EBSS 培养基购自 Hyclone 公司； 胎牛血清 one step ＲNA PCＲ 购自 Gibco 公 司； PCＲ 试 剂 盒、 KIT（ AMV） 和 T4 DNA 连接酶购自 TaKaＲa 公司； 脂 SF900 II 培养 质体转染试剂 Celfectin Ⅱ Ｒeagent、 基购于 Invitrogen 公司； ＲNA 提取试剂盒购自 Sigma His 单克隆抗体为 BD 公司产 公司； HＲP 标记 anti品； ECL 显色液购自 Thermo 公司。 1． 3 引物设计 根 据 GenBank 中 登 录 的 IHNV 基 因 序 列 （ L40883 ） ， N 用软件 Primer 5． 0 设计特异性 IHNV-
器官坏死病的高效、 新型的诊断试剂奠定物质基础。
1
1． 1
材料和方法
（ Leader） 区﹑基因区﹑基因间连接区及 5' 端非转录 LeaderNM1拖尾（ Trailer ） 区组成， 排列方式为 3'M2GNVLTrailer5'［4］。核衣壳蛋白 （ N ） 呈单链螺 旋状结构， 直径约为 16 nm， 周长约为 7． 5 nm， 大小 为 42 ～ 50 kDa。它是弹状病毒 5 个结构蛋白中较为 保守 的 一 个 蛋 白， 也 是 核 糖 核 蛋 白 复 合 体 （ Ｒibonudeoprotein complex ， ＲNP ） 的 一 个 重 要 组 成 部 ［5 ］ ［6 ］ 分 。Thomas 等 在电镜下观察到蛋白中间区域 是和基因组 ＲNA 结合在一起的。 Said 等 研究表 明， 核衣壳蛋白和基因组 ＲNA 紧密结合形成一个螺 旋对称的结构作为 ＲNA 合成的模板， 其主要功能 是： 参与核衣壳的组装； 与基因组 ＲNA 一起作为转 录的模板保护 ＲNA 免受核酸酶的降解； 对转录和复 制有调节作用
LICBse 载体质粒的 LIC 克 上下游引物， 结合 pFB隆位点， 选取 N 基因表达的全部区域， 添加起始和 终止密码子， 并在上游引物中添加 Kozak 序列以利 IHNVN 引物对； 鉴定重组病 于基因表达， 设计 pFB毒通用引物为 M13 / pUC 。 引物均由上海生工生物 工程技术服务有限公司合成。引物序列见表 1 。
。 因此， 核衣壳蛋白是传染性造
血器官坏死病病毒的重要结构蛋白， 对其进行深入 的研究十分必要。 本试验以北京市某渔场病鱼组织内分离得到的 传染性造血器官坏死病病毒 BJLL 株为试验材料， LICBse 载体在 Sf9 昆虫细胞中表达重组 利用 pFBLICBse 载体在启动子下游带 核衣壳蛋白。此 pFBHis 鼠单克隆抗体进行 有 6 × His 标签， 便于用 anti验证。试验的开展为进一步研究传染性造血器官坏 死病病毒核衣壳蛋白的免疫功能， 研制传染性造血
3期
谢三磊等: NV 核衣壳蛋白在杆状病毒表达系统中的表达及鉴定
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IHNV 从最初只流行于北美洲和欧洲 的急剧增加， 1968 年随鱼卵从阿拉斯加传入日本北海 一些国家，
［2 ］ ［3 ］ 道 。最近 IHNV 已 经 在 我 国 局 部 地 区 流 行 。 IHNV 病毒的基因组结构主要是由 3' 端非翻译前导
PCＲ 方法从传染性造血器官坏死病病毒（ IHNV） 中扩增 ＲNA 获得 1 176 bp 的核衣壳蛋白（ N ） 基 摘要： 采用 ＲTLICBse 杆状病毒载体中， LICBseN， 因， 将其插入于 pFB构建了重组质粒 pFB转化至感受态细胞 DH10Bac 中， 获得 N。再将其转染至 Sf9 昆虫细胞， 重组杆粒 rBacmid获得重组杆状病毒。IFA 和 Western Blot 分析表明， 重组 N 蛋白可 His ） 识别， IHNV N 基因在昆虫细胞 Sf9 中获得了正确表 以被辣根过氧化物酶（ HＲP） 标记的组氨酸单抗（ anti表明， 达。为深入研究 N 蛋白的功能和免疫学特性奠定了基础 。 关键词： 传染性造血器官坏死病病毒； 核衣壳蛋白基因； 重组杆状病毒 中图分类号： S432． 4 文献标识码： A 文章编号： 1000 － 7091 （ 2014 ） 03 － 0036 － 05
［1 ］ nm， 有囊膜 。随着水生动物及其产品进出口贸易
收稿日期： 2014 － 03 － 19 基金项目： 北京市农林科学院科技创新基金（ CXJJ201316 ） 作者简介： 谢三磊（ 1987 － ） ， 男， 河南鄢陵人， 在读硕士， 主要从事病原微生物分子生物学与免疫学研究。 通讯作者： 孙惠玲（ 1971 － ） ， 女， 甘肃武威人， 副研究员， 博士， 主要从事动物传染病防控研究。
The sequence of primers
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
pFBIHNVN
1 220
M13 / pUC
3 200
注： 右框中序列为 Kozak 序列； 下划线标记序列为载体提供的 LIC 克隆同源序列。 Note： The sequence in the squar frame is Kozak sequence； Underlined sequence is LIC cloning homologous sequences provided by pFBLICBse carrier．
Expression and Identification of Nucleocapsid Protein of IHNV in Baculovirus Expression System
2 XIE Sanlei1， ， WANG Wenhui1 ， SUN Huiling2
（ 1． College of Veterinary Medicine， Gansu Agricultural University， Lanzhou 730070， China； 2． Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine， Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences， Beijing 100097， China） Abstract： To study the major structural nucleoprotein （ N ） of infectious hematopoietic necrosis virus （ IHNV ） by baculovirus systems， in this study nucleoprotein （ N） gene（ 1 176 bp） was amplified by ＲTPCＲ from infectious hematopoietic necrosis virus （ IHNV） and inserted into the baculovirus vector pFBLICBse to construct a recombinant plasmid pFBLICBseN． The constructed recombinant transposition plasmid pFBLICBseN was transformed to competent E． coli DH10Bac to get recombinant bacmids rBacmidN． The obtained recombinant bacmid rBacmidN was transfected to insect Sf9 cells， and the recombinant baculovirus that contained N gene was obtained． IFA and Western Blot analysis showed that the recombinant N protein can be recognized by horseradish peroxidase （ HＲP ） labeled histidine monoclonal antibody （ antiHis） which indicated IHNV N gene has been successfully expressed in Sf9 cells infected with recombinant baculovirus． The study laid a foundation of further study on N protein structure ， function and immunological characteristics． Key words： Infectious hematopoietic necrosis virus； N gene； Ｒecombinant baculovirus 传染性造血器官坏死病（ Infectious haematopoietic necrosis， IHN ） 是鲑、 鳟鱼类的一种以造血组织 严重坏死、 显著贫血、 肝、 脾、 肾褪色为主要特征的传 染性疾病。不同种类鲑、 鳟鱼类对病原的易感性不 同。病原为传染性造血器官坏死病病毒 （ Infectious haematopoietic necrosis virus， IHNV ） ， 属弹状病毒科 （ Novirhabdovirus ） ， 的粒弹状病毒属 同属的水生动 物病毒还有病毒性出血性败血症病毒 （ Viral haemorrhagic septicaemia ， VHSV ） 、 牙鲆弹状病毒 （ Hirame rhabdovirus， HＲV） 和鳢弹状病毒 （ Snakehead Ｒhabdovirus， SＲV） 。IHNV 是该属的代表种， IHNV 的代 1392 ） 。病毒粒 表株是 WＲAC 株（ ATCC 编码为 VＲ子形态为弹状， 直径约 80 ～ 90 nm， 长度为 160 ～ 180